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第四届中国植物细菌病害学术研讨会

作者：朱博王国芬谢关林李斌徐福寿周勤浙江大学生物技术研究所水稻生物学国家重点实验室

2006年上半年在浙江杭州地区的桑树上发现一严重的病害,幼龄桑发病初期由枝条上叶片开始呈失水状,继而全株叶片凋萎、枯焦,直至脱落;剥开主干皮层,可见木质部褐色条状斑;病株根部外观正常,但木质部严重变褐。桑农在夏伐整枝后出现大批... 详细信息

2006年上半年在浙江杭州地区的桑树上发现一严重的病害,幼龄桑发病初期由枝条上叶片开始呈失水状,继而全株叶片凋萎、枯焦,直至脱落;剥开主干皮层,可见木质部褐色条状斑;病株根部外观正常,但木质部严重变褐。桑农在夏伐整枝后出现大批枯死现象。从桑园的发病情况与病株的症状看,初步诊断为细菌病害。为有效治理浙江省杭州地区桑树上严重发生的新病害,从发病严重的"桑枯萎"病树上分离获得105株细菌,通过对36株代表菌的常规细菌学、电镜观察、致病性及Kock氏假说测定、Biolog鉴定、脂肪酸分析、生理生化、Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus-PCR(ERIC-PCR)分析、16S rRNA序列分析、rpoB基因分析、ITS序列测定,同时与肠杆菌属(Enterobacter)中与植物有关的7个模式种菌株和其他3株参考菌株的比较,确证这是一种世界上尚未报道的桑树新病害。本研究明确了我们所分离到的致病菌归属于Enterobacter spp.,根据Biolog鉴定和脂肪酸分析,它们与***的相似程度最高,但与来自杨树的*** LMG2693模式菌株相比较,分离菌株能在桑树上致病,而LMG2693只在杨树上致病,但在桑树上不致病,而且其16S rRNA序列与Enterobacter属中16个与植物和环境有关种的序列相比较,与***的相似值在98%以下,根据Iversen的划分标准,我们所分离到的菌株为Enterobacter中的一个新种。进一步通过ERIC-PCR方法,我们发现我们所分离到的致病菌的DNA指纹图谱不仅内部具有较大差异,与标准菌株及参考菌株之间也有明显的不同。这表明引起桑树"枯萎"病的病原涉及Enterobacter中一个或以上的新种。而且也是Enterobacter spp.引起植物病害的又一新证据。该研究结果不但对桑树病害的治理具有实际意义,而且对深入研究Enterobacter中的人体条件致病菌及环保菌具有重要的学术价值。

关键词：新病害病原细菌鉴定 Enterobacter spp.

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青枯菌不同生化型拮抗细菌的筛选与鉴定

青枯菌不同生化型拮抗细菌的筛选与鉴定

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第四届中国植物细菌病害学术研讨会

作者：苏婷王国芬谢关林浙江大学生物技术研究所水稻生物学国家重点实验室

作物细菌性青枯病是由茄科劳尔氏菌（Ralatonia solanacearum）引起的一种系统侵染的毁灭性土传病害,该病的生物防治已受到世界各国的极大关注。根据植物青枯病菌对各种糖醇利用的生化特性,可分为5种生化型,本研究首次以5种不同青枯菌... 详细信息

