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国际流行病学传染病学杂志 2017年第3期44卷 151-155页

作者：马月莫丽方杰张欢欢余陈欢浙江省医学科学院动物中心浙江省实验动物与安全性研究重点实验室杭州310013 浙江省中医药大学药学院杭州310053

目的利用腺相关病毒（AAV）转导和CRISPR技术建立肝脏相关疾病小鼠模型。方法AAV-绿色荧光蛋白（GFP）表达系统（AAV-GFP）和CRISPR靶向基因敲除质粒系统（px330-sgGFP—Cas9），三组FVB／NJ小鼠采用尾静脉高压水动力注射技术分别注射... 详细信息

目的利用腺相关病毒（AAV）转导和CRISPR技术建立肝脏相关疾病小鼠模型。方法AAV-绿色荧光蛋白（GFP）表达系统（AAV-GFP）和CRISPR靶向基因敲除质粒系统（px330-sgGFP—Cas9），三组FVB／NJ小鼠采用尾静脉高压水动力注射技术分别注射生理盐水（对照组）、AAV-GFP（AAV-GFP组）、AAV—GFP＋px330-sgGFP-Cas9（sgGFP组），采用小动物活体成像仪检测小鼠肝脏GFP表达情况。结果生理盐水对照组小鼠肝脏不表达GFP；AAV—GFP组小鼠肝脏72h后开始表达GFP，2周后GFP表达稳定；sgGFP组在第9、12天均表达GFP蛋白，但2周后GFP蛋白明显减弱。结论本研究所构建的AAV—GFP表达系统能够在小鼠肝脏中稳定表达GFP。所构建的CRISPR质粒系统可以特异性敲除小鼠肝脏所携带的目的基因，建立合适的肝脏疾病研究模型。

关键词：质粒 CRISPR技术腺相关病毒系统水动力注射技术

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微RNA-22在甲状腺乳头状癌中的表达及与化疗敏感性的关系

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国际流行病学传染病学杂志 2017年第2期44卷 95-99页

作者：谢珲张欢欢应华忠余陈欢张松照陈勤浙江省医学科学院浙江省实验动物与安全性研究重点实验室杭州310013 浙江大学医学院附属第二医院检验科杭州310009

目的研究微RNA（miRNA,miR）-22在甲状腺乳头状癌组织、血清和细胞系中的表达及其与化疗敏感性的关系.方法收集21例临床确诊为甲状腺乳头状癌病例资料、组织、血清样本,同时收集21例健康体检者和21例甲状腺结节患者血清样本作为对照,... 详细信息

目的研究微RNA（miRNA,miR）-22在甲状腺乳头状癌组织、血清和细胞系中的表达及其与化疗敏感性的关系.方法收集21例临床确诊为甲状腺乳头状癌病例资料、组织、血清样本,同时收集21例健康体检者和21例甲状腺结节患者血清样本作为对照,采用实时荧光定量聚合酶链式反应的方法检测miR-22在癌组织、癌旁组织、血清、人甲状腺正常细胞系和人甲状腺乳头癌细胞系中的表达并进行统计学分析,利用生物信息学软件预测miR-22的靶基因及参与的信号通路.结果 miR-22在癌组织中的表达显著低于癌旁组织,在癌患者血清中的表达显著高于健康体检者和甲状腺结节患者,在癌组织中的表达与血清中表达呈负相关（r=-0.851,P＜0.01）.miR-22在T3～T4期癌组织中的相对表达量为0.45±0.08,低于T1～T2期的0.61±0.18（t=-2.809,P＜0.01）,在N-期癌组织中的相对表达量为0.64±0.16,高于N＋期的0.48±0.10 （t=2.789,P＜0.01）;在T3～T4期患者血清中的相对表达量为12.76±1.60,高于T1～T2期的9.91±2.74（t=2.806,P＜0.01）;在化疗高敏感组患者癌组织中的相对表达量为0.71±0.14,高于化疗低敏感组的0.42±0.13（t=4.575,P＜0.01）.利用生物信息学软件预测SIRT1和HMGB1为miR-22的靶基因,其参与细胞内吞作用、肌动蛋白细胞骨架调节、丝裂原活化蛋白激酶和癌症等多个信号通路.结论 miR-22在甲状腺乳头状癌组织和细胞系中的表达量显著降低,且与肿瘤T、N分期和化疗敏感性有关,但在血清中的表达量显著升高;miR-22参与多个信号通路,可能通过靶向调控SIRT1和HMGB1影响甲状腺乳头状癌的发生发展.

