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中华传染病杂志 2010年第12期28卷 733-739页

作者：卓婷婷陈智浙江大学医学院附属第一医院传染病研究所卫生部传染病诊断与治疗重点实验室杭州310003

目的筛选慢性乙型肝炎（CHB）患者外周血单个核细胞（PBMC）中与肝炎重症化相关的免疫分子。方法采用荧光定量PCR技术检测各型CHB患者PBMC中39个免疫分子（包括白细胞分化抗原、趋化因子受体、凋亡相关配体和受体、黏附分子、Toll样受... 详细信息

目的筛选慢性乙型肝炎（CHB）患者外周血单个核细胞（PBMC）中与肝炎重症化相关的免疫分子。方法采用荧光定量PCR技术检测各型CHB患者PBMC中39个免疫分子（包括白细胞分化抗原、趋化因子受体、凋亡相关配体和受体、黏附分子、Toll样受体等）mRNA的相对表达水平。多组间两两比较采用单因素方差分析中的Scheffe法，相关性检验采用Spearman等级相关分析。结果荧光定量结果显示，39个免疫分子中与肝炎严重程度相关的分子共有9个，即肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）、TRAIL受体（TRAIL—R）2、CD64、CD30、CD27、CD28、L-选择素（CD62I。）、细胞间黏附分子-1（ICAM-1）和CXC型趋化因子受体（CXCR）2，与健康对照组相比，这9种免疫分子在CHB重度组的表达量增高倍数分别为3．88、4．37、2．51、2．22、2．97、2．53、4．07、4．29和4．25倍（F=1．96、2．13、1．33、1．16、1．57、2．14、2．03、2．10、2．09，均P〈0．05）。其中TRAIL、TRAILR2、CD64、CD30、CD27的表达量与IFN-7的表达量呈显著正相关（r=0．816、0．572、0．462、0．697、0．793，均P〈0．01）。TRAIL-R2、CD64、CD30、CD62L、1CAM-1表达量与TNF-a的表达量呈显著正相关（r=0．494、0．588、0．568、0．968、0．976，均P〈0．01）。结论TRAIL、TRAILR2、CD64、CD30、CD27、CD28、CD62L、ICAM-1和CXCR2的异常表达与肝脏炎性反应和肝炎重症化相关。

关键词：肝炎乙型慢性聚合酶链反应单核细胞细胞因子类基因表达

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10-23 DNA enzyme对乙型肝炎病毒C基因体外转录产物的切割活性

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浙江大学学报（医学版） 2006年第5期35卷 507-511页

作者：侯伟沃健儿刘克洲李敏伟浙江大学医学院附属第一医院传染病研究所卫生部传染病重点实验室浙江杭州310003

目的:探讨10-23 DNA enzym e对乙型肝炎病毒C基因体外转录产物的特异切割活性。方法:设计并合成3种能针对乙型肝炎病毒C基因开放阅读框A1816UG的特异性脱氧核酶,分别命名为D rzBC-7、D rzBC-8和D rzBC-9。应用体外转录的方法获得相应的... 详细信息

目的:探讨10-23 DNA enzym e对乙型肝炎病毒C基因体外转录产物的特异切割活性。方法:设计并合成3种能针对乙型肝炎病毒C基因开放阅读框A1816UG的特异性脱氧核酶,分别命名为D rzBC-7、D rzBC-8和D rzBC-9。应用体外转录的方法获得相应的底物RNA,观察D rzBC-7、D rzBC-8和D rzBC-9对其的体外切割效应。以D rzBC-9为例,观察不同浓度的M gC l2对体外切割效率的影响,根据L inew eaver Burk作图法,计算相关的酶动力学参数Km、K cat和K cat/Km。结果:通过体外转录获得用于切割反应的底物RNA,其大小为300 nt。在特定的切割条件下,D rzBC-7、D rzBC-8和D rzBC-9均能对相应的底物RNA进行有效的切割,切割产物分别为109 nt和191 n。t以D rzBC-9为例,在切割反应体系中缺乏M gC l2时,未见有切割反应。M gC l2浓度在150 mm ***-1时达到最高切割效率,再提高M gC l2的浓度,切割效率未见明显增大。酶动力学参数Km、K cat和K cat/Km分别为1.4×10-9m ***-1,1.6 m in-1和1.1×109m ***-1.m in-1。结论:针对乙型肝炎病毒C基因的10-23 DNA enzym e在体外对相应的转录产物有特异切割作用。

