检索结果-内蒙古大学图书馆

刚地弓形虫三种线粒体Mg2+/Mn2+依赖性蛋白磷酸酶（PPMs）存在功能冗余（英文）

Journal of Zhejiang University-Science B(Biomedicine & Biotechnology) 2025年第4期 405-417页

作者：盛楷茵陈学秋阳毅敏夏洁宋凯悦 Chaoqun YAO 杨怡杜爱芳马光旭浙江大学动物科学学院动物预防医学研究所浙江大学-新昌联合创新中心(天姥实验室) 罗斯大学兽医学院生物医学部人畜共患病和热带传染病卫生中心

弓形虫（Toxoplasmagondii）是一种专性胞内寄生的顶复门原虫，可以感染包括人在内的几乎所有温血动物，引起全球性的人畜共患弓形虫病，从而危害人类健康和畜牧业发展，并造成经济损失。刚地弓形虫独特的线粒体是弓形虫病防控的理想靶... 详细信息

弓形虫（Toxoplasmagondii）是一种专性胞内寄生的顶复门原虫，可以感染包括人在内的几乎所有温血动物，引起全球性的人畜共患弓形虫病，从而危害人类健康和畜牧业发展，并造成经济损失。刚地弓形虫独特的线粒体是弓形虫病防控的理想靶细胞器。线粒体中的Mg2+/Mn2+依赖性蛋白磷酸酶（PPMs）在细胞生长、能量代谢和环境应激中发挥着重要的作用。然而，人们对弓形虫的线粒体PPMs知之甚少。在本研究中，我们鉴定出三种PPMs，即Tg PPM8(TGGT1＿218590)、Tg PPM10(TGGT1＿254410)和Tg PPM19(TGGT1＿275840)，均定位于弓形虫速殖子的线粒体基质中。这三个PPMs中任一PPM编码基因的缺失（Δppm8、Δppm10或Δppm19）均会导致弓形虫速殖子生长抑制与增殖能力减弱，以及另外两个PPMs编码基因信使RNA(m RNA)水平的升高，但不影响弓形虫速殖子在小鼠体内的毒力。Δppm8Δppm10或Δppm8Δppm19双重缺失可显著导致弓形虫速殖子体外生长抑制与增殖减缓。由于潜在的突变致死效应，本研究未获得Δppm10Δppm19和Δppm8Δppm10Δppm19缺失虫株。上述结果表明，弓形虫线粒体PPMs间存在功能冗余，是弓形虫线粒体生物学研究的新发现，为具有重要兽医和医学意义的弓形虫的防控靶点的发掘提供了新思路。

关键词：刚地弓形虫线粒体 Mg2+/Mn2+依赖性蛋白磷酸酶(PPMs) 功能冗余增殖

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弓形虫tRNA硫化修饰酶TgMnmA基因缺失虫株的免疫保护性研究

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中国兽医学报 2025年第4期 724-730页

作者：史悦阳毅敏陈学秋夏洁赵明秀姚晨倩杜爱芳浙江大学海南研究院浙江大学动物科学学院浙江省动物预防医学重点实验室/浙江大学动物预防医学研究所

为了评估弓形虫tR NA硫化修饰酶TgMnmA基因缺失虫株对ICR小鼠的免疫原性和免疫保护效果,本研究构建了RHΔMnmA免疫的小鼠模型,通过腹腔注射10个RHΔMnmA速殖子对小鼠进行免疫,30 d后利用间接ELISA技术检测免疫后小鼠的特异性IgG抗体及... 详细信息