关键词：微RNAs 甲状腺乳头状癌表达量化疗敏感性

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长爪沙鼠肝星状细胞的分离培养与鉴定

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中国比较医学杂志 2016年第3期26卷 29-34页

作者：楼琦李巍石巧娟卢领群郭红刚杜江涛萨晓婴浙江省医学科学院实验动物中心浙江省实验动物与安全性研究重点实验室杭州310010

目的探索长爪沙鼠稳定、经济的肝星状细胞分离和培养方法,为深入探讨长爪沙鼠肝纤维化的细胞机制提供技术支撑。方法取成年雄性长爪沙鼠,用链蛋白酶、胶原酶及DNA酶体内门静脉灌注消化长爪沙鼠肝脏细胞,经Nycodenz密度梯度离心,分离肝... 详细信息

目的探索长爪沙鼠稳定、经济的肝星状细胞分离和培养方法,为深入探讨长爪沙鼠肝纤维化的细胞机制提供技术支撑。方法取成年雄性长爪沙鼠,用链蛋白酶、胶原酶及DNA酶体内门静脉灌注消化长爪沙鼠肝脏细胞,经Nycodenz密度梯度离心,分离肝星状细胞。台盼蓝拒染实验鉴定细胞活力,α-SMA,Desmin免疫细胞化学染色鉴定细胞性质。结果肝星状细胞得率为0.5-1×10^7/肝。肝星状细胞存活率在90%以上。原代培养3 dα-SMA阳性细胞达75%以上,传代培养后,α-SMA,Desmin阳性达100%。结论成功建立了稳定可靠的长爪沙鼠肝星状细胞分离培养方法,为肝脏相关疾病研究和防治药物的开发提供了技术支持。

关键词：长爪沙鼠肝星状细胞细胞分离原代培养

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基于高通量测序技术的实验动物沙门氏菌检测方法的建立与评价

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中国比较医学杂志 2016年第10期26卷 72-78页

作者：胡毅翔张欢欢余陈欢金晓音应华忠浙江省医学科学院浙江省实验动物与安全性研究重点实验室杭州310013

目的建立基于高通量测序技术的实验动物沙门氏菌检测方法,应用于实验动物沙门氏菌的检测。方法提取小鼠粪便DNA样本,分别针对16S r DNA区域、23S r DNA区域、16S^23S r DNA IS、23S^5S r DNA IS、gyr B优选区域设计通用引物,对各个引物... 详细信息

目的建立基于高通量测序技术的实验动物沙门氏菌检测方法,应用于实验动物沙门氏菌的检测。方法提取小鼠粪便DNA样本,分别针对16S r DNA区域、23S r DNA区域、16S^23S r DNA IS、23S^5S r DNA IS、gyr B优选区域设计通用引物,对各个引物进行测试分析,优化扩增条件并建库,利用Illumina高通量测序技术检测区分42个样本中的沙门氏菌,评价该方法的特异性和稳定性。结果筛选发现沙门氏菌的菌种分类优选区域为gyr B基因,gyr B基因引物序列为FP5’-AACCACCGCAATCAGACCTT3’,FP5’-AGCCACGAAACCTTCACYA-3’。对引物进行优化,确定最佳扩增条件及样品上样量并正式建库,通过高通量测序和序列分析能检测出42个样品中极微量的沙门氏菌,检测方法稳定,灵敏度高,检测限可达0~102的cfu。结论本实验利用高通量测序技术,建立了一套完整检测实验动物沙门氏菌的生物体系,能检测出实验动物体内极微量的沙门氏菌,检测方法稳定性好,灵敏度高,可沿用至其他种类病原微生物的检测。

关键词：沙门氏菌实验动物高通量测序

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基于microRNAs的石荠苧总黄酮抗流感病毒性肺炎作用机制研究