关键词： DNA催化性 DNA,单es,链肝炎病毒,乙型/遗传学基因组,病毒/遗传学重组,遗传转染

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乙型肝炎病毒大蛋白和DNA在抗病毒治疗中的变化

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中华传染病杂志 2007年第7期25卷 405-407页

作者：陈晓明杨美芳薛寒胡敏君陈离伟范骏沃健儿浙江大学医学院附属第一医院传染病研究所卫生部病毒性传染病重点实验室杭州310003

HBV是嗜肝DNA病毒，其S基因编码3种外膜蛋白，分别是主蛋白、中蛋白和大蛋白。近年研究表明HBV大蛋白（HBV-LP）与病毒侵入、组装和复制等密切相关，Bruss等研究发现，HBV-LP在病毒进入肝细胞时作为受体蛋白起作用，在病毒组装时，则是... 详细信息

HBV是嗜肝DNA病毒，其S基因编码3种外膜蛋白，分别是主蛋白、中蛋白和大蛋白。近年研究表明HBV大蛋白（HBV-LP）与病毒侵入、组装和复制等密切相关，Bruss等研究发现，HBV-LP在病毒进入肝细胞时作为受体蛋白起作用，在病毒组装时，则是基质类似蛋白，同时还行使调节功能。而且这种多功能性依赖于HBV-LP前S区独特的双重拓扑结构。同时研究还表明，HBV-LP对HBV复制过程具有反式激活作用，并与病毒颗粒从细胞内释放调节有关。HBV—LP存在于感染性颗粒（Dane颗粒）和亚病毒管状颗粒上，是病毒形成完整外膜的重要标志，与血清HBVDNA拷贝数具有良好的相关性，能反映患者机体内HBV复制情况。魏红山等研究表明，在HBeAg阴性慢性乙型肝炎患者血清中，

关键词：嗜肝DNA病毒抗病毒治疗外膜蛋白乙型肝炎病毒血清HBV 慢性乙型肝炎患者 HBeAg阴性反式激活作用

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肝移植受者术后巨细胞病毒抗原血症的发生及其影响因素分析

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中华医学杂志 2006年第48期86卷 3442-3444页

作者：范骏陈晓明杨美芳薛寒高海女范维薇马伟杭李兰娟浙江大学医学院附属第一医院传染病研究所卫生部病毒性传染病重点实验室杭州310003

巨细胞病毒(cytomegalvirus,CMV)感染正常人群后通常呈潜伏状态,当机体处于免疫功能受损或受抑制状态时,潜伏的CMV可能被激活.肝移植受体术后免疫系统功能大大低于正常人群,CMV易被激活而导致严重的CMV病[1],并与移植后急慢性排斥反应有... 详细信息

巨细胞病毒(cytomegalvirus,CMV)感染正常人群后通常呈潜伏状态,当机体处于免疫功能受损或受抑制状态时,潜伏的CMV可能被激活.肝移植受体术后免疫系统功能大大低于正常人群,CMV易被激活而导致严重的CMV病[1],并与移植后急慢性排斥反应有关[2].监测移植术后CMV活动性感染的主要方法是测定外周血白细胞中是否出现CMVpp65抗原--即CMV抗原血症[3].借鉴骨髓移植、肾移植经验[4],肝移植受者术后定期、定量检测CMVpp65,并常规给予抗病毒药物预防而控制CMV感染.但仍有不少肝移植受者术后发生CMV感染,是否与某些因素有关?我们回顾性分析2001年至2004年间我院肝移植受者CMV抗原血症的发生情况及多种因素,期望能为临床诊断和抗病毒治疗提供参考。

关键词：巨细胞病毒抗原血症肝移植受者移植术后 CMVpp65 活动性感染免疫功能受损免疫系统功能慢性排斥反应

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质粒介导的RNA干扰对AD293细胞中HBcAg表达的抑制作用

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浙江大学学报（医学版） 2005年第2期34卷 104-109页

