检索结果-内蒙古大学图书馆

高等学校化学学报 2007年第9期28卷 1701-1706页

作者：王丰刘进元清华大学生物科学与技术系分子生物学实验室教育部蛋白质科学重点实验室北京100084

将水稻PHGPx(OsPHGPx)的编码序列克隆到表达载体pGEX-6P-1上,并转化为大肠杆菌进行表达.通过GST亲和层析、离子交换层析和凝胶过滤层析,制备了可用于晶体学研究的OsPHGPx,其纯度超过95%,具备明显的PHGPx活性.质谱显示OsPHGPx的精确分子... 详细信息

将水稻PHGPx(OsPHGPx)的编码序列克隆到表达载体pGEX-6P-1上,并转化为大肠杆菌进行表达.通过GST亲和层析、离子交换层析和凝胶过滤层析,制备了可用于晶体学研究的OsPHGPx,其纯度超过95%,具备明显的PHGPx活性.质谱显示OsPHGPx的精确分子量为19642.5553,与理论分子量基本一致.OsPHGPx在多个晶体生长条件下出现微晶.三维结构同源建模显示OsPHGPx的结构为硫氧还蛋白折叠形式.

关键词：水稻谷胱甘肽磷脂氢过氧化物酶表达纯化晶体生长三维结构建模

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棉花脱水应答元件(DRE)结合蛋白GhDBP1的原核表达、纯化及其DNA结合活性(英文)

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生物化学与生物物理进展 2006年第3期33卷 247-253页

作者：黄波刘进元清华大学生物科学与技术系分子生物学实验室及教育部蛋白质科学重点实验室北京100084

棉花是一种重要的经济作物,其生产和产量要受到干旱、低温和高盐等环境胁迫的影响,因此提高棉花对这些胁迫的抗性非常重要.脱水应答元件(DRE-dehydrationresponsiveelement)结合蛋白(DBP)在调节植物对环境胁迫的抗性中起到非常重要的作... 详细信息

棉花是一种重要的经济作物,其生产和产量要受到干旱、低温和高盐等环境胁迫的影响,因此提高棉花对这些胁迫的抗性非常重要.脱水应答元件(DRE-dehydrationresponsiveelement)结合蛋白(DBP)在调节植物对环境胁迫的抗性中起到非常重要的作用.而且过量表达DBP类基因的转基因植株能够很好抵抗这些环境胁迫,所以研究棉花中此类DRE元件结合蛋白对棉花生产有非常重要的意义.在以前的工作中,从棉花中分离一个DBP基因,命名为GhDBP1并在转录水平上分析它在棉花植株中的表达特征.在研究中,报道了GhDBP1的原核表达、纯化和它的DNA结合特性.GhDBP1基因的编码区用PCR技术扩增出来插入到原核表达载体pET28a中,并转化到大肠杆菌菌株BL21(DE3)中.经过IPTG诱导,GhDBP1融合蛋白在BL21(DE3)菌株中成功进行表达.利用Ni-NTA亲和层析技术得到了纯化的融合蛋白.在非同位素的凝胶滞留实验中,纯化的GhDBP1融合蛋白能够结合到含有DRE元件的DNA片段上.另外,用SWISS-MODEL软件对GhDBP1蛋白的DNA结合区的三维结构进行了计算机模拟.模拟的结果显示,GhDBP1蛋白的DNA结合区的主链结构和折叠模式与已知的拟南芥GCC盒结合蛋白AtERF1的DNA结合区结构很相似.这些结果显示了GhDBP1是一个脱水应答元件(DRE)结合的转录因子,并可能运用与AtERF1的DNA结合区相似的结构和它的目标序列脱水应答元件(DRE)相结合.

