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系统性红斑狼疮患者外周血单个核细胞中HCMV基因表达谱及其特异性抗体特征

病毒学报 2023年第1期39卷 113-123页

作者：施昕妤谢尚丹项超丽李宝青陈朝生薛向阳章慧娣温州医科大学基础医学院、分子病毒学与免疫学研究所、微生物与免疫学教研室温州325000 浙江大学医学院免疫研究所杭州310000 温州医科大学附属第二医院温州325000 温州医科大学附属第一医院温州325000

人类巨细胞病毒(Human cytomegalovirus,HCMV)感染是系统性红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus,SLE)的重要病因,并会加剧疾病进展。然而,SLE患者外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)中HCMV基因的表达谱及其特异性抗体特征尚未完全阐明,并且HCMV蛋白特异性抗体水平与SLE患者临床特征的相关性尚未得到证实。通过Poly(A)建库的mRNA转录组测序(Poly(A)RNA-Seq)检测3例SLE患者和3例健康对照者(Healthy control,HC)的PBMC中的HCMV基因表达谱。然后在10例SLE患者和10例HC的链特异性建库的mRNA转录组测序(strand-specific RNA-seq)结果中验证检测到的HCMV基因。除此之外,通过免疫信息学分析筛选HCMV基因的B细胞表位。ELISA用于检测120例SLE患者和75例HC血清中的HCMV特异性抗体水平,并将其与患者的临床特征相关联。本研究在SLE患者和HC的PBMC中检测到8个HCMV基因。免疫信息学分析筛选出7个HCMV基因的优势B细胞表位。与HC相比,SLE患者血清中UL32和UL82特异性抗体显著降低。UL32特异性抗体可能与SLE患者血细胞功能异常有关。UL82特异性抗体可能参与SLE患者免疫系统功能异常和肾脏功能障碍。受试者工作特征曲线(Receiver operating characteristic,ROC)分析表明,其中UL32特异性抗体可以有效区分SLE患者和HC。

关键词：人巨细胞病毒系统性红斑狼疮外周血单个核细胞 B细胞表位

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沙眼衣原体Pgp3多克隆抗体的制备及鉴定

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温州医科大学学报 2024年第3期54卷 184-189页

作者：周璐琪杨佳李洋朱珊丽温州医科大学基础医学院微生物学与免疫学教研室分子病毒与免疫研究所浙江温州325035

目的:制备沙眼衣原体(Ct)Pgp3蛋白的兔多克隆抗体,并检测其生物学功能。方法:采用原核表达系统制备Pgp3蛋白,通过镍柱亲和纯化Pgp3蛋白并进行复性。将复性的Pgp3蛋白经皮下多点注射免疫家兔制备兔多克隆抗体,利用ELISA和Western blot法... 详细信息

目的:制备沙眼衣原体(Ct)Pgp3蛋白的兔多克隆抗体,并检测其生物学功能。方法:采用原核表达系统制备Pgp3蛋白,通过镍柱亲和纯化Pgp3蛋白并进行复性。将复性的Pgp3蛋白经皮下多点注射免疫家兔制备兔多克隆抗体,利用ELISA和Western blot法检测抗体的效价和特异性。随后建立Ct感染HeLa细胞模型,通过间接免疫荧光法和非变性Western blot法检测兔多克隆抗体对天然Pgp3蛋白的特异性识别能力。结果:Pgp3重组蛋白成功诱导表达,且主要以包涵体形式存在。ELISA显示制备的兔多克隆抗体效价可达1:512000,Western blot法和间接免疫荧光法显示Pgp3兔多克隆抗体可以特异性识别重组及天然Pgp3蛋白。结论:制备的Pgp3多克隆抗体效价高,能特异性识别重组Pgp3蛋白及天然Pgp3蛋白,为Pgp3蛋白功能的研究及Ct免疫制剂的研发等奠定基础。

关键词：沙眼衣原体多克隆抗体 Pgp3

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新型冠状病毒PLpro蛋白酶结构与功能的生物信息学分析

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病毒学报 2021年第1期37卷 43-51页

作者：杜倩倩张智慧廉政张庆媛薛向阳张丽芳蒋朋飞温州医科大学基础医学院微生物学与免疫学教研室分子病毒与免疫研究所温州325035 温州医科大学病毒研究院温州325035