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中草药 2016年第7期47卷 1149-1154页

作者：吴方余陈欢俞文英胡毅翔王丹仙俞冰浙江中医药大学药学院浙江杭州310053 浙江省医学科学院浙江省实验动物与安全性研究重点实验室浙江杭州310013

目的从微小核糖核酸(micro RNAs,mi RNAs)角度研究石荠苧总黄酮抗流感病毒性肺炎作用机制。方法设立对照组、模型组和石荠苧总黄酮组,将甲型流感病毒小鼠肺适应株A/PR/8/34经鼻滴入模型组和石荠苧总黄酮组小鼠,建立小鼠流感病毒感染性... 详细信息

目的从微小核糖核酸(micro RNAs,mi RNAs)角度研究石荠苧总黄酮抗流感病毒性肺炎作用机制。方法设立对照组、模型组和石荠苧总黄酮组,将甲型流感病毒小鼠肺适应株A/PR/8/34经鼻滴入模型组和石荠苧总黄酮组小鼠,建立小鼠流感病毒感染性肺炎模型,观察比较石荠苧总黄酮对流感病毒感染小鼠肺指数和血清白细胞介素-6(IL-6)、γ干扰素(IFN-γ)水平的影响;采用高通量测序法和荧光定量PCR法,检测各组小鼠肺组织中mi RNAs的表达丰度差异;采用miranda、mirbase、targetscan 3个数据库预测差异mi RNAs的靶基因,并通过KEGG分析靶基因的相关功能;采用蛋白印迹法验证相关蛋白的表达。结果与模型组相比,石荠苧总黄酮可显著抑制流感病毒感染引起的小鼠肺指数和血清中细胞因子增加,调节异常表达的mi RNAs水平趋于正常;KEGG分析这些mi RNAs所调控的靶基因主要富集于JAK-STAT、TLR3等信号通路;Western blotting证实石荠苧总黄酮可调整感染小鼠异常表达的靶蛋白水平。结论石荠苧总黄酮可通过调控小鼠体内mi RNAs的表达发挥抗流感病毒性肺炎作用。

关键词：石荠苧总黄酮流感病毒靶基因 TLR3 高通量测序

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基于肺部苦味受体抗哮喘天然活性成分筛选模型的建立与应用

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中草药 2016年第5期47卷 775-780页

作者：胡毅翔蔡伟张欢欢余陈欢俞文英金晓音应华忠浙江省医学科学院浙江省实验动物与安全性研究重点实验室浙江杭州310013 浙江医药高等专科学校中药学院浙江宁波315100

目的构建以肺部苦味受体TAS2R14为靶点的高通量筛选细胞模型,为寻找高效、低毒的新型抗哮喘天然药物奠定基础。方法利用同源重组技术将TAS2R14受体基因插入p LVX-basic质粒,构建p LVX-Ac GFP1-N1-TAS2R14重组载体,并将其转染入HEK293T细... 详细信息

目的构建以肺部苦味受体TAS2R14为靶点的高通量筛选细胞模型,为寻找高效、低毒的新型抗哮喘天然药物奠定基础。方法利用同源重组技术将TAS2R14受体基因插入p LVX-basic质粒,构建p LVX-Ac GFP1-N1-TAS2R14重组载体,并将其转染入HEK293T细胞,建立特异性高表达TAS2R14受体基因的细胞株。利用该细胞模型对120种苦味中药提取物和单体化合物进行高通量筛选。结果建立的模型Z′因子为0.69和0.66,筛选发现陈皮提取物及其药效物质柠檬苦素,白果提取物及其药效物质芦丁、奎宁对TAS2R14受体具有显著的激动作用。结论建立的TAS2R14受体激动剂高通量筛选模型稳定性好、灵敏度高,筛选得到的3种中药单体具有潜在的TAS2R14受体激动活性。

关键词：哮喘苦味受体柠檬苦素芦丁奎宁

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橙黄胡椒酰胺酯对脂多糖诱导人肺泡上皮细胞A549凋亡的抑制作用

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国际流行病学传染病学杂志 2017年第4期44卷 217-221页