关键词：棉花 DRE结合蛋白原核表达纯化凝胶滞留(EMSA) 同源建模

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水稻磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶在蛋白质水平上的组织和诱导表达特征(英文)

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生物化学与生物物理进展 2009年第1期36卷 77-82页

作者：李甜杨晓东刘进元清华大学生物科学与技术系分子生物学实验室及教育部蛋白质科学重点实验室北京100084

蛋白质是生命活动的主要承担分子,了解蛋白质在有机体中的时空分布对于正确解析蛋白质的功能十分重要.磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶(PHGPx)是目前发现的唯一能够直接还原膜上脂类过氧化物的抗氧化酶,在保护生物膜免受过氧化损伤方面有着重... 详细信息

蛋白质是生命活动的主要承担分子,了解蛋白质在有机体中的时空分布对于正确解析蛋白质的功能十分重要.磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶(PHGPx)是目前发现的唯一能够直接还原膜上脂类过氧化物的抗氧化酶,在保护生物膜免受过氧化损伤方面有着重要作用.采用Westernblot技术,分析了水稻PHGPx(OsPHGPx)在水稻不同组织以及多种胁迫条件下的蛋白质表达特征.结果表明,OsPHGPx在成熟水稻植株内主要分布于叶组织中,以旗叶中含量最高,而在水稻幼苗中则在茎及叶组织中均检测到较强的杂交信号.OsPHGPx在幼苗中的表达受到H2O2和NaCl的强烈诱导,但植物激素对其表达的影响较弱.H2O2和NaCl的诱导效果呈现出时间及剂量的相关性,当用0.5mmol/LH2O2处理12h或用500mmol/LNaCl处理24h,此时OsPHGPx表达量达到最大值.对H2O2清除剂二甲基硫脲处理的水稻幼苗,外源H2O2的再处理并不能诱导OsPHGPx的表达,而NaCl的诱导效果并不受影响,说明H2O2可能并不介导NaCl诱导OsPHGPx的表达.这些结果为进一步研究OsPHGPx在水稻中生物学功能奠定了基础.

关键词：水稻磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶蛋白质表达谱氧化胁迫盐胁迫

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两个水稻GDP-甘露糖-3′, 5′-异构酶基因特征及表达模式的研究

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生物化学与生物物理进展 2006年第4期33卷 368-376页

作者：杜盈姚远刘进元清华大学生物科学与技术系分子生物学实验室及教育部蛋白质科学重点实验室北京100084

GDP-甘露糖-3',5'-异构酶(GME)可以催化GDP-甘露糖转化为左旋GDP-半乳糖,该反应对于高等植物体内抗坏血酸的合成是非常重要的.但目前在分子水平上还没有对GME基因进行研究的报道.通过逆转录PCR(RT-RCR)技术从水稻成熟叶片中克... 详细信息

GDP-甘露糖-3',5'-异构酶(GME)可以催化GDP-甘露糖转化为左旋GDP-半乳糖,该反应对于高等植物体内抗坏血酸的合成是非常重要的.但目前在分子水平上还没有对GME基因进行研究的报道.通过逆转录PCR(RT-RCR)技术从水稻成熟叶片中克隆到两个GME基因的cDNA序列,并与其他植物物种中的GMEs进行比对,结果显示,GME基因在所有植物物种中高度保守,尽管进化树分析表明单子叶植物GMEs和双子叶植物GMEs在进化上相互独立.同时,分析这两个水稻GME基因的剪切模式揭示了二者也存在高度相似性.采用半定量RT-PCR技术对两个GME基因在不同组织和不同胁迫条件下的表达模式进行研究表明,OsGME1基因在冷胁迫条件下表达水平上调,这和先前水稻冷胁迫蛋白质组学研究的结果是一致的.而OsGME2和OsGME1基因在用赤霉素处理条件下表达水平均下调,暗示赤霉素可能通过调节GME基因的表达来调控植物体内的抗坏血酸合成.