2019年12月,由新型冠状病毒(SARS-CoV-2)引起的新型冠状病毒肺炎(COVID-19)在中国武汉暴发。SARS-CoV-2的基因组编码2种病毒蛋白酶,即木瓜样蛋白酶(Papain-like protease,PLpro)和3C样蛋白酶(3C-like protease)。其中PLpro是SARS-CoV-2复制酶复合体(RC)形成的重要调节蛋白分子,对于病毒基因组转录和复制至关重要。因此,将SARS-CoV-2 PLpro作为药物的靶点对COVID-19的治疗具有积极意义。本研究应用生物信息学工具分析新型冠状病毒的木瓜样蛋白酶的结构和功能,首先利用BLAST和BioEdit获取SARS-CoV-2 PLpro蛋白酶(SC2-PLpro)及其同源蛋白的氨基酸序列,并利用BLAST和MEGA 6.0进行同源性分析。之后,利用ProParam和Proscale分别对SC2-PLpro蛋白酶的理化性质、亲水性和疏水性进行分析。然后,通过SOMPA、ScanProsite和InterPro分别预测SC2-PLpro蛋白酶的二级结构和功能区域,进一步利用SignalP 4.0和TMHMM对SC2-PLpro蛋白酶的信号肽和跨膜区进行分析。最后,通过SWISS-MODEL对SARS-CoV-2 PLpro蛋白酶进行三级结构同源建模。结果显示,对SARS-CoV-2 PLpro蛋白酶与已报道的PLpro蛋白酶进行多序列比对后,发现SARS-CoV-2 nsp3的746~1063段氨基酸与多种冠状病毒PLpro蛋白酶氨基酸序列高度相似。同时,同源性分析发现SARS-CoV-2与蝙蝠冠状病毒的PLpro蛋白酶具有同源性,其中与QHR63299、AVP78030相似性最高。对SC2-PLpro进行理化性质预测结果显示,其由318个氨基酸所组成,为稳定亲水性蛋白。二级结构预测结果显示SC2-PLpro主要含有α-螺旋、延伸链、β-转角、无规卷曲,四种结构贯穿整条氨基酸链。进一步进行功能分析,发现其具有完整的催化三联体、锌结合域、泛素样N末端结构域,故推测该蛋白具有去泛素化的功能。然后,信号肽假说和跨膜结构域分析结果表明,SC2-PLpro既不是分泌蛋白,也不属于跨膜蛋白。本研究提示,生物信息学分析SC2-PLpro为稳定性亲水蛋白,属于非跨膜蛋白,比较保守,具有去泛素化的功能,利用此功能可以进一步规避宿主的固有免疫反应。通过制备PLpro蛋白酶小分子抑制剂,可能有助于治疗新型冠状病毒肺炎。

关键词：新型冠状病毒(SARS-CoV-2) 木瓜样蛋白酶(PLpro蛋白酶) 结构功能生物信息学新型冠状病毒肺炎(COVID-19)

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基于NK相关基因的急性髓细胞白血病预后风险评估模型的建立

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温州医科大学学报 2024年第7期54卷 563-573页

作者：梅殿凤项丹毛晨晨周海霞薛向阳朱珊丽温州医科大学基础医学院微生物学与免疫学教研室分子病毒与免疫研究所浙江温州325035 温州医科大学附属第二医院育英儿童医院儿科研究室温州市儿童血液肿瘤疾病研究重点实验室浙江温州325027

目的:通过分析NK细胞相关基因(NRGs)在急性髓细胞白血病(AML)中的表达模式及其与预后的关系,构建新型风险评分模型以评估AML患者的预后。方法:基于生物信息学的方法下载TCGA数据库中AML转录组数据。根据NRGs的表达不同,通过无监督聚类将... 详细信息