作物细菌性青枯病是由茄科劳尔氏菌（Ralatonia solanacearum）引起的一种系统侵染的毁灭性土传病害,该病的生物防治已受到世界各国的极大关注。根据植物青枯病菌对各种糖醇利用的生化特性,可分为5种生化型,本研究首次以5种不同青枯菌的生化型作为靶标菌,筛选出一株具有优良性状的拮抗菌,并对其进行鉴定。在前期研究中,得到对番茄青枯菌*** Rs-F.351144-060928-12V有抑制作用的9株拮抗菌。利用6株青枯病菌的5种不同生化型为靶标,通过滤纸片法和牛津杯法分别测定9株拮抗菌对不同生化型的离体拮抗效果。这两种方法分别从含菌体的发酵液和不含菌体的发酵液两方面来测定拮抗菌的拮抗效果。滤纸片法测定结果显示:其中4株（4811、4812、4815、4816）具有相对较明显的抑制作用。而在这4株拮抗菌中,拮抗菌株4812的抑制效果最显著（P=0.017）。于是进一步采用牛津杯法进行菌株4812的拮抗试验,测试结果与滤纸片法的结果基本一致。可见菌株4812对这6株青枯菌都表现出较为明显且稳定的抑菌效果,具有很大的生防潜力。细菌的传统鉴定主要依靠细菌的培养和生理生化等表型特征。菌株4812在NA培养基上菌落表面粗糙不透明,有皱褶,呈浅黄色,圆形,无光泽。其测定的生理生化特征各项指标中,与《伯杰细菌鉴定手册（第九版）》和《常见细菌鉴定手册》中对枯草芽孢杆菌的描述基本一致。将拮抗菌4812脂肪酸成份分析结果与MIDI数据库比对,发现拮抗菌4812与枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的匹配度最高,相似系数为0.463。以拮抗菌株4812的基因组DNA为模板进行PCR扩增,得到一条约为1450bp的DNA片段。16S rDNA序列的分析结果用GenBank（基因序列数据库）进行同源性比较,结果表明在亲缘关系相近的前100个序列中,有56个均为枯草芽孢杆菌的菌株,与枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）序列同源性为99%。通过对菌株4812的形态、生理生化特征、脂肪酸鉴定和16S rDNA序列测定等,鉴定该菌株为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis。

关键词：拮抗细菌青枯病菌生化型 Bacillus subtilis4812

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基因水平转移在植物细菌致病性及其进化上的影响研究

基因水平转移在植物细菌致病性及其进化上的影响研究

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第四届中国植物细菌病害学术研讨会

作者：朱勃金谷雷谢关林浙江大学生物技术研究所水稻生物学国家重点实验室浙江大学生物信息研究所

基因重组、复制及丢失一直以来被认为在细菌进化过程中起着最主要的作用,尽管一些学者一直怀疑在致病基因的进化过程中,水平转移（Horizontal Gene Transfer,HGT）起着一定的作用,但是只有在最近几年随着测序技术的进步,大量不同科属的... 详细信息

基因重组、复制及丢失一直以来被认为在细菌进化过程中起着最主要的作用,尽管一些学者一直怀疑在致病基因的进化过程中,水平转移（Horizontal Gene Transfer,HGT）起着一定的作用,但是只有在最近几年随着测序技术的进步,大量不同科属的细菌基因组全序列的测定,我们才能在基因组的水平上去研究水平转移对于细菌在进化过程中所产生的影响。目前主流的检测基因的水平转移主要有以下三种方法:1.G+C含量的差异;2.密码子选择偏好型的差异。3.根据基因构建的进化树与物种树之间的差异。其中1、2两种方法只适应于检测年代较近发生的水平转移事件,如果水平转移发生年代较早,转移获得基因的GC含量及其密码子选择偏好型会逐渐与受体菌相似;构建进化树是目前来说最值得信任的检测水平转移的方法,三型分泌系统（TypeⅢSecretion System,T3SS）在植物致病细菌侵染宿主植物过程中起着重要的作用,其中该系统中的重要组成元件Hrc （Hypertensive response and conserved）系列基因就是通过构建进化树的方法发现与SSUrRNA构建的物种树差异巨大而被认为可能是通过水平转移获得的。但是目前主流软件的计算过程耗费时间较长,且当发生水平转移以后基因发生丢失或者复制的情况的时候,就无法正确的识别,另外由于某个分支祖先通过水平转移获得一个新的基因从而传递给后代,导致分支与分支之间产生了"有或者无"该基因的差异,这也是无法通过构建进化树而被正确识别。基于以上考虑,我们一方面构建了一套"分支节点跳跃"（Bipartition Node Metric）方法对现有的构建进化树的方法进行简化及补充（图1）,另一方面首次将内含子进化理念应用于水平转移"有或者无"这类情况当中。