关键词：植物抗坏血酸合成基因表达半定量RT-PCR技术

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用免疫亲和层析法纯化萝卜PHGPx天然蛋白(英文)

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生物化学与生物物理进展 2005年第8期32卷 794-799页

作者：杨晓东刘进元清华大学生物科学与技术系分子生物学实验室及教育部蛋白质科学重点实验室北京100084

萝卜磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶(RsPHGPx)是一个定位于线粒体的蛋白质.为了阐明该蛋白质线粒体定位信号的准确切割位点,采用了免疫亲和层析方法纯化天然的RsPHGPx.用重组RsPHGPx 蛋白免疫兔子获得了抗RsPHGPx 的多克隆抗血清,以重组RsPH ... 详细信息

萝卜磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶(RsPHGPx)是一个定位于线粒体的蛋白质.为了阐明该蛋白质线粒体定位信号的准确切割位点,采用了免疫亲和层析方法纯化天然的RsPHGPx.用重组RsPHGPx 蛋白免疫兔子获得了抗RsPHGPx 的多克隆抗血清,以重组RsPH G Px 蛋白为配体,采用亲和层析技术对抗血清进行了纯化,得到了单特异性的抗RsPHGPx 的抗体.将纯化好的抗体偶联到一个N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)预先激活的琼脂糖柱子上,装配成一个以单特异性的抗RsPHGPx 抗体为配体的免疫亲和层析柱.经过对纯化条件的摸索和优化,形成了一个简单、特异的一步法纯化方案.按照该方案,从萝卜幼苗线粒体总蛋白质提取物中纯化到一个分子质量与预期值相一致的特异蛋白质.免疫印迹分析表明,该蛋白质被抗RsPH G Px 的抗血清特异识别.酶活性分析表明,该蛋白质具有显著的PH G Px 活性.这些结果表明,纯化到的特异蛋白质是萝卜的RsPH G Px天然蛋白.这是首个关于定位于植物细胞器的PH G Px 蛋白纯化的报道.这一结果为准确测定RsPH G Px 信号肽的切割位点奠定了基础,并将有助于对植物PH G Px 的亚细胞定位机制及其生理功能的深入研究.

关键词：免疫亲和层析天然蛋白质多克隆抗体磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶萝卜

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萝卜磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶基因结构及其调控序列分析(英文)

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生物化学与生物物理进展 2005年第7期32卷 649-656页

作者：杨晓东刘进元清华大学生物科学与技术系分子生物学实验室及教育部蛋白质科学重点实验室北京100084

磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶(PHGPx)是谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)家族的重要一员,是目前已知能直接保护生物膜免受过氧化损伤的唯一酶类.此前的研究表明,萝卜磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶基因(RsPHGPx)编码一个有生理功能的过氧化物酶,并且RsPH... 详细信息

磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶(PHGPx)是谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)家族的重要一员,是目前已知能直接保护生物膜免受过氧化损伤的唯一酶类.此前的研究表明,萝卜磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶基因(RsPHGPx)编码一个有生理功能的过氧化物酶,并且RsPHGPx基因的表达可能受发育和环境胁迫信号的复杂调控.要深入了解该基因的表达调控机制首先必须阐明RsPHGPx基因的结构及其上游调控序列.DNA印迹表明萝卜RsPHGPx基因以单拷贝的形式存在于基因组中.以基因组DNA为模板,通过常规PCR与染色体步行相结合的方法克隆到了一段3.3kb长的RsPHGPx基因组序列.分析发现,该基因由7个外显子和6个内含子组成,所有内含子的剪切位点均符合真核生物GT-AG规则.另外还发现该基因的上游基因是生物素合成酶基因;位于RsPHGPx基因上游的调控序列只有不足300bp.这些结构特征与拟南芥AtGPX3基因极其相似.顺式作用元件的数据库搜索发现RsPHGPx基因的上游调控序列含有多个响应激素(如E-Box和W-Box)、胁迫(如转录因子MYB和MYC的结合位点)和光(如BoxⅡ和Ⅰ-Box)信号的元件.RNA印迹分析表明RsPHGPx基因的表达受到脱落酸(ABA)和连续光照(在黄化苗中)处理的负调控,受到冷胁迫(4℃)的正调控,这暗示了预测的顺式作用元件的调控作用.然而,除草剂paraquat对该基因表达的正调控作用,暗示了某些与氧化胁迫相关的未知元件的存在.这些结果进一步印证了RsPHGPx基因的表达受发育和环境胁迫信号复杂调控的推测.这是迄今为止首个关于植物PHGPx基因结构和上游调控序列的系统报道,为今后全面认识植物PHGPx基因的表达调控机制奠定了必要基础.

