检索结果-内蒙古大学图书馆

中国病理生理杂志 2012年第10期28卷 1910-1916页

作者：李祥金爱慧邹立林高基民吕建新温州医学院浙江省医学遗传学重点实验室浙江省模式生物技术与应用重点实验室浙江温州325035

目的:利用杆状病毒表面展示系统对丙型肝炎病毒(HCV)进行早期检测。方法:利用杆状病毒表面展示(baculovirus surface display)技术,构建展示HCV结构蛋白的重组杆状病毒vAc-Flag-HCV C-GP64、vAc-Flag-HCV E-GP64和vAc-Flag-CE-GP64。结果:(1)Western blotting分析结果表明重组杆状病毒表达了C(HCV核心蛋白)、E(HCV包膜蛋白)和CE蛋白。(2)激光共聚焦显微镜检测结果表明,重组杆状病毒感染昆虫细胞Sf9后在昆虫细胞膜上表达了C、E和CE蛋白。(3)免疫金电子显微镜观察表明重组蛋白展示在杆状病毒囊膜上。(4)重组病毒进行浓缩纯化后,利用时间分辨荧光免疫分析(TRFIA)技术对HCV样本进行检测,vAc-Flag-CE-GP64的检测阳性率可达80.2%。结论:vAc-Flag-CE-GP64可用于对HCV进行早期检测。

关键词：肝炎病毒,丙型杆状病毒表面展示时间分辨荧光免疫分析

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丙型肝炎病毒Core蛋白类病毒颗粒的表达及纯化

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中国老年学杂志 2012年第21期32卷 4700-4703页

作者：李祥邹立林吕建新高基民温州医学院浙江省医学遗传学重点实验室浙江省模式生物技术与应用重点实验室浙江温州325035

目的通过PCR将丙肝病毒(HCV)Core与蜂毒素信号肽(Mel)进行融合,构建到pIZ/V5载体上获得pIZ/V5-Core-Mel表达载体。方法将pIZ/V5-Mel-core稳定转染Sf9细胞,经Zeocin抗性筛选,获得单克隆抗性细胞株。RT-PCR检测结果表明获得稳定表达Mel-c... 详细信息

目的通过PCR将丙肝病毒(HCV)Core与蜂毒素信号肽(Mel)进行融合,构建到pIZ/V5载体上获得pIZ/V5-Core-Mel表达载体。方法将pIZ/V5-Mel-core稳定转染Sf9细胞,经Zeocin抗性筛选,获得单克隆抗性细胞株。RT-PCR检测结果表明获得稳定表达Mel-core的细胞系Sf9-Core。对稳定细胞系Sf9-Core的上清进行离心纯化并Western印迹检测。结果在上清离心纯化的样品中有HCV Core形成的类病毒颗粒(VLPs)。透射电镜显示Core蛋白能自组装成直径约30 nm的球形颗粒。结论该研究成功构建了HCV Core与蜂毒素信号肽的融合蛋白并在Sf9细胞稳定表达,在细胞培养的上清中获得了VLPs。

关键词：丙型肝炎病毒 Core蛋白类病毒颗粒

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用于时间分辨荧光免疫分析的结核分枝杆菌培养滤液蛋白10参照品的制备

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南方医科大学学报 2011年第6期31卷 955-959页

作者：郭芳芳邹立林吴英松胡志明李金龙吕建新高基民南方医科大学生物技术学院生物治疗研究所广东广州510515 温州医学院浙江省医学遗传学重点实验室/浙江省模式生物技术与应用重点实验室浙江温州325035

目的通过基因工程技术制备结核分枝杆菌培养滤液蛋白10(CFP10)、链亲和素(SA)/CFP10融合蛋白(包括SA-CFP10、CFP10-SA),筛选灵敏度最高、稳定性最好者作为时间分辨荧光免疫分析法检测(TRFIA)的参考标准品。方法以结核分枝杆菌H37Rv标准... 详细信息