作者：徐宁羊正纲朱海红姚航平侯晓丽吴炜浙江大学医学院附属第一医院传染病研究所卫生部病毒性传染病重点实验室浙江杭州310003

目的研究质粒介导的RNA干扰效应对HBcAg基因表达的抑制作用。方法设计并构建针对HBcAg基因的小发夹RNA表达载体,将构建好的shRNA表达载体和HBcAg-增强型绿荧光蛋白融合蛋白表达载体共转染人胚肾细胞株AD293,以空载体组以及针对无关序列... 详细信息

目的研究质粒介导的RNA干扰效应对HBcAg基因表达的抑制作用。方法设计并构建针对HBcAg基因的小发夹RNA表达载体,将构建好的shRNA表达载体和HBcAg-增强型绿荧光蛋白融合蛋白表达载体共转染人胚肾细胞株AD293,以空载体组以及针对无关序列的shRNA表达载体组为阴性对照,流式细胞术和实时荧光定量PCR法检测RNAi的抑制效果。结果构建的特异性shRNA表达载体可以抑制HBcAg基因在AD293细胞中的表达,流式细胞仪检测抑制率可达76%,实时荧光定量PCR法检测HBcAg基因的mRNA,抑制率可达58.6%。结论质粒介导的RNAi可以有效抑制HBcAg基因的表达,为利用RNAi进行抗乙型肝炎病毒复制研究提供了一个可供选择的方法。

关键词：肝炎核心抗原,乙型/分析基因疗法 RNA/遗传学基因表达调控 RNA干扰

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癌周及癌中心不同截短片段丙型肝炎病毒核心蛋白表达质粒的构建及表达

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中华肝脏病杂志 2004年第11期12卷 643-647页

作者：颜学兵陈智 Delphine BOUCREUX Nicole PAVIO Christian BRECHOT 浙江大学医学院附属第一医院传染病研究所卫生部传染病重点实验室 310003 U370/巴斯德研究所联合实验室

目的研究不同截短片段丙型肝炎病毒(HCV)的核心蛋白(CORE)在HCV持续感染和肝癌发病机制中的作用,构建并表达不同HCV病毒株及不同截短片断CORE原核表达质粒。方法用PCR扩增基因型为HCV 1 b型的7个不同截短片段CORE基因:氨基酸(aa)长... 详细信息

目的研究不同截短片段丙型肝炎病毒(HCV)的核心蛋白(CORE)在HCV持续感染和肝癌发病机制中的作用,构建并表达不同HCV病毒株及不同截短片断CORE原核表达质粒。方法用PCR扩增基因型为HCV 1 b型的7个不同截短片段CORE基因:氨基酸(aa)长度分别为癌中心株(BT):B:1-172 aa、1-126 aa、1-58 aa、59-126 aa、127-172 aa;癌旁株(BNT):1-172 aa及C191(HCV-J6):1-172 aa,扩增产物用BamH Ⅰ及EcoR Ⅰ双酶切后将其插入到原核表达质粒pGEX-4T-1中,阳性克隆转染到BL21中,IPTG诱导表达GST-CORE融合蛋白,纯化定量,并用western blot加以验证。结果 7个不同片段CORE在体外都得到相应表达,但表达量存在一定的差异,较长片段表达量相对较低,其中BT及BNT的1-172 aa截短片段CORE的表达高于同基因型等长度片段的C191,而BT以59-126 aa片段的表达量最高。BT、BNT及C191三株HCV基因1b型病毒株部分截短片段可形成二聚体。结论构建不同HCV病毒株及不同截短片段的CORE原核表达质粒获得成功,为研究HCV不同病毒株及不同区域CORE功能奠定基础;不同截短片段的CORE表达量不等,可能与不同片段具有不同的疏水基团、细胞毒性及在HCV结构和在HCV致病性中所起作用不同有关;HCV基因1b型的CORE二聚体的形成依耐于59-126 aa区域。

关键词：病毒核心蛋白表达质粒蛋白表达丙型肝炎病毒肝癌

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人类免疫缺陷病毒感染的静脉吸毒者TT病毒的检测和部分基因序列分析