目的:通过分析NK细胞相关基因(NRGs)在急性髓细胞白血病(AML)中的表达模式及其与预后的关系,构建新型风险评分模型以评估AML患者的预后。方法:基于生物信息学的方法下载TCGA数据库中AML转录组数据。根据NRGs的表达不同,通过无监督聚类将AML患者分组,并分别分析不同亚组AML患者的生存差异、基因功能富集情况和免疫相关分析。根据亚组的差异表达基因,通过Cox生存分析以及LASSO回归分析构建基于NRGs的预后评估模型。最后收集AML患者的骨髓样本进行转录组测序,进一步验证预后评估模型中各基因与AML的相关性。结果:单因素Cox筛选与预后相关的NRGs,并根据其表达情况将AML患者分成3个亚组。生存分析以及富集分析、免疫浸润分析、免疫检查点分析均发现亚组2具有更好的临床预后,并且免疫微环境明显重塑。进一步根据三个亚组的差异表达基因,通过Cox联合LASSO回归分析构建风险评分模型,此风险评分模型与AML的临床预后显著相关。临床病例的转录组测序结果表明,风险模型的6个AML危险基因中,ADGRG1、LSP1、PDE7B在复发患者中的表达量较缓解患者上调,保护基因TBX1的表达量则下调。结论:本研究构建的AML患者风险评分模型可作为一种新的预后评估手段,具有较好的预测价值。

关键词：急性髓细胞白血病 NK细胞相关基因风险评估模型肿瘤免疫微环境

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E型沙眼衣原体主要外膜蛋白多克隆抗体的制备及鉴定

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中国生物制品学杂志 2020年第9期33卷 1014-1018,1022页

作者：李明洋魏荷婷陈天枫胡瑜沈玉婷董海艳朱珊丽张丽芳温州医科大学分子病毒与免疫研究所微生物学与免疫学教研室浙江温州325035 温州医科大学精神医学学院浙江温州325035 温州医科大学仁济学院浙江温州325035

目的制备E型沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,Ct)主要外膜蛋白(major outer membrane protein,MOMP)多克隆抗体,并在体外检测其生物学特性。方法通过分子克隆方法构建重组表达质粒pET21a(+)/MOMP,转化*** BL21(DE3),IPTG诱导表达重组MOMP蛋白,经镍螯合亲和层析胶纯化后,经皮下多点注射免疫日本大耳白兔,制备兔多克隆抗体,分别采用ELISA和Western blot法检测抗体的效价和特异性。在HeLa细胞中培养E血清型Ct,通过卢戈和吉姆萨染色法观察细胞中Ct包涵体的形成情况,间接免疫荧光法检测制备的MOMP多克隆抗体对Ct天然MOMP的结合特异性。结果Ct MOMP可在原核表达系统中高效表达;制备的兔抗MOMP多克隆抗体ELISA效价可达1∶256000,可特异性结合、识别融合及天然的Ct MOMP。结论制备的兔抗Ct MOMP多克隆抗体效价高、特异性强,为后续进一步研究Ct的致病机制及开发新的免疫诊断制剂奠定了基础。

关键词：沙眼衣原体主要外膜蛋白多克隆抗体

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人巨细胞病毒US31蛋白的特异性抗体的制备及鉴定

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中国卫生检验杂志 2020年第17期30卷 2102-2105,2108页

作者：李宝青项超丽谢尚丹施昕妤郭刚强薛向阳温州医科大学附属第二医院浙江温州325000 温州医科大学第二临床医学院浙江温州325000 温州医科大学微生物学和免疫学教研室分子病毒与疫苗研究所热带医学研究所浙江温州325000

目的制备人巨细胞病毒(HCMV)US31原核表达蛋白及其多克隆抗体。方法HCMV US31基因经原核密码子优化后进行全基因合成,克隆至p ET21a(+)原核表达载体,构建p ET21a(+)/HCMV US31重组质粒,测序鉴定;将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG... 详细信息

目的制备人巨细胞病毒(HCMV)US31原核表达蛋白及其多克隆抗体。方法HCMV US31基因经原核密码子优化后进行全基因合成,克隆至p ET21a(+)原核表达载体,构建p ET21a(+)/HCMV US31重组质粒,测序鉴定;将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导目的蛋白表达,Ni-NTA亲和层析法纯化US31蛋白,免疫新西兰兔制备多克隆抗体,ELISA、Western blot及免疫荧光方法检测抗体效价和特异性。结果在大肠杆菌中诱导出高表达的HCMV US31融合蛋白,经镍柱亲和纯化后获得高纯度的目的蛋白;免疫新西兰兔诱导产生特异性的Ig G抗体,效价为1∶49600;经ELISA、Western blot以及免疫荧光均证实制备的特异性抗体可识别细胞中表达的US31蛋白。结论成功制备了HCMV US31蛋白及特异性抗体,为进一步研究US31蛋白的生物学功能奠定了基础。

关键词：人巨细胞病毒 US31蛋白多克隆抗体

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趋化因子CXCL14在SLE患者外周血单个核细胞中的表达及启动子甲基化分析