关键词：基因重组基因水平转移分支节点跳跃法内含子进化

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猪抗菌肽cecropin-P1单克隆抗体的制备

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上海畜牧兽医通讯 2008年第4期 36-38页

作者：王爱苹汪以真陈正贤浙江大学饲料科学研究所动物分子营养学教育部重点实验室杭州310029 浙江大学生物技术研究所水稻生物学国家重点实验室杭州310029

cecropins是最早在天蚕中发现的抗菌肽,故被称为天蚕素(ceeropin),由31～39个氨基酸残基组成,分子量约为4 ku,具有广谱抗菌作用.目前已报道的cecropins有30多种,其中cecropin-P1是Lee等首先从猪小肠中分离得到的(Lee et al.,1989).

关键词：抗菌肽天蚕素抗菌作用猪小肠分子量氨基酸组成广谱

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梨树花枯和芽枯的Pseudomonas syringae ***病原鉴定

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第四届中国植物细菌病害学术研讨会

作者：邱文徐丽慧谢关林李斌徐福寿怀雁余山红钱军浙江大学生物技术研究所水稻生物学国家重点实验室杭州市植保土肥总站

2006年春在杭州地区的梨树上发现一较严重的新病害。最初花萼端出现水渍状褐色斑点,之后变深褐色至黑色;叶片也被侵染,空气潮湿的情况下深褐色角形斑迅速扩展,整个叶片变黑色;被侵染部分干枯易碎,从树上脱落。幼果发病,水渍状部分在成... 详细信息

2006年春在杭州地区的梨树上发现一较严重的新病害。最初花萼端出现水渍状褐色斑点,之后变深褐色至黑色;叶片也被侵染,空气潮湿的情况下深褐色角形斑迅速扩展,整个叶片变黑色;被侵染部分干枯易碎,从树上脱落。幼果发病,水渍状部分在成熟时凹陷变黑。即梨树的花、果实和叶片均可感染,发病后很快变黑褐色枯萎,犹如火烧;初期症状与火疫病相近,但不会产生火疫病典型的"牧羊鞭"症状,且湿度较高时病斑处也未见菌脓。为明确该梨花枯和芽枯的确切病原菌,以便为该病的防治提供可靠的依据,我们对病原菌作了详细鉴定。从16份病样中分离获得12株病原细菌,选择6株典型的代表菌株,以3株*** ***标准菌株LMG5570、LMG2230、LMG2231和1株番茄青枯病标准菌株Ralstonia solanacearum Rp-1为对照,进行了电镜观察、细菌学特征、Kock氏病原假说测定、Bioiog、脂肪酸(FAME)及分子生物学测定。研究结果表明6个梨树分离菌的菌体均为短杆状,能游动,好气性,不产生芽孢。菌体大小为0.8-1.5μm×1.5-4.0μm,着生2-4根极生鞭毛,在电镜下观察到的菌体多为3根鞭毛。可由蔗糖形成果聚糖,能液化明胶,产丁香霉素和细胞色素氧化酶,在KMB培养基上产生荧光色素。在41℃下不能生长,淀粉水解、硝酸盐还原、β-葡糖苷酶反应为阴性,该菌具有典型的Pseudomonas syringae种的特征。所测的6株菌株中有3株表现出冰核活性。6个梨树分离菌均被Biolog和FAME鉴定为*** ***,相似度分别在0.463-0.880和0.584-0.701,具有很高的可信度。Koch氏病原假说测定获得纯培养菌并经回接梨树后产生花枯和芽枯症状。6株菌株的16sRNA的序列与GENEBANK中已知的细菌序列相比较,它们与*** ***、*** ***(*** ***,大豆细菌性疫病菌)、*** ***(*** ***,菜豆晕疫病菌)等的同源性均高达99%,但根据上述的细菌学特征、Biolog和FAME分析鉴定及其在梨树上的致病性测定(后两种病原在梨树上不致病),排除后两种病原细菌的可能性。可以确证本研究中的梨花枯和芽枯病是由Pseudomonas syringae ***引起,这是梨花枯病(pear blossom blast)在中国的首次报道。