为了评估弓形虫tR NA硫化修饰酶TgMnmA基因缺失虫株对ICR小鼠的免疫原性和免疫保护效果,本研究构建了RHΔMnmA免疫的小鼠模型,通过腹腔注射10个RHΔMnmA速殖子对小鼠进行免疫,30 d后利用间接ELISA技术检测免疫后小鼠的特异性IgG抗体及其亚型,制备脾淋巴细胞悬液,利用流式细胞术分析脾淋巴细胞亚群,并通过实时荧光定量PCR技术检测各细胞因子mRNA的相对表达水平;对免疫30 d后的小鼠腹腔接种RHΔku80速殖子,5 d后检测小鼠腹水、心脏、肝脏和脑的荷虫量,观察并记录小鼠感染后30 d内的存活情况。结果表明,与对照PBS组相比,RHΔMnmA免疫组产生了更高的IgG和IgG2a抗体水平,细胞因子IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12和IFN-γ的mRNA相对表达水平都有不同程度的上升,小鼠脾淋巴细胞CD4+和CD8a+的数量也显著增加;同时,对于RHΔku80虫株的攻击,免疫组能够有效降低小鼠腹水和部分脏器的荷虫量,抑制虫体的体内繁殖,并显著提高小鼠的生存率。本研究结果显示,弓形虫TgMnmA基因缺失虫株能够诱导小鼠产生较强的体液和细胞免疫应答,并且针对RHΔku80虫株的感染提供良好的免疫保护,有成为候选抗弓形虫减毒活疫苗的潜力。

关键词：弓形虫疫苗硫化修饰酶 TgMnmA 免疫保护

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绵羊成纤维细胞OAR-L1高效转染方法的探索

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浙江大学学报（农业与生命科学版） 2022年第1期48卷 96-105页

作者：吴飞吴杰陈学秋周静茹张惠黄艳时恒枝杨怡马光旭杜爱芳浙江大学动物科学学院动物预防医学研究所杭州310058

为了在绵羊肺成纤维细胞OAR-L1中高效表达外源蛋白,探索适合该细胞的转染方法,本研究比较了聚乙烯亚胺(polyethyleneimine,PEI)、脂质体2000转染试剂(Lipofectamine^(TM) 2000 transfection reagent,Lipo 2000)、成纤维细胞转染试剂盒(Cytofect^(TM) fibroblast transfection kit,CF2)以及慢病毒介导的细胞转染方法在OAR-L1细胞中表达外源蛋白的效果。结果显示:以pLentiCMV-EGFP-Puro或pLentiCMV-mCherry-Puro荧光质粒转染OAR-L1细胞时,细胞密度和转染试剂用量均可影响PEI、Lipo 2000和CF2介导的细胞转染效率,且三者最佳转染效率均不超过30%,而慢病毒介导的细胞侵染不受细胞密度和病毒液用量的限制,获得的荧光细胞数目也显著高于前三者。包装好的病毒液可以在4或-80℃条件下至少保存15 d而侵染效果不受影响。在OAR-L1细胞中共表达2种外源蛋白时,包装获得的2种慢病毒液等比例混合后再侵染的方式能获得更高的共转率。综上所述,慢病毒侵染是一种能够实现在OAR-L1细胞中高效表达外源蛋白的细胞转染方式,本研究结果为其他难转染细胞系转染方式的选择提供了一定的参考。

关键词：成纤维细胞OAR-L1 转染方法慢病毒绵羊

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捻转血矛线虫锌金属蛋白酶NAS-31的表达特性及功能初步研究

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浙江大学学报（农业与生命科学版） 2021年第6期47卷 805-814页

作者：黄艳张惠童丹妮周静茹吴飞陈学秋杨怡马光旭杜爱芳浙江大学动物科学学院动物预防医学研究所杭州310058

捻转血矛线虫病由捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)寄生于反刍动物皱胃之中引起。为探究捻转血矛线虫锌金属蛋白酶NAS-31基因(Hc-nas-31)在虫体自由生活时期(特别是3期幼虫)中发挥的功能,本研究通过实时荧光定量聚合酶链反应(real-ti... 详细信息

