家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori Nucleopolyhedrovirus,BmNPV)bm47基因普遍存在于已测序的鳞翅目核型多角体病毒基因组中,是杆状病毒的核心基因之一,但其在病毒复制及转录过程中的具体功能尚未可知。本研究利用Red重组技术在大肠杆菌BW...
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家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori Nucleopolyhedrovirus,BmNPV)bm47基因普遍存在于已测序的鳞翅目核型多角体病毒基因组中,是杆状病毒的核心基因之一,但其在病毒复制及转录过程中的具体功能尚未可知。本研究利用Red重组技术在大肠杆菌BW25113中构建了BmNPV的bm47基因缺失型病毒bm47-ko-Bacmid,并利用Bac-to-Bac系统构建了bm47基因的补回型病毒bm47-re-Bacmid。然后利用TCID50病毒滴度测定法和荧光定量PCR等方法研究了缺失bm47基因对病毒复制、转录及蛋白表达的影响。结果表明,bm47基因缺失后对病毒基因组的复制水平没有明显的影响;在病毒转染BmN细胞后48h和72h两个时相,bm47基因的缺失导致病毒早期基因lef3、晚期基因vp39以及极晚期基因p10的转录水平均有一定程度的下降。本研究工作将为深入研究BmNPV bm47在病毒复制和基因转录过程中的生物学功能奠定基础。
家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,Bm NPV)bro(baculovirus repeated ORF)-d基因普遍存在于多种感染鳞翅目昆虫的多角体病毒基因组中,是杆状病毒中一类重复开放阅读框序列。为了解bro-d基因在病毒感染过程中的作用...
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家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,Bm NPV)bro(baculovirus repeated ORF)-d基因普遍存在于多种感染鳞翅目昆虫的多角体病毒基因组中,是杆状病毒中一类重复开放阅读框序列。为了解bro-d基因在病毒感染过程中的作用及其与宿主细胞凋亡之间的关系,本研究利用Red重组技术敲除Bm NPV基因组中的bro-d基因,构建基因缺失型病毒bro-d-ko-Bacmid,并将该缺失型病毒转染家蚕Bm N细胞,利用q RT-PCR技术检测bro-d基因的缺失对病毒基因组复制、转录水平以及抑制凋亡蛋白2基因(inhibitor of apoptosis protein 2,iap2)的影响。结果显示,bro-d基因缺失后会导致病毒基因组的复制水平显著下降(P<0.05),同时病毒的早期基因lef-3、晚期基因vp39和极晚期基因p10的转录水平也都显著下降(P<0.05);iap2的转录水平显著下调(P<0.05)。在bro-d基因缺失型病毒的复制水平明显低于野生型病毒的情况下,仍会导致细胞活力显著下降(P<0.05);bro-d基因缺失引起细胞B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)蛋白含量明显低于野生型病毒,而Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 assaciated X protein,Bax)含量显著高于野生型病毒(P<0.05),进而导致细胞凋亡水平上升。结果表明,bro-d基因不仅对病毒各时期基因表达水平具有调控作用,也可通过调控iap2的表达进而调控宿主细胞的凋亡水平。研究成果为深入了解bro-d基因在病毒感染过程中的功能提供了基础资料,也为通过延长宿主细胞寿命、提高目的蛋白表达产量来进行杆状病毒表达载体的改造提供了新思路。
为了研究家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)基因orf98的功能,通过λRed重组系统定点敲除BmNPVorf98基因,构建缺失型重组病毒Bm98-ko-Bacmid;以Bac-to-Bac系统补回BmNPVorf98基因,构建补回型重组病毒Bm98-re-B...
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为了研究家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)基因orf98的功能,通过λRed重组系统定点敲除BmNPVorf98基因,构建缺失型重组病毒Bm98-ko-Bacmid;以Bac-to-Bac系统补回BmNPVorf98基因,构建补回型重组病毒Bm98-re-Bacmid;将野生型病毒(wtBacmid)、缺失型病毒(Bm98-koBacmid)和补回型病毒(Bm98-re-Bacmid)分别转染家蚕细胞BmN。病毒滴度检测结果显示,Bm98-ko-Bacmid可形成侵染性的病毒粒子,但数量显著降低(P<0.05).透射电子显微镜观察发现,Bm98-ko-Bacmid只产生游离的杆状病毒粒子,数量明显减少,而wtBacmid和Bm98-re-Bacmid产生大量具有囊膜结构的成熟病毒粒子。荧光定量聚合酶链反应分析结果表明,BmNPVorf98基因缺失对BmNPV病毒复制没有影响,而早期基因lef3、晚期基因vp39和极晚期基因p10的转录水平显著降低(P<0.05)。综上所述,BmNPVorf98基因对病毒复制是非必需的,但显著影响病毒的繁殖速度和包装(P<0.05);对病毒各个时期的基因转录也具有重要影响。
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