目的通过基因工程技术制备结核分枝杆菌培养滤液蛋白10(CFP10)、链亲和素(SA)/CFP10融合蛋白(包括SA-CFP10、CFP10-SA),筛选灵敏度最高、稳定性最好者作为时间分辨荧光免疫分析法检测(TRFIA)的参考标准品。方法以结核分枝杆菌H37Rv标准株基因组为模板,扩增CFP10基因,将其克隆到pET24b、pET24b-SA、pET21a-SA三种载体中,转化到大肠杆菌Rosetta中进行表达,表达产物经镍离子亲和层析(Ni-NTA)柱纯化,透析法复性。三种重组蛋白用双抗体夹心法TRFIA从灵敏度、稳定性两方面进行评价。结果成功构建了pET24b-CFP10、pET24b-SA-CFP10和pET21a-CFP10-SA三种表达载体,重组蛋白CFP10主要为可溶形式表达,融合蛋白CFP10-SA、SA-CFP10均以包涵体形式存在,Ni-NTA柱纯化后透析复性,纯度均可达90%以上。三种重组蛋白经双抗体夹心TRFIA,CFP10-SA灵敏度最高(0.02μg/L),稳定性最好。结论得到了灵敏度高、稳定性好的TRFIA检测CFP10的参照品CFP10-SA融合蛋白,为研制该结核分支杆菌时间分辨荧光诊断试剂盒,并应用于临床打下了基础。

关键词：结核分枝杆菌培养滤液蛋白10 时间分辨荧光分析法

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SA／hIL-15融合蛋白的制备及生物学活性鉴定

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南方医科大学学报 2009年第3期29卷 397-401页

作者：苏华陈艳丽陈素云余宏盛文波胡志明高基民温州医学院浙江省医学遗传学重点实验室浙江温州325035 南方医科大学生物技术学院广东广州510515

目的制备链亲和素(SA)/人白细胞介素-15(hIL-15)融合蛋白SA-hIL15和hIL-15-SA,并鉴定其生物学活性。方法构建原核表达质粒pET24a-6His-SA-hIL-15和pET32a-hIL-15-SA-6His,转化大肠杆菌BL21(DE3),用镍金属螯合(Ni-NTA)层析柱进行纯化,并对其进行复性。CCK-8检测融合蛋白PHA刺激的人外周血淋巴细胞增殖的活性,流式细胞仪分析融合蛋白对生物素化的B16.F10细胞锚定修饰率。结果成功构建了两种重组融合蛋白的表达质粒并在大肠杆菌实现了高效表达,目标蛋白的表达约占细菌总蛋白的20%。经纯化、复性的SA/hIL-15融合蛋白具有双重活性,即:能促进PHA激活的人外周血淋巴细胞增殖的hIL-15活性,和SA介导的高效结合至表面已生物素化的B16.F10肿瘤细胞的功能(表面锚定修饰效率大于95%)。SA-hIL-15双功能融合蛋白促进PHA激活的人外周血淋巴细胞增殖活性高于hIL-15-SA双功能融合蛋白。结论SA/hIL-15双功能融合蛋白的制备为hIL-15表面锚定修饰的肿瘤细胞疫苗的研制打下了基础。

关键词：白细胞介素-15 链亲和素融合蛋白

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SA/mIL15双功能融合蛋白的制备及其生物学鉴定

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细胞与分子免疫学杂志 2010年第2期26卷 107-110页

作者：陈艳丽许晓玲唐佳聂小霞宋志纯胡志明高基民温州医学院浙江省医学遗传学重点实验室浙江温州325035 南方医科大学生物技术学院生物治疗研究所广东广州510515

目的:制备链亲和素(SA)标记的鼠白细胞介素-15融合蛋白SA-mIL15和mIL15-SA,并研究其生物学功能。方法:构建pET24a-SA-L-mIL15和pET21a-mIL15-L-SA重组表达质粒,在大肠杆菌中表达融合蛋白SA-mIL15和mIL15-SA,对所表达的蛋白分别采用镍金... 详细信息

目的:制备链亲和素(SA)标记的鼠白细胞介素-15融合蛋白SA-mIL15和mIL15-SA,并研究其生物学功能。方法:构建pET24a-SA-L-mIL15和pET21a-mIL15-L-SA重组表达质粒,在大肠杆菌中表达融合蛋白SA-mIL15和mIL15-SA,对所表达的蛋白分别采用镍金属螯合(Ni-NTA)层析和阴离子交换(DEAE)层析进行纯化,透析复性。MTT法检测融合蛋白对ConA刺激的小鼠脾淋巴细胞增殖活性,流式细胞术(FCM)分析融合蛋白对生物素化的小鼠前列腺癌(RM-1)细胞表面锚定修饰效率。结果:SA-mIL15和mIL15-SA在大肠杆菌中实现了高效表达,约占细菌总蛋白的20%。制备的SA-mIL15和mIL15-SA融合蛋白纯度达到95%,并具有双重活性,即:mIL15促进ConA激活的小鼠脾淋巴细胞的增殖活性和SA介导的高效结合至表面已生物素化的RM-1细胞的功能(表面锚定修饰效率均大于95%)。其中,SA-mIL15双功能融合蛋白促进ConA激活的小鼠脾淋巴细胞增殖活性为1×106IU/mg,mIL15-SA活性为2×105IU/mg。结论:SA/mIL15双功能融合蛋白具有双重活性,为mIL15表面锚定修饰的肿瘤细胞疫苗的研制奠定了基础。