关键词：梨花枯梨芽枯 Pseudomonas syringae pv.syringae 证实

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洋葱伯克氏菌群不同基因型菌株对几种重要植物病原真菌的抑制作用及其潜在致病性研究

洋葱伯克氏菌群不同基因型菌株对几种重要植物病原真菌的抑制作用...

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第四届中国植物细菌病害学术研讨会

作者：张立新苏婷谢关林浙江大学生物技术研究所水稻生物学国家重点实验室安徽农业大学植物保护学院

洋葱伯克氏菌群(Burkholderia cepacia complex,Bcc)有多种基因型或细菌种所组成,其中一些种内的菌株具有卓越的生防潜力,由于Bcc菌能够产生多种抗生素和嗜铁素,对植物病原菌具有很好的抑制作用,己作为生物杀菌剂用于防治土传病害和采... 详细信息

洋葱伯克氏菌群(Burkholderia cepacia complex,Bcc)有多种基因型或细菌种所组成,其中一些种内的菌株具有卓越的生防潜力,由于Bcc菌能够产生多种抗生素和嗜铁素,对植物病原菌具有很好的抑制作用,己作为生物杀菌剂用于防治土传病害和采后果实病害。同时,Bcc菌还是一种强竞争力的根围定殖细菌。Bcc菌作为生物农药曾在国内外被登记的有不少,但由于发现一些Bcc基因型的菌株是人体条件致病菌,Bcc作为活菌制剂的生物农药,近年来已在不少国家被禁止或限制使用。然而,国内外至今尚无Bcc不同基因型菌株对主要植物病原的筛选报道,寻找高效分泌拮抗物质、对多种植物病原具有抑制作用且又安全的Bcc菌株是本研究的目标。本研究从玉米和水稻根围分离到70株不同基因型的洋葱伯克氏菌,对这些菌株进行了拮抗植物病原菌的筛选,并对高拮抗菌株进行了潜在致病性和安全性分析。结果表明,有46株洋葱伯克氏菌对一种或多种病菌有较高的拮抗活性。在不同的洋葱伯克氏菌基因型内,以基因型Ⅴ内拮抗菌株占的比例最高,对所测5种病原真菌的平均拮抗菌株比率为80.0%,其中部分菌株表现出很强的拮抗活性。筛选出的4株高拮抗菌株对洋葱不具有致病性,同时也未检测到与人体致病相关的BCESM毒力基因。已有研究表明,Bcc的一些菌株对腐霉病和猝倒病的防效显著,其中基因型Ⅷ菌株MC17能够促进玉米生长和保护植株免受串珠镰刀病菌(Fusarium verticillioides)的侵染。然而,由于基因型Ⅲ在临床上分离率很高,被认为是具有强致病性的人体条件致病菌,因此基因型Ⅲ菌株作为生防菌的应用是否对人体构成风险仍是争论的焦点。而Ⅰ型菌也是一类很复杂的菌,它既是洋葱致病菌又是人体条件致病菌,在农田土壤和医院中都具有很高的比例,是很值得关注的一类病菌。笔者对分离于根围的Bcc菌株进行了平板拮抗植物病菌的筛选,发现部分菌株具有较高的拮抗活性,主要集中在Ⅴ型、Ⅰ型和Ⅸ型,其中多数基因型Ⅴ菌株表现出很强的拮抗活性。以往的研究表明,基因型Ⅴ菌株具有生物降解活性和促生活性。同时还发现一些基因型Ⅴ菌株具有较好的降解苯酚和其它芳香烃类化合物的功能。本研究中分离的基因型Ⅴ菌株同时也表现出强烈的平板拮抗活性和对植物病原的广普性,具有一定的开发应用潜力。