捻转血矛线虫病由捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)寄生于反刍动物皱胃之中引起。为探究捻转血矛线虫锌金属蛋白酶NAS-31基因(Hc-nas-31)在虫体自由生活时期(特别是3期幼虫)中发挥的功能,本研究通过实时荧光定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR)检测目的基因在捻转血矛线虫各发育阶段的转录水平,利用cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends,RACE)、基因步移及融合PCR方法扩增并分析其基因结构;构建原核表达载体后转化至BL21感受态细胞中进行诱导表达;将纯化后的蛋白免疫新西兰大白兔以制备多克隆抗体;通过虫体间接免疫荧光分析Hc-NAS-31在捻转血矛线虫体内的表达特性并预测其功能。结果表明:Hc-nas-31在各时期虫体中均有转录,其中在3期幼虫中的转录水平最高;蛋白质印迹结果显示,制备的抗体能特异性结合Hc-NAS-31天然蛋白;间接免疫荧光分析发现,Hc-NAS-31蛋白主要表达于3期幼虫的上皮细胞合胞体内,在成虫中则分布于肠道、生殖腺(性腺)、肌肉组织及早期虫卵中。本实验明确了NAS-31在捻转血矛线虫中的表达特性,为进一步研究Hc-nas-31的生物学功能奠定了基础。

关键词：捻转血矛线虫捻转血矛线虫锌金属蛋白酶NAS-31基因转录水平表达特性

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斑马鱼胚胎的简易无菌培养体系及单增李斯特菌感染试验

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微生物学报 2016年第11期56卷 1766-1775页

作者：单颖张亦凯程昌勇方春彭金荣方维焕浙江大学动物科学学院浙江大学动物预防医学研究所浙江杭州310058

【目的】斑马鱼的生活环境中微生物众多,会激活其先天免疫系统,从而影响相关试验结果,因此需建立适合于感染与免疫研究的斑马鱼无菌培养体系。【方法】建立了基于受精卵短时消毒和温控正压无菌隔离器的培养流程;根据无菌动物标准对斑马... 详细信息

【目的】斑马鱼的生活环境中微生物众多,会激活其先天免疫系统,从而影响相关试验结果,因此需建立适合于感染与免疫研究的斑马鱼无菌培养体系。【方法】建立了基于受精卵短时消毒和温控正压无菌隔离器的培养流程;根据无菌动物标准对斑马鱼胚胎及其生活环境进行微生物检测;并通过定量PCR检测无菌斑马鱼先天免疫相关基因(TLRs)表达水平;利用无菌斑马鱼胚胎模型进行了单增李斯特菌感染试验。【结果】本研究成功建立了斑马鱼培育的无菌操作系统,无菌检验结果显示其生活环境及体内不含病原微生物,先天免疫分子TLRs表达量较低或不表达,而常规培养斑马鱼以及浸泡感染单增李斯特菌的无菌斑马鱼中这些基因转录水平较高。无菌斑马鱼对单增李斯特菌强毒株EGDe静脉注射感染很敏感,100 CFU感染量能导致鱼在1周内全部死亡,而其mpl或plc B基因缺失株感染后致死率显著下降(分别为70%和40%)。巨噬细胞在亲本株EGDe浸泡感染的鱼肠道周围聚集,而mpl或plc B基因缺失株感染的鱼中几乎观察不到这一聚集现象。【结论】通过简易培养体系获得的无菌斑马鱼胚胎可用于先天免疫和病原感染机制等研究。

关键词：无菌斑马鱼胚胎先天免疫单核细胞增生李斯特菌

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捻转血矛线虫酵母双杂交cDNA文库的构建及鉴定

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浙江大学学报（农业与生命科学版） 2022年第2期48卷 247-253页

作者：张惠黄艳周静茹吴飞童丹妮陈学秋杨怡马光旭杜爱芳浙江大学动物科学学院动物预防医学研究所浙江省动物预防医学重点实验室杭州310058

为构建捻转血矛线虫cDNA文库,进一步研究捻转血矛线虫蛋白互作机制以及为筛选捻转血矛线虫互作蛋白提供依据,本研究以捻转血矛线虫L3期幼虫为材料,利用TriZol法提取捻转血矛线虫总RNA;使用试剂盒构建捻转血矛线虫的cDNA文库,并对cDNA进... 详细信息