关键词：白细胞介素15 链亲和素融合蛋白锚定

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mIL21-SA双功能融合蛋白锚定治疗膀胱癌实验研究

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生物技术 2012年第4期22卷 83-87页

作者：王菲胡志明法萍萍白莉石小军罗满生李金龙高基民南方医科大学生物技术学院生物治疗研究所广东广州510515 温州医学院浙江省医学遗传学重点实验室/浙江省模式生物技术与应用重点实验室浙江温州325035

目的:制备链亲合素标记的鼠白细胞介素21融合蛋白(mIL21-SA),治疗小鼠表浅膀胱癌。方法:构建mIL21-SA-pET21质粒,BL21表达,Ni-NTA纯化,透析复性,Western blot鉴定,MTT法检测其对小鼠胸腺细胞的增殖作用,流式检测其对生物素化的MB49锚定... 详细信息

目的:制备链亲合素标记的鼠白细胞介素21融合蛋白(mIL21-SA),治疗小鼠表浅膀胱癌。方法:构建mIL21-SA-pET21质粒,BL21表达,Ni-NTA纯化,透析复性,Western blot鉴定,MTT法检测其对小鼠胸腺细胞的增殖作用,流式检测其对生物素化的MB49锚定修饰率。建立小鼠MB49表浅膀胱癌模型,将mIL21-SA锚定在小鼠膀胱表面进行治疗并观察小鼠存活时间。60d后对mIL21-SA治疗后存活小鼠进行二次攻击。结果:mIL21-SA可以促进T细胞增殖,且具有SA介导的高效结合已生物素化的MB49表面的功能(修饰率98.74%)。膀胱灌注60d后,mIL21-SA组有10只(10/25)存活,二次攻击后,仍有6只(6/10)存活。与对照组比较均有统计学意义(P<0.05)。结论:该实验研制了具有双重活性的mIL21-SA,mIL21-SA锚定修饰治疗表浅膀胱癌是一种有效的免疫治疗方法。

关键词：链亲合素白细胞介素21 锚定表浅膀胱癌

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SA-hIL2双功能融合蛋白的研制及其生物学鉴定

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中国生物工程杂志 2009年第7期29卷 12-16页

作者：张琳胡志明法萍萍梁中锟高基民温州医学院浙江省医学遗传学重点实验室温州325035 南方医科大学生物技术学院生物治疗研究所广州510515

目的:制备链亲和素标记的人白细胞介素-2(SA-hIL2)融合蛋白,并研究其生物学功能。方法:构建SA-L-IL2-pET24重组表达质粒,在大肠杆菌中表达SA-hIL2融合蛋白,对表达的SA-hIL2融合蛋白采用镍金属螯合(Ni-NTA)层析柱进行纯化,透析复性。CCK-... 详细信息

目的:制备链亲和素标记的人白细胞介素-2(SA-hIL2)融合蛋白,并研究其生物学功能。方法:构建SA-L-IL2-pET24重组表达质粒,在大肠杆菌中表达SA-hIL2融合蛋白,对表达的SA-hIL2融合蛋白采用镍金属螯合(Ni-NTA)层析柱进行纯化,透析复性。CCK-8法检测SA-hIL2融合蛋白对PHA刺激的人外周血淋巴细胞的增值活性,流式细胞仪分析SA-hIL2融合蛋白对生物素化的B16.F10肿瘤细胞表面锚定修饰效率。结果:SA-hIL2在大肠杆菌中实现了高效表达,约占菌体总蛋白的20%,制备的SA-hIL2融合蛋白纯度达到95%,并具有双重活性,即hIL-2促进PHA刺激的人外周血淋巴细胞的增值活性和SA介导的高效结合至已生物素化的B16.F10肿瘤细胞表面的功能(表面锚定修饰效率约95%)。结论:研制的SA-hIL2融合蛋白具有双重活性,可为研制表面修饰的新型肿瘤细胞疫苗提供基础。