关键词：洋葱伯克氏菌群拮抗致病性 BCESM毒力基因

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桑细菌性枯萎病菌的rep-PCR、全细胞脂肪酸及致病能力多态性分析

桑细菌性枯萎病菌的rep-PCR、全细胞脂肪酸及致病能力多态性分析

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第四届中国植物细菌病害学术研讨会

作者：王国芬刘波谢关林朱博浙江大学生物技术研究所水稻生物学国家重点实验室福建省农业科学院农业生物资源研究所

2008年本实验室在国际上首次报道了引起桑细菌性枯萎病的病原Enterobacter sp.。本研究对该病原的多态性作了深入研究。98株、6株、9株分别分离自浙江省、广东省、广西壮族自治区桑树细菌性枯萎病的病原菌Enterobacter sp.、5株引起植... 详细信息

2008年本实验室在国际上首次报道了引起桑细菌性枯萎病的病原Enterobacter sp.。本研究对该病原的多态性作了深入研究。98株、6株、9株分别分离自浙江省、广东省、广西壮族自治区桑树细菌性枯萎病的病原菌Enterobacter sp.、5株引起植物青枯病的雷尔氏菌Ralstonia solaniacearum及2株Enterobacter sp.标准菌共120个能引起桑树枯萎病的病原细菌进行了ERIC-PCR,BOX-PCR多态性测定。结合全细胞脂肪酸的鉴定结果,对其中的57个菌株进行了致病力的比较验证。对120个测试菌ERIC-PCR多态性DPS系统聚类显示,当λ=0.78时,测试菌株可分为11个大类群和13个单个菌株构成的小的分支;第Ⅰ,Ⅱ类群除LMG2693和Rm1外,都由采自Field A的菌株组成;类群Ⅳ和Ⅴ大部分由Field D和Field E的菌株组成;除R27-2外类群Ⅶ均由Field F的菌株组成;类群Ⅹ由Field A,B,C的菌株组成;和生理生化鉴定及脂肪酸鉴定结果一样,从广东分离的几个菌株差异较大,其ERIC-PCR多态性分散在各个类群之中。当λ=0.906时,可明显的将Enterobacter与其它病原菌如Ralstonia solaniacearum进行区分:BOX-PCR多态性图谱显示共有367个扩增条带,其中104个为多态性扩增条带。120个测试菌中,有43个菌株在约1300bp处有一共同条带,有47个菌株在约850bp处有一共同条带,有57个菌株在约650bp处有一共同条带,有102个菌株在约500bp处有一共同条带,有45个菌株在约300bp处有一共同条带。测试菌株的BOX-PCR结果比ERIC-PCR条带简单,清晰,代表性条带明显。120个测试菌的BOX-PCR多态性DPS系统聚类表明,当λ=0.80时121个测试菌株大致可分为4个大群体和12个小的分支,主要类群包括ERIC-PCR的4个群体,各群体均有分离自不同区域的菌株。结合57株有致病能力分化的菌株和脂肪酸鉴定结果认为,ERIC和BOX重复序列元件多态性与菌株的来源相关,而各菌株基因组中分布的这些重复序列与病原菌的致病能力强弱及脂肪酸的类型没有直接的相关性。

关键词：桑树枯萎病致病力基因间重复序列多态性

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稻曲球及稻曲病菌菌落微结构的SEM观察

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菌物学报 2007年第1期26卷 89-96页

作者：陈丽胡东维陈美军张敬泽浙江大学生物技术研究所水稻生物学国家重点实验室杭州310029

本文对不同培养条件下稻曲病菌菌落及稻曲球的微结构进行了扫描电镜比较研究。在PS培养液里进行液体培养时,稻曲病菌很少产生分生孢子和厚垣孢子,只有培养后期漂浮在培养液表面的菌落可以产生大量的厚垣孢子。病原菌在进行PSA固体培养时... 详细信息