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中华传染病杂志 2001年第2期19卷 97-99页

作者：朱彪吴南屏刘克洲陈智吴灵娇浙江大学医学院附属第一医院传染病研究所暨卫生部病毒性传染病重点实验室杭州310003

目的　研究人类免疫缺陷病毒 (HIV)感染的静脉吸毒者TT病毒 (TTV)感染情况和基因序列变化。方法　用聚合酶链反应 (PCR)对 35例HIV感染的静脉吸毒者 (IVDUs) ,6 4例HIV未感染的IVDUs及 45例正常献血员进行TTVDNA检测。对其中 2例HIV感染... 详细信息

目的　研究人类免疫缺陷病毒 (HIV)感染的静脉吸毒者TT病毒 (TTV)感染情况和基因序列变化。方法　用聚合酶链反应 (PCR)对 35例HIV感染的静脉吸毒者 (IVDUs) ,6 4例HIV未感染的IVDUs及 45例正常献血员进行TTVDNA检测。对其中 2例HIV感染的IVDUs和 1例HIV未感染的IVDUs的TTVDNA部分基因核苷酸序列进行测定。结果　TTVDNA在HIV感染的IVDUs中检出率为 2 5 .71% (9/ 35 ) ,HIV未感染的IVDUs中检出率为 17.18% (11/ 6 4) ,两者差异无显著性 (P >0 .0 5 ) ,正常献血员中的检出率为 2 .2 % (1/ 45 )。对 2例HIV感染的IVDUsTTVDNA部分基因核苷酸序列与日本株比较 ,其同源性分别为 96 .44 %和 95 .79% ,对 1例HIV未感染的IV DUs的TTVDNA部分基因核苷酸序列与日本株比较其同源性为 98.2 5 % ;HIV感染和HIV未感染的IVDUsTTVDNA核苷酸序列比较 ,HIV感染者在被测定序列的第 2 99～ 30 9位碱基有较大的变异。结论　静脉吸毒是TTV感染的高危因素 ,TTV在IVDUs中感染率与HIV感染无明显相关性 ;HIV感染和HIV未感染者TTVDNA序列可能存在一定差异。

关键词： TT病毒人类免疫缺陷病毒聚合酶链反应核苷酸序列静脉吸毒

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HBV感染对肝移植术后巨细胞病毒感染的影响

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中华微生物学和免疫学杂志 2010年第2期30卷 150-153页

作者：赵宏范骏胡建华高海女杨美芳张旋周琳马伟杭浙江大学医学院附属第一医院传染病研究所传染病诊治国家重点实验室杭州310003 浙江大学附属第一医院卫生部多器官联合移植重点实验室

目的探讨肝移植患者移植术前后HBV感染对移植术后巨细胞病毒（CMV）感染及其肝功能的影响.方法回顾性分析我院近两年来113例肝移植患者临床资料,排除术后1月内死亡、血型不符、失访和并发其他噬肝病毒感染患者,共有102例患者纳入.根... 详细信息

目的探讨肝移植患者移植术前后HBV感染对移植术后巨细胞病毒（CMV）感染及其肝功能的影响.方法回顾性分析我院近两年来113例肝移植患者临床资料,排除术后1月内死亡、血型不符、失访和并发其他噬肝病毒感染患者,共有102例患者纳入.根据肝移植术前是否感染HBV将患者分为HBV感染组和对照组（非HBV感染）;对于感染组患者,又根据移植术后HBV是否复发分为术后复发组和非复发组,采用免疫组化方法检测CMV被膜抗原pp65水平,时间分辨法检测乙肝病毒抗原和抗体水平,常规方法检测肝转氨酶水平.结果 HBV感染组（n=83）和对照组（n=19）中,术后pp65阳性率分别为84.3%（70/83）和57.9%（11/19）（P=0.024）;HBV感染组中,HBV复发组和非复发组中pp65阳性率分别为90.9%（10/11）和83.3%（60/72）（P=0.843）,各组间肝转氨酶水平差异无统计学意义（P〉0.05）.结论肝移植术前HBV感染可以增加术后CMV病毒血症风险,而肝移植后HBV复发并不增加CMV病毒血症风险;同时,与单一HBV或CMV感染而言,两种病毒联合感染并不明显引起肝转氨酶水平的升高.