关键词：白细胞介素2 链亲和素融合蛋白锚定

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大肠杆菌拓扑异构酶I是一种锌和铁结合蛋白

大肠杆菌拓扑异构酶I是一种锌和铁结合蛋白

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“细胞活动生命活力”——中国细胞生物学学会全体会员代表大会暨第十二次学术大会

作者：吕建新王伍谭国强易鹏思凡任亚光丁焕根温州医学院细胞与分子医学院研究所温州医学院浙江省医学遗传学重点实验室温州医学院浙江省模式生物技术与应用重点实验室

大肠杆菌拓扑异构酶I(TopA)可以催化双链DNA中单链的断裂和再连接反应而使负超螺旋拓扑状态得到松弛。TopA从结构上分析,包括了N端的催化片段和C端的锌结合域,后者对于负超螺旋结构的松弛是必需的。我们发现从LB培养基中表达纯化出来的... 详细信息

大肠杆菌拓扑异构酶I(TopA)可以催化双链DNA中单链的断裂和再连接反应而使负超螺旋拓扑状态得到松弛。TopA从结构上分析,包括了N端的催化片段和C端的锌结合域,后者对于负超螺旋结构的松弛是必需的。我们发现从LB培养基中表达纯化出来的大肠杆菌TopA同时结合了锌和铁。但是,从M9基础培养基中表达纯化的TopA结合了极微量的锌和铁,且没有拓扑异构酶活性。

关键词：铁结合蛋白拓扑异构酶大肠杆菌

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大肠杆菌铁硫簇组装蛋白IscA的铁结合活性研究

大肠杆菌铁硫簇组装蛋白IscA的铁结合活性研究

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“细胞活动生命活力”——中国细胞生物学学会全体会员代表大会暨第十二次学术大会

作者：王伍谭国强司凡刘敏吕建新丁焕根温州医学院细胞与分子医学院研究所温州医学院浙江省医学遗传学重点实验室温州医学院浙江省模式生物技术与应用重点实验室

铁硫蛋白是真核生物线粒体中一类重要的功能蛋白,在细胞能量代谢、电子呼吸链传递过程中发挥了关键作用。IscA是铁硫簇组装蛋白系统中十分重要的一种,但是它的生理功能至今仍未完全阐明。我们以大肠杆菌IscA蛋白为研究对象,阐述了大肠杆... 详细信息

铁硫蛋白是真核生物线粒体中一类重要的功能蛋白,在细胞能量代谢、电子呼吸链传递过程中发挥了关键作用。IscA是铁硫簇组装蛋白系统中十分重要的一种,但是它的生理功能至今仍未完全阐明。我们以大肠杆菌IscA蛋白为研究对象,阐述了大肠杆菌IscA的体内铁结合活性。有氧条件下在M9基础培养基中添加1μM的外源铁就可以使大肠杆菌中表达的IscA蛋白结合的铁达到最大程度。相反,在相同实验条件下,大肠杆菌铁硫簇组装支架蛋白IscU和人Frataxin的大肠杆菌同源蛋白Cyay在体内都不能结合铁。值得注意的是,IscA这种很强的体内铁结合活性在土氧条件下显著减弱,进一步研究发现氧气可以促发IscA的铁结合能力,而且铁的这种结合作用反过来可以保护铁在有氧条件下免受氧气的氧化作用生成不可利用的氢氧化铁。与之相一致的是,我们发现大肠杆菌IscA和它的同系蛋白SufA对大肠杆菌的有氧生长是必需的。上述体内实验证据说明了IscA可能作为一种铁的分子伴侣参与了有氧条件下线粒体铁硫簇的生物合成,并防止自由铁超载而导致线粒体氧化应激损伤的产生。

关键词： iscA 铁结合活性自由铁铁硫簇

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大肠杆菌拓扑异构酶Ⅰ是一种锌和铁结合蛋白

大肠杆菌拓扑异构酶Ⅰ是一种锌和铁结合蛋白

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中国细胞生物学学会全体会员代表大会暨第十二次学术大会

作者：吕建新王伍谭国强易鹏思凡任亚光丁焕根温州医学院细胞与分子医学院研究所浙江温州325035 温州医学院浙江省医学遗传学重点实验室浙江温州325035 温州医学院浙江省模式生物技术与应用重点实验室浙江温州325035

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