本文对不同培养条件下稻曲病菌菌落及稻曲球的微结构进行了扫描电镜比较研究。在PS培养液里进行液体培养时,稻曲病菌很少产生分生孢子和厚垣孢子,只有培养后期漂浮在培养液表面的菌落可以产生大量的厚垣孢子。病原菌在进行PSA固体培养时,大部分菌株在培养后期产生大量的成堆分布的厚垣孢子,少部分菌株在菌落上产生散生的厚垣孢子。说明暴露于空气有助于稻曲病菌产生厚垣孢子。在煮熟的带壳谷粒上稻曲病菌的生长明显比在去壳上的要慢得多。微结构分析表明,稻曲球表面是一层密集的厚垣孢子,菌丝与稻粒的胚乳层界限分明,大部分稻曲球中部有大块的发育良好的胚乳,并充满密集的淀粉粒。说明稻曲病菌可能在开花灌浆后开始侵染,而且至少后期是腐生的。

关键词：稻曲病厚垣孢子侵染

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短短芽孢杆菌JK-2菌株对番茄枯萎病的抑菌作用及其小区防效

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中国生物防治 2007年第3期23卷 233-236页

作者：郝晓娟刘波谢关林葛慈斌林抗美浙江大学生物技术研究所/水稻生物学国家重点实验室杭州310029 福建省农科院生物技术研究所福州350003

对分离自土壤的短短芽孢杆菌JK-2菌株对番茄枯萎病菌的防治效果和抑制作用进行了研究。结果表明:JK-2对番茄枯萎病菌的盆栽防效和田间防效分别为83.82%、74.70%。该菌株能抑制枯萎病菌菌丝的生长,当其无菌滤液终浓度为15%时,对菌丝生长... 详细信息

对分离自土壤的短短芽孢杆菌JK-2菌株对番茄枯萎病菌的防治效果和抑制作用进行了研究。结果表明:JK-2对番茄枯萎病菌的盆栽防效和田间防效分别为83.82%、74.70%。该菌株能抑制枯萎病菌菌丝的生长,当其无菌滤液终浓度为15%时,对菌丝生长的抑制率达到81.69%。JK-2菌株对病菌孢子萌发也有较强的抑制作用。扫描电镜观察结果:JK-2菌株可造成菌丝消解、产生泡状物、破坏生长点、引起细胞内含物外溢。

关键词：拮抗细菌番茄枯萎菌抑制作用生物防治

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大麦Mlo近等基因系与稻瘟病菌互作的超微结构观察

大麦Mlo近等基因系与稻瘟病菌互作的超微结构观察

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中国植物病理学会2007年学术年会

作者：罗臻陈利刚胡东维浙江大学生物技术研究所水稻生物学国家重点实验室浙江大学生物技术研究所水稻生物学国家重点实验室浙江大学生物技术研究所水稻生物学国家重点实验室

白粉病是植物病害中最具有破坏性病害之一,大麦白粉病是由专性寄生真菌 Blumeria graminis ***． hordei 侵染造成的。具有 mlo 突变的大麦对白粉病具有广谱、高效和抗性持久的抗病性,其抗性机制主要表现为病原菌入侵早期大麦表皮细胞... 详细信息

白粉病是植物病害中最具有破坏性病害之一,大麦白粉病是由专性寄生真菌 Blumeria graminis ***． hordei 侵染造成的。具有 mlo 突变的大麦对白粉病具有广谱、高效和抗性持久的抗病性,其抗性机制主要表现为病原菌入侵早期大麦表皮细胞具有强烈的乳突反应,能够有效抵抗病原菌的侵染。

关键词：稻瘟病菌白粉病 Mlo 等基因系微结构

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