作者：张宽宽张欢欢俞文英方杰余陈欢宁波市镇海区招宝山街道社区卫生服务中心浙江宁波315000 浙江省医学科学院浙江省实验动物与安全性研究重点实验室杭州310013

目的探讨橙黄胡椒酰胺酯（AA）对脂多糖（LPS）诱导人肺泡上皮细胞A549凋亡的抑制作用及其转录组学调控机制。方法采用MTT法检测经LPS及AA处理后A549细胞的增殖情况。采用流式细胞技术检测细胞凋亡率。采用RNA-seq技术筛选AA处理前后A54... 详细信息

目的探讨橙黄胡椒酰胺酯（AA）对脂多糖（LPS）诱导人肺泡上皮细胞A549凋亡的抑制作用及其转录组学调控机制。方法采用MTT法检测经LPS及AA处理后A549细胞的增殖情况。采用流式细胞技术检测细胞凋亡率。采用RNA-seq技术筛选AA处理前后A549细胞的差异表达基因，并将得到的差异表达基因进行GO功能富集以及KEGG通路分析。结果10μg／mLLPS可诱导A549细胞发生明显凋亡，凋亡率为（51．7±3．2）％，与正常组凋亡率[（4．8±0．2）％]相比差异有统计学意义（t=0．000，P〈0．05）；给予15-60μg／mLAA干预后，可明显抑制LPS诱导的细胞凋亡，并呈一定的浓度依赖性。通过比较分析，共筛选出差异表达基因76个，其中显著下调的基因为9个，显著上调的基因为67个；依据作用通路分类，显著通路（P〈10^-3）的有2个，分别是细胞外基质受体互作通路和肿瘤坏死因子（TNF）信号通路。结论AA可抑制LPS诱导的A549细胞凋亡，其作用机制可能与细胞炎症及黏附等的调控有关。

关键词：二酮哌嗪类急性肺损伤细胞凋亡转录组测序炎症反应

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槲皮素对大鼠非酒精性脂肪肝炎的治疗作用及其机制

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实验动物与比较医学 2017年第2期37卷 83-88页

作者：李剑波余陈欢王志远方杰应华忠浙江中医药大学药学院杭州310053 杭州市余杭区第一人民医院药剂科杭州311000 浙江省医学科学院浙江省实验动物与安全性研究重点实验室杭州310013

目的观察槲皮素对大鼠非酒精性脂肪肝炎(NASH)的治疗作用,以及槲皮素对NASH大鼠肝组织核因子-κB(NF-κB)及其下游转录因子表达水平的影响。方法采用高脂饲料喂食6周,建立NASH大鼠模型。灌胃给予40~160 mg/kg槲皮素治疗4周。采用生化检... 详细信息

目的观察槲皮素对大鼠非酒精性脂肪肝炎(NASH)的治疗作用,以及槲皮素对NASH大鼠肝组织核因子-κB(NF-κB)及其下游转录因子表达水平的影响。方法采用高脂饲料喂食6周,建立NASH大鼠模型。灌胃给予40~160 mg/kg槲皮素治疗4周。采用生化检测仪检测血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)水平。采用Western blotting法检测各组肝脏中NF-κB蛋白表达情况。采用RT-PCR技术检测各组肝脏中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)和白细胞介素1β(IL-1β)mRNA的表达情况。结果与高脂模型组相比,槲皮素各剂量组大鼠血清LDL-C、TC、AST水平显著降低。病理组织学检查结果表明,给予槲皮素治疗后,可明显减轻NASH大鼠肝脏脂肪变性和炎性细胞浸润;同时,还可明显降低TNF-α、IL-6和IL-1β mRNA以及NF-κB p65蛋白的表达,并呈一定的量效关系。结论槲皮素对高脂饮食诱导大鼠NASH有明显治疗作用,作用机制可能与其抑制肝细胞脂质沉积和调控NF-κB通路有关。

关键词：槲皮素非酒精性脂肪肝炎 (NASH)NF-κB 炎症反应高血脂

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苍术酮对急性肺损伤小鼠血清细胞因子和TLR7信号通路的影响