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中国应用生理学杂志 2017年第3期33卷 197-201页

作者：王金丹黄茜茜叶璐璐范超凡郭刚强徐玲娟薛向阳盛秀胜温州医科大学检验医学院、生命科学院浙江温州325035 温州医科大学第二临床医学院浙江温州325035 温州医科大学微生物学和免疫学教研室分子病毒与疫苗研究所热带医学研究所浙江温州325035 金华市中医医院检验科浙江金华321017 金华职业技术学院医学院浙江金华321017

目的:分析趋化因子CXCL14在系统性红斑狼疮(SLE)患者外周血单个核细胞(PBMC)中的表达及其启动子甲基化特征。方法:收集28例SLE患者和20名健康人外周血单个核细胞(PBMC)标本,抽提细胞中RNA,逆转录后,以GAPDH为内参,通过定量PCR检测PBMC中... 详细信息

目的:分析趋化因子CXCL14在系统性红斑狼疮(SLE)患者外周血单个核细胞(PBMC)中的表达及其启动子甲基化特征。方法:收集28例SLE患者和20名健康人外周血单个核细胞(PBMC)标本,抽提细胞中RNA,逆转录后,以GAPDH为内参,通过定量PCR检测PBMC中CXCL14的表达,统计分析CXCL14表达水平与SLE各种临床资料的相关性,探讨PBMC中CXCL14表达与SLE的关系,通过重亚硫酸盐修饰的全基因组DNA用以BSP测序来明确不同标本中CXCL14启动子中甲基化位点的甲基化率。结果:CXCL14在SLE患者和正常人PBMC中的表达量存在显著差异(P<0.05)。与健康人PBMC中CXCL14的含量相比较,CXCL14在SLE患者PBMC中表达量显著降低。与进一步CXCL14表达水平与SLE各种临床资料的相关性分析显示,CXCL14表达水平与SSB抗体(干燥综合征B抗体)、蛋白尿及血小板计数相关。与SSB抗体阴性SLE患者比较,SSB抗体阳性患者CXCL14表达水平更低(P<0.05);与蛋白尿阴性SLE患者相比,蛋白尿阳性患者CXCL14表达水平更低(P<0.05);而血小板升高患者的CXCL14表达水平更高(P<0.05)。CXCL14表达水平与SLE活动、肾损害指标、抗ds-DNA、C反应蛋白(CRP)、补体C3水平等指标未见显著相关性。CXCL14启动子区甲基化分析显示,SLE患者Cp G岛甲基化明显高于正常对照。结论:PBMC中低表达的CXCL14与SLE发生发展相关,其启动子区Cp G岛过度甲基化是SLE患者CXCL14低表达的重要机制。

关键词：系统性红斑狼疮趋化因子 CXCL14 甲基化

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人巨细胞病毒US31基因序列特征分析及B细胞表位预测

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温州医科大学学报 2016年第11期46卷 781-786页

作者：郭刚强谢尙丹叶思思孙祥威张良张丽芳薛向阳温州医科大学微生物学与免疫学教研室分子病毒与免疫研究所热带医学研究所浙江温州325035 温州医科大学第二临床医学院浙江温州325035 温州医科大学附属第一医院胃肠外科浙江温州325015

目的：分析人巨细胞病毒（HCMV）US31基因序列，预测US31基因编码蛋白的B细胞优势表位。方法：基于US31基因编码蛋白的氨基酸序列，结合亲水性参数、可及性参数、抗原性参数、柔韧性参数及二级结构方案对HCMVUS31基因编码各型蛋白的B细... 详细信息

目的：分析人巨细胞病毒（HCMV）US31基因序列，预测US31基因编码蛋白的B细胞优势表位。方法：基于US31基因编码蛋白的氨基酸序列，结合亲水性参数、可及性参数、抗原性参数、柔韧性参数及二级结构方案对HCMVUS31基因编码各型蛋白的B细胞表位进行预测，参照已建立的预测方法综合评价US31基因B细胞优势表位。结果：US31核苷酸序列变异较少，大部分是同义突变，氨基酸序列高度保守；其编码蛋白全长为162个氨基酸，相对分子质量20kD，等电点7.66，为可溶性蛋白，二级结构中以无规则卷曲为主。经综合分析，US31基因的B细胞优势表位可能存在于氨基酸序列N端的5～19、32～47、58～68、110～124区段。结论：多参数预测HCMVpUS31的B细胞优势表位，为进一步研究蛋白特征、制备单克隆抗体及表位疫苗提供依据。