关键词：萝卜磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶基因结构上游调控序列顺式作用元件

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植物MicroRNA

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中国生物化学与分子生物学报 2006年第8期22卷 609-614页

作者：金龙国王川刘进元清华大学生物科学与技术系分子生物学实验室及教育部蛋白质科学重点实验室北京100084

MicroRNA(miRNA)是一类长度约为22个核苷酸的内源单链非编码RNA,在结构上相当保守,因而可以借助生物信息学方法进行预测.从2002年证实miRNA在植物中的存在以来,关于植物miRNA的研究进展异常迅速,短短几年内就已发现200多种.植物miRNA主... 详细信息

MicroRNA(miRNA)是一类长度约为22个核苷酸的内源单链非编码RNA,在结构上相当保守,因而可以借助生物信息学方法进行预测.从2002年证实miRNA在植物中的存在以来,关于植物miRNA的研究进展异常迅速,短短几年内就已发现200多种.植物miRNA主要通过切割靶mRNA,或抑制靶mRNA翻译,来调控植物个体生长发育并影响其生理过程,是一种新的基因调控方式.本文将就植物miRNA的形成、特征、作用机制、生物功能及其与siRNA的关系进行综述.

关键词：植物miRNA Dicer酶 RISC 基因表达调控 siRNA

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棉花中一个类DREB1/CBF基因(GhDREB1L)的分子克隆及其功能分析

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中国科学（C辑） 2006年第5期36卷 390-397页

作者：黄波金龙国刘进元清华大学生物科学与技术系分子生物学实验室及教育部蛋白质科学重点实验室北京100084

DREB1/CBF类转录因子在植物抵抗外界环境胁迫上起到非常重要的作用,而且对于利用基因工程技术来提高植物的抗逆性也非常有用.从棉花中分离出一个编码DREB1/CBF类蛋白(GhDREB1L)的cDNA,并对该蛋白质的序列特性、DNA结合特性及转录本的表... 详细信息

DREB1/CBF类转录因子在植物抵抗外界环境胁迫上起到非常重要的作用,而且对于利用基因工程技术来提高植物的抗逆性也非常有用.从棉花中分离出一个编码DREB1/CBF类蛋白(GhDREB1L)的cDNA,并对该蛋白质的序列特性、DNA结合特性及转录本的表达特征进行了分析.GhDREB1L含有一个保守的AP2/ERF结构域,其氨基酸序列与其他植物中DREB家族的DREB1/CBF组成员高度相似.采用Ni-NTA亲和层析技术,成功纯化了在BL21(DE3)菌株中表达的GhDREB1L蛋白的DNA结合区.凝胶滞留实验揭示,纯化的GhDREB1L融合蛋白能够特异性地与已经得到鉴定的DRE元件(核心区,ACCGAC)以及胚胎发育晚期丰富蛋白基因LEAD113启动子区中的类DRE元件(核心区,GCCGAC)结合.半定量RT-PCR显示GhDREB1L基因在棉花子叶中受到低温、干旱以及NaCl处理的诱导.这些结果暗示了棉花GhDREB1L转录因子可能是通过与DRE元件的结合,在低温、干旱及高盐的应答途径中起重要作用.