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中国中医急症 2017年第6期26卷 952-955页

作者：陈天阳薛建华侯天禄平键胡毅翔成扬陈建杰上海市浦东新区传染病医院上海201299 上海中医药大学附属曙光医院上海201203 浙江省医学科学院浙江省实验动物与安全性研究重点实验室浙江杭州310013

目的观察苍术酮对急性肺损伤(ALI)小鼠血清细胞因子和TRL7信号通路的影响。方法通过呼吸道感染甲型流感病毒,诱导小鼠ALI模型。将144只雄性SPF级ICR小鼠,随机分为正常组24只,模型组120只。模型组在乙醚麻醉下通过鼻内接种IAV诱导感染,... 详细信息

目的观察苍术酮对急性肺损伤(ALI)小鼠血清细胞因子和TRL7信号通路的影响。方法通过呼吸道感染甲型流感病毒,诱导小鼠ALI模型。将144只雄性SPF级ICR小鼠,随机分为正常组24只,模型组120只。模型组在乙醚麻醉下通过鼻内接种IAV诱导感染,这种病毒在小鼠中引起肺炎,然后随机平均分为5组,每组24只,分别为模型对照组,利巴韦林治疗组,苍术酮低剂量、中剂量和高剂量治疗组。在造模2 h后,阳性药物组给予利巴韦林50 mg/kg灌胃给药,苍术酮高、中、低剂量治疗组分别给予苍术酮40 mg/kg、20 mg/kg、10 mg/kg灌胃给药,每日1次,连续5 d。5 d后处死动物,采集血清以及肺组织样本。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清中IFN-β、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)水平;PCR法测定小鼠肺组织中TLR-7、My D88、TRAF6、IFN-βm RNA表达水平;Western blot法检测NF-κB p65蛋白表达水平。结果与正常组比较,模型组小鼠血清中IFN-β、IL-6、TNF-α、IL-1β水平显著升高(P<0.01)。与模型对照组比较,利巴韦林组和苍术酮组IL-6、TNF-α、IL-1β炎症因子水平均显著下降,而IFN-β水平显著升高(P<0.01),苍术酮高、低剂量组差异有统计学意义(P<0.05)。与模型对照组相比,苍术酮治疗组TLR7及其下游基因My D88,TRAF6和IFN-β的m RNA表达显著上调(P<0.01)。此外,Western印迹分析结果显示,模型对照组的核因子κB(NF-κB)p65蛋白表达水平与正常组相比显著增加(P<0.01);与模型组相比,利巴韦林及苍术酮各剂量组的蛋白表达显着减少(P<0.01)。结论苍术酮能够明显减轻ALI小鼠的肺部炎症,其作用机制依赖于TLR7信号通路的激活,诱导I型干扰素的产生和对NF-κB p65表达的抑制。

关键词：苍术酮急性肺损伤细胞因子 TRL7

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长爪沙鼠原位肝移植模型的建立

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中国比较医学杂志 2016年第5期26卷 53-57页

作者：楼琦卢领群周冰珞郭红刚李巍石巧娟杜江涛萨晓婴浙江省医学科学院实验动物中心浙江省实验动物与安全性研究重点实验室杭州310010 浙江大学医学院杭州310053

目的建立长爪沙鼠原位肝移植模型的方法与技术。方法用改良的双套管法行100对长爪沙鼠原位肝移植手术,门静脉、肝下下腔静脉行套管吻合,而肝上上腔静脉采用缝合法,胆管内支架法完成胆道重建。结果在手术成熟后,供体手术时间为34.56±... 详细信息

目的建立长爪沙鼠原位肝移植模型的方法与技术。方法用改良的双套管法行100对长爪沙鼠原位肝移植手术,门静脉、肝下下腔静脉行套管吻合,而肝上上腔静脉采用缝合法,胆管内支架法完成胆道重建。结果在手术成熟后,供体手术时间为34.56±5.12 min,修肝及安置套管时间为15.43±2.75 min,受体手术时间为58.37±8.54 min,其中无肝期为23.66±4.47 min。手术成功率为86.67%(术后存活6 h以上)。结论改良的双套管法成功建立了长爪沙鼠肝移植模型,通过手术技巧训练可提高手术成功率,延长爪沙鼠存活时间。

关键词：长爪沙鼠肝移植模型,动物

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