关键词：乙肝病毒肝移植巨细胞病毒转氨酶

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丙型肝炎病毒核心蛋白结合蛋白激酶R的功能区域研究

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中华传染病杂志 2005年第1期23卷 1-5页

作者：颜学兵陈智 Delphine BOUCREUX Nicole PAVIO Christian BRECHOT 浙江大学医学院附属第一医院传染病研究所卫生部传染病重点实验室法国巴黎第5大学

目的构建并表达丙型肝炎病毒(HCV)不同病毒株:癌中心株(BT)、癌旁珠(BNT)、HCV-J及BT不同截短片段谷胱甘肽(GST)-核心融合蛋白;寻找核心蛋白(Core)与蛋白激酶R(PKR)相互作用区域,探讨它们在HCV持续感染及细胞癌(HCC)发病机制中的作用.... 详细信息

目的构建并表达丙型肝炎病毒(HCV)不同病毒株:癌中心株(BT)、癌旁珠(BNT)、HCV-J及BT不同截短片段谷胱甘肽(GST)-核心融合蛋白;寻找核心蛋白(Core)与蛋白激酶R(PKR)相互作用区域,探讨它们在HCV持续感染及细胞癌(HCC)发病机制中的作用.方法用聚合酶链反应扩增不同片段HCV核心蛋白基因,并将7个不同的基因片段分别克隆到原核表达载体pGEX-4T-1,诱导表达并纯化表达蛋白,与两株细胞(HepG2和Huh-7)的PKR的进行相互作用试验.结果7个不同片段Core在体外都得到相应表达,不同片段结合PKR的能力存在一定差异.BT、BNT、C191的Core N端1～172氨基酸(aa)3个片段均能与PKP发生直接结合,BT与PKR结合的区域在Core N端的1～58aa.结论不同片段Core在原核细胞中获得较好的表达;Core/PKP相互作,在HCV持续感染和HCC的发病机制中可能起重要作用.

关键词： HCV核心蛋白表达丙型肝炎病毒核心蛋白 HCC 发病机制结合蛋白功能区域差异目的结论

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基因1b型HCV核心蛋白不同功能区域对HepG2细胞生长的影响

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中华微生物学和免疫学杂志 2008年第5期28卷 411-415页

作者：颜学兵梅蕾陈智郑敏周林福许小燕吴炜徐州医学院附属第一医院传染科 221002 江苏省常熟市第二人民医院感染病科浙江大学医学院附属第一医院传染病研究所、卫生部传染病重点实验室

目的研究基因1b型丙型肝炎病毒（HCV）不同病毒株编码的核心蛋白（CORE）：癌中心株（T）、癌旁株（NT）、C191（HCV—J6）及同一病毒株（T）编码的不同功能区域（1～172、1～126、1～58、59～126、127—172AA）在HCV致病机制中的作用... 详细信息

目的研究基因1b型丙型肝炎病毒（HCV）不同病毒株编码的核心蛋白（CORE）：癌中心株（T）、癌旁株（NT）、C191（HCV—J6）及同一病毒株（T）编码的不同功能区域（1～172、1～126、1～58、59～126、127—172AA）在HCV致病机制中的作用，为治疗HCV感染提供靶位。方法将含有3个不同病毒株（T、NT及C191）及T不同功能区域的CORE真核表达质粒，转染到HepG2细胞，用流式细胞仪检测Annexin V／PI，并用细胞生长实时观察仪观察细胞生长曲线。结果基因1b型T、NT、C191和T不同功能区域的CORE均能诱导HepG2细胞凋亡和坏死且抑制了细胞的生长，其中，T诱导细胞凋亡和坏死及抑制细胞生长强于NT和C191，T的CORE的N端1～58AA诱导细胞凋亡和坏死及抑制细胞生长均高于其他功能区域。结论HCV基因1b型不同病毒株及同一病毒株编码的CORE不同功能区域的分子致病机制存在一定的差异，N端的1～58AA在CORE的致病机制中起重要作用，可能是基因治疗的重要靶位之一。

关键词：丙型肝炎病毒核心蛋白凋亡/坏死细胞生长曲线

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