为构建捻转血矛线虫cDNA文库,进一步研究捻转血矛线虫蛋白互作机制以及为筛选捻转血矛线虫互作蛋白提供依据,本研究以捻转血矛线虫L3期幼虫为材料,利用TriZol法提取捻转血矛线虫总RNA;使用试剂盒构建捻转血矛线虫的cDNA文库,并对cDNA进行均一化处理,再将纯化后的cDNA与线性化的pGADT7-Rec重组构建的文库质粒转化至Y187酵母中,构建出酵母转录激活结构域(activationdomain,AD)文库。结果表明:本研究构建了重组率为100%,插入片段平均长度为1000 bp,工作液细胞密度大于3.5×10^(7)CFU/mL的捻转血矛线虫均一化酵母AD文库;所构建的表达文库各项指标均达标,符合酵母双杂交筛选要求。本文库为捻转血矛线虫的分子机制研究以及疫苗的开发奠定了基础。

关键词：捻转血矛线虫 cDNA文库酵母双杂交系统蛋白质间相互作用

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微小隐孢子虫黏蛋白CGD5_2060原核表达及其黏附功能

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浙江大学学报（农业与生命科学版） 2018年第2期44卷 230-236页

作者：阳毅敏潘灵韬庄浩瀚孙洪超杨怡陈学秋杜爱芳浙江大学动物科学学院动物预防医学研究所杭州310058

从微小隐孢子虫c DNA中克隆黏蛋白cgd5_2060基因,并对其蛋白功能相关基序进行预测;构建原核表达载体p ET32a-cgd5_2060,转化至大肠埃希菌Rosetta中,诱导表达并纯化重组蛋白CGD5_2060,制备鼠源多克隆抗体,并通过间接酶联免疫吸附测定(enz... 详细信息

从微小隐孢子虫c DNA中克隆黏蛋白cgd5_2060基因,并对其蛋白功能相关基序进行预测;构建原核表达载体p ET32a-cgd5_2060,转化至大肠埃希菌Rosetta中,诱导表达并纯化重组蛋白CGD5_2060,制备鼠源多克隆抗体,并通过间接酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)方法测定其抗体效价;将纯化的重组蛋白CGD5_2060及载体对照蛋白与Caco2细胞共孵育,通过蛋白质印迹法(Western blotting)与间接ELISA方法检测其细胞黏附特性。结果表明,CGD5_2060蛋白的1~19个氨基酸为信号肽,说明该蛋白是分泌型蛋白。使用PROSITE数据库分析发现:该蛋白含有1个富含苏氨酸的区域TTTTTTKSTTTTTTAVTT,位于510~527个氨基酸处;此外,还有1个与细胞黏附有关的序列RGD(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸),位于69~71个氨基酸处。上述结果表明,cgd5_2060基因可能与微小隐孢子虫黏附宿主细胞相关。原核表达的重组蛋白CGD5_2060具有良好的免疫原性,获得了较高效价的多克隆抗体。重组蛋白与Caco2细胞共孵育,通过蛋白质印迹法与间接ELISA方法检测发现,CGD5_2060可以与Caco2细胞黏附。本试验为揭示微小隐孢子虫黏附细胞的机制提供了一定的理论基础。

关键词：微小隐孢子虫黏蛋白基因cgd5_2060 原核表达细胞黏附

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猪流行性腹泻病毒血清学及临床诊断方法研究进展

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浙江大学学报（农业与生命科学版） 2018年第2期44卷 149-156页

作者：雷喜梅杨永乐许姝雅赵鹏伟王斌黄耀伟浙江大学动物科学学院动物预防医学研究所杭州310058

猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)是急性、高度传染性猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea,PED)的致病原,可感染所有日龄的猪,并在哺乳仔猪中引起较高的死亡率。当前使用的疫苗难以对感染仔猪提供有效保护... 详细信息

猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)是急性、高度传染性猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea,PED)的致病原,可感染所有日龄的猪,并在哺乳仔猪中引起较高的死亡率。当前使用的疫苗难以对感染仔猪提供有效保护。因此,研制高效安全的PEDV疫苗是防控PED的关键。同时,建立敏感有效的血清学检测方法对于PEDV感染的临床诊断以及免疫后体液免疫应答水平的监测与评估至关重要。本文对当前主要的PEDV血清学研究结果进行概述,并对感染或免疫后抗体消长规律进行讨论,以期为PEDV的诊断与防控提供参考。