关键词：人巨细胞病毒 US31基因 B细胞表位

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HPV16型E6蛋白的B细胞线性表位预测及分析

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中国病原生物学杂志 2015年第3期10卷 220-223,227页

作者：杨恩张燕侯柏龙杜王琪张丽芳温州医科大学第一临床医学院浙江温州325035 温州医科大学分子病毒与免疫研究所微生物学与免疫学教研室

目的对高危型人乳头瘤病毒(Human papillomavirus)16型E6蛋白的B细胞线性表位进行预测。方法以HPV16型E6蛋白(P03126)的全长氨基酸序列为基础,采用EXPASY网站上的生物信息学软件和DNAstar软件包中的Protean软件分析E6蛋白的二级结构,跨... 详细信息

目的对高危型人乳头瘤病毒(Human papillomavirus)16型E6蛋白的B细胞线性表位进行预测。方法以HPV16型E6蛋白(P03126)的全长氨基酸序列为基础,采用EXPASY网站上的生物信息学软件和DNAstar软件包中的Protean软件分析E6蛋白的二级结构,跨膜趋势及其亲水性,表面可及性,抗原性,极性和柔韧性等特性。综合以上参数预测HPV16型E6蛋白的B细胞线性表位,并进一步进行同源性匹配分析。结果综合多个参数分析显示B细胞线性表位可能位于E6蛋白N端2-7、9-19、30-36、45-49、105-109、119-125和148-158区段及其附近,进一步同源性匹配分析支持其中区段2-7、9-19、119-125及148-158为可能的B细胞线性表位,其中区段148-158(RSSRTRRETQL)为HPV16型E6蛋白所特有的序列,而区段2-7(HQKRTA)、9-19(FQDPQERPRKL)与HPV9型E6蛋白具有同源性,区段119-125(PEEKQRH)与HPV31型E6蛋白具有同源性。结论综合分析预测HPV16型E6蛋白的B细胞线性表位可能位于E6蛋白N端2-7、9-19、119-125及148-158区段,为HPV16型E6蛋白的进一步研究奠定了基础。

关键词： HPV16型 E6蛋白 B细胞线性表位预测同源性匹配分析

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宫颈肿瘤组织高危型HPV新分型检测方法的建立及应用

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肿瘤学杂志 2015年第11期21卷 889-894页

作者：谢旺凯王慧静肖兰兰计苏惠王俭陈向敏邹阮敏陈俊薛向阳温州医科大学第二临床学院浙江温州325035 温州医科大学检验医学院生命科学学院浙江温州325035 温州医科大学附属第一医院浙江温州325000 温州医科大学微生物学与免疫学教研室分子病毒与免疫研究所热带医学研究所浙江温州325035

[目的]建立一种新型宫颈肿瘤组织高危型人乳头瘤病毒(HPV)检测及分型方法,并评价其临床应用。[方法]基于我国人群流行的5种高危型HPV(HPV 16、18、31、33、51)的E6/E7早期基因序列,设计特异性引物,以明确HPV型别的宫颈癌细胞株及宫颈肿... 详细信息

[目的]建立一种新型宫颈肿瘤组织高危型人乳头瘤病毒(HPV)检测及分型方法,并评价其临床应用。[方法]基于我国人群流行的5种高危型HPV(HPV 16、18、31、33、51)的E6/E7早期基因序列,设计特异性引物,以明确HPV型别的宫颈癌细胞株及宫颈肿瘤组织为模板,进行PCR检测,结合基因测序验证引物的特异性。进一步优化条件,建立高危型HPV多重PCR检测方法,检测65例宫颈肿瘤组织标本,与临床上使用的流式荧光杂交HPV检测法比较,评价其敏感性和特异性。[结果]成功建立可同时检测5种高危型HPV的多重PCR检测方法,对65例宫颈肿瘤组织进行高危型HPV检测,检出率为72.3%,明显高于临床流式荧光杂交检测法的检出率(32.31%)(χ2=3.86,P<0.05)。[结论 ]基于HPV E6/E7早期基因的高危型HPV多重PCR检测方法是特异、灵敏的高危型HPV检测方法。

关键词：人乳头瘤病毒多聚酶链反应基因分型宫颈肿瘤

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