关键词：棉花DREB1/CBF低温干旱 LEA D113

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水稻金属硫蛋白基因家族成员对铅胁迫的应答及其在铅敏感酵母中的功能互补

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科学通报 2007年第12期52卷 1419-1424页

作者：徐玉凤周功克周露李一勤刘进元清华大学生物科学与技术系分子生物学实验室教育部蛋白质科学重点实验室北京100084

金属硫蛋白(metallothionein,MT)是一类低分子量、富含半胱氨酸(Cys)、具有金属结合能力的蛋白质.采用Northern杂交分析了水稻幼苗中重金属铅离子对10个水稻MT基因表达的影响.结果显示,在根中,除了OsMT-Ⅰ-3b不表达外,其他9个基因的表... 详细信息

金属硫蛋白(metallothionein,MT)是一类低分子量、富含半胱氨酸(Cys)、具有金属结合能力的蛋白质.采用Northern杂交分析了水稻幼苗中重金属铅离子对10个水稻MT基因表达的影响.结果显示,在根中,除了OsMT-Ⅰ-3b不表达外,其他9个基因的表达均不同程度地受到Pb2+的影响,其中OsMT-Ⅰ-1a,OsMT-Ⅰ-1b,OsMT-Ⅰ-2c,OsMT-Ⅰ-4a,OsMT-Ⅰ-4b和OsMT-Ⅰ-4c的表达大幅度增加,OsMT-Ⅰ-2a和OsMT-Ⅰ-3a的表达有所增加,而OsMT-Ⅰ-2b的表达则受到了抑制.相比之下,地上部分Pb2+只对其中的6个基因的表达有一定的诱导效应,对OsMT-Ⅰ-1a,OsMT-Ⅰ-1b,OsMT-Ⅰ-4a及OsMT-Ⅰ-4b的表达没有明显作用.分别把这10个基因在Pb2+敏感的酵母突变体中异源表达,结果表明,表达OsMT-Ⅰ基因的酵母细胞都在一定程度上提高了对Pb2+的耐受性.上述结果揭示了Pb2+影响OsMT基因家族各成员在水稻幼苗中表达的特征,以及OsMT-Ⅰs可以增强酵母突变体铅耐受性的描述,同时也为进一步研究水稻MT基因家族应答Pb2+的分子机制奠定了基础.

关键词：水稻金属硫蛋白基因家族 Pb^2+ 诱导表达酵母耐受性

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棉花半乳糖苷酶基因启动子的分离及其在转基因烟草中的表达

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中国科学（C辑） 2005年第5期35卷 389-397页

作者：吴蔼民刘进元分子生物学实验室及教育部蛋白质科学重点实验室清华大学生物科学与技术系北京100084

β-半乳糖苷酶(β-galactosidase,EC3.2.1.23)由植物中广泛分布的一类糖基水解酶组成,被认为与细胞壁多糖的代谢相关.棉花(Gossypiumhirsutum)β-半乳糖苷酶基因已被成功分离,被命名为***杂交实验显示该基因在棉花纤维发育的伸长期优势... 详细信息

β-半乳糖苷酶(β-galactosidase,EC3.2.1.23)由植物中广泛分布的一类糖基水解酶组成,被认为与细胞壁多糖的代谢相关.棉花(Gossypiumhirsutum)β-半乳糖苷酶基因已被成功分离,被命名为***杂交实验显示该基因在棉花纤维发育的伸长期优势表达.为了分析GhGal1基因的时空表达调控,本研究构建了GhGal1启动子区域(1770bp)与β-葡糖醛酸糖苷酶(glucuronidase,GUS)基因融合的双元载体,通过农杆菌转化烟草植株.对转基因植株分析的结果表明:此转基因果实中的GUS活性比阴性和阳性对照的活性高.GUS组织定位分析表明:β-半乳糖苷酶基因能在根组织的分生区、子叶、维管束组织、果实和表皮毛中表达.此外,调控区域的序列分析揭示该序列含有一些果实/种子特异表达以及与表皮毛表达相关的保守元件.这些结果显示了GhGal1启动子在转基因烟草植株中的时空表达特征,并提供了GhGal1基因参与棉花纤维发育的一些重要线索.

关键词：棉花 β半乳糖苷酶转基因烟草启动子活性基因表达

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