关键词：猪流行性腹泻病毒血清学临床诊断方法疫苗

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基于CRISPR/Cas系统的病原核酸检测技术研究进展

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浙江大学学报(农业与生命科学版) 2023年第5期49卷 618-632页

作者：李红招王浩尹睿乐敏李艳浙江大学海南研究院浙江大学动物科学学院动物预防医学研究所/浙江省动物预防医学重点实验室

作为一种古老的细菌和古菌免疫系统，规律成簇的间隔短回文重复序列及其相关蛋白[clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated protein (Cas), CRISPR/Cas]系统现已发展为新兴的热门基因编辑工具，极大地推动了其他多个生物学相关领域的发展。其中，通过结合CRISPR/Cas系统与核酸恒温扩增技术建立了一些新型的高效、灵敏、不依赖仪器设备的检测方法，如DNA内切酶靶向的CRISPR反式报告系统（DNA endonuclease-targeted CRISPR trans-reporter, DETECTR）、特异性高灵敏度的酶报告器系统（specific high-sensitivity enzymatic reporter unlocking, SHERLOCK）等，不但提高了CRISPR/Cas系统在不同应用场景下的检测性能，更进一步激发了其在现场检测中的应用潜力。本文基于近年来被广泛应用的3种CRISPR/Cas系统（CRISPR/Cas9、CRISPR/Cas12a以及CRISPR/Cas13）的生物核酸检测方法，阐述了CRISPR/Cas系统的生物学意义及一般作用原理，并通过回顾以往开展的CRISPR/Cas系统相关的病原检测研究，比较分析了不同检测系统的特点以及在实际应用过程中可能存在的不足，为针对不同病原在不同应用场景下建立更加高效、合理的CRISPR/Cas系统检测方法提供了有益参考。

关键词： CRISPR/Cas系统 Cas蛋白病原核酸检测方法

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细菌促进肠道病毒感染及其机制研究进展

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浙江大学学报（农业与生命科学版） 2018年第2期44卷 140-148页

作者：徐超杨晓炼乐敏朱书浙江大学动物科学学院动物预防医学研究所杭州310058

近年来随着对肠道菌群研究的不断深入,人们对肠道菌群在人类及动物健康中的重要作用有了更清晰的认识。然而,目前的研究主要集中在营养代谢性疾病、慢性病、自身免疫病等方面,对肠道菌群在传染性疾病,特别是病毒病中的作用关注甚少。直... 详细信息

近年来随着对肠道菌群研究的不断深入,人们对肠道菌群在人类及动物健康中的重要作用有了更清晰的认识。然而,目前的研究主要集中在营养代谢性疾病、慢性病、自身免疫病等方面,对肠道菌群在传染性疾病,特别是病毒病中的作用关注甚少。直到最近,学术界才开始对菌群与肠道病毒之间的相互作用展开系统性研究。随着相关研究的推进,肠道细菌在病毒入侵、病毒致病性及机体抗病毒免疫等方面的作用初现端倪,但其机制并未得到全面揭示。本文对近年来在细菌和肠道病毒互作方面具有高影响力的研究工作,特别是肠道病毒利用细菌促进其体内入侵的相关机制进行了综述。总体而言,细菌促进病毒体内感染的机制分为2类:一类是提高病毒粒子稳定性及促进病毒在宿主靶细胞上的黏附作用,即通过提高病毒感染效率促进感染的直接机制;另一类是改变宿主抗病毒免疫反应的倾向性,即通过抑制宿主免疫反应促进感染的间接机制。对病毒利用肠道细菌促进体内感染的相关机制进行讨论,有助于深入理解病毒的致病机制,揭示病毒与肠道细菌相互作用的普遍规律,解析肠道病毒逃逸宿主黏膜免疫的分子机制,为新型肠道病毒疫苗及相关疫苗佐剂的研发和抗病毒治疗新方法的提出提供全新的视角和科学依据。

关键词：肠道菌群肠道病毒病毒-细菌互作体内感染免疫调节

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