检索结果-内蒙古大学图书馆

中华实验外科杂志 2011年第6期28卷 841-843页

作者：梁中锟张琳谭万龙高基民陈忠黄鑫南方医科大学附属南方医院泌尿外科广州510515 温州医学院浙江省医学遗传学重点实验室南方医科大学生命技术学院生物治疗研究所

目的链亲和素标记的细胞因子锚定MIM9细胞和成瘤小鼠膀胱，探讨锚定率、锚定量与时间的关系。方法MB49细胞与链亲和素标记的绿色荧光蛋白（SA—GFP）体外锚定后，在荧光显微镜下观察；建立小鼠原位表浅膀胱癌模型后，实验组膀胱灌注锚... 详细信息

目的链亲和素标记的细胞因子锚定MIM9细胞和成瘤小鼠膀胱，探讨锚定率、锚定量与时间的关系。方法MB49细胞与链亲和素标记的绿色荧光蛋白（SA—GFP）体外锚定后，在荧光显微镜下观察；建立小鼠原位表浅膀胱癌模型后，实验组膀胱灌注锚定链亲和素标记的粒细胞一巨噬细胞集落刺激因子（SA—GM—CSF）；对照组小鼠不锚定直接膀胱灌注SA—GM—CSF。取膀胱作冰冻切片免疫组织化学分析。结果MB49细胞基本被SA—GFP锚定，锚定率为98．78％；冰冻切片免疫组织化学显示实验组膀胱黏膜有阳性显色，以第1天最浓，以后逐日变淡，至第7天仍可见较明显染色；对照组膀胱黏膜无阳性显色。结论链亲和素标记的细胞因子可以锚定在细胞表面，且锚定效率高、保留时间长。

关键词：膀胱肿瘤疫苗粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 MB49 膜表面修饰

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基于λ-Red重组酶系统的Ⅳa2基因缺失及重组腺病毒的包装

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病毒学报 2011年第3期27卷 257-264页

作者：柳云帆尉迟捷王刚田文洪陆月刘雪荣董小岩郑刚沈炜吴小兵阮力中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所北京100052 吉林大学生命科学学院长春130012 温州医学院浙江省医学遗传学重点实验室温州325035 北京五加和分子医学研究所北京100176

本研究用λ-Red重组酶介导的PCR打靶方法缺失腺病毒基因组上Ⅳa2基因的大部分编码序列(1104 bp),并获得一种Ⅳa2基因缺失的重组腺病毒。首先构建PCR打靶的含有卡那霉素抗性表达盒的模板质粒pAK,再以pAK为模板扩增出两端含39 bp同源臂的... 详细信息

本研究用λ-Red重组酶介导的PCR打靶方法缺失腺病毒基因组上Ⅳa2基因的大部分编码序列(1104 bp),并获得一种Ⅳa2基因缺失的重组腺病毒。首先构建PCR打靶的含有卡那霉素抗性表达盒的模板质粒pAK,再以pAK为模板扩增出两端含39 bp同源臂的线性DNA片段;将pFG140质粒及线性DNA片段依次转化到宿主菌BW25113/pIJ790中,通过λ-Red重组酶介导的同源重组获得了缺失Ⅳa2基因的腺病毒基因组质粒pFG140-ΔⅣa2(1104)。酶切及DNA测序结果显示,用λ-Red重组酶介导的PCR打靶方法在pFG140上精确地缺失了预计的Ⅳa2基因3'端的1104bp片段。用PCR方法扩增获得Ⅳa2基因全长ORF,插入表达载体pAAV2neo中,构建成Ⅳa2基因表达质粒pAAV2neo-Ⅳa2。将pFG140-ΔⅣa2(1104)与pAAV2neo-Ⅳa2共转染HEK293细胞,成功地获得了重组腺病毒Ad5ΔⅣa2(1104)。Western Blot的结果表明,Ad5ΔⅣa2(1104)病毒感染的HEK293细胞检测不到Ⅳa2蛋白的表达。本研究建立了一种对腺病毒基因组直接进行缺失操作的λ-Red重组酶介导的PCR打靶方法,并获得了一种IVa2基因大部分缺失的重组腺病毒。

关键词： λ-Red重组酶 PCR打靶腺病毒 Ⅳa2

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过表达Lin28a/Lin28b对let-7家族活性的影响

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病毒学报 2011年第6期27卷 533-541页

作者：刘雪荣田文洪董小岩吴效哲吕建新吴小兵温州医学院浙江省医学遗传学重点实验室温州325035 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所病毒基因工程国家重点实验室北京100052 吉林大学生命科学学院长春130012 北京五加和分子医学研究所有限公司北京100176 四川大学华西医院生物治疗国家重点实验室成都610041

研究在HeLaS3细胞中过表达Lin28a/Lin28b对let-7家族miRNA表达水平和活性的影响。首先,构建Lin28a和Lin28b的表达载体pAAV2neo-Lin28a和pAAV2neo-Lin28b,分别转染HeLaS3细胞并筛选获得Lin28a和Lin28b的稳定表达细胞株HeLaS3/pAAV2neo-Lin28a和HeLaS3/pAAV2neo-Lin28b。然后,以pAAV2neo-Gluc-(Fluc)为基本骨架,构建并获得检测let-7家族miRNA活性的8种质粒型载体,并包装为相应的重组腺相关病毒(Recombinant adeno-associated virus,rAAV),作为检测miRNA靶序列介导的转录后抑制活性的传感器,命名为Asensor。在此基础上,以HeLaS3细胞为对照,用Western blot检测HeLaS3/pAAV2neo-Lin28a和HeLaS3/pAAV2neo-Lin28b细胞中Lin28a和Lin28b表达水平,用QRT-PCR测定let-7家族各成员表达水平,用Asensor检测let-7家族各成员活性。Western blot结果显示,HeLaS3/pAAV2neo-Lin28a和HeLaS3/pAAV2neo-Lin28b均能有效地表达Lin28a和Lin28b蛋白;QRT-PCR检测结果显示,相比于HeLaS3细胞,HeLaS3/pAAV2neo-Lin28a细胞中let-7家族各成员表达水平都下降(除let-7e外),但不同成员下降幅度存在差异;Asensor检测结果显示,let-7家族所有成员活性水平都下降,但不同成员下降幅度也存在差异,且同一成员活性水平与表达水平及其下降趋势也不一致。相比于HeLaS3细胞,HeLaS3/pAAV2neo-Lin28b细胞中let-7家族成员的表达和活性水平均明显下降,但表达水平的下降幅度比HeLaS3/pAAV2neo-Lin28a细胞大,而活性的下降幅度却与之相近。本研究建立了一种检测和比较miRNA靶序列介导的转录后抑制活性的方法,首次研究了过表达Lin28a和Lin28b对细胞中的let-7家族miRNA活性影响,并发现Lin28a和Lin28b对let-7家族miRNA表达水平的影响和对其相应活性的影响不一致性,说明在检测miRNA表达水平的同时检测miRNA活性能更全面揭示miRNA的调节功能,为进一步研究let-7家族的调控机制奠定了基础。

关键词： Lin28a Lin28b let-7家族活性过表达

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创伤弧菌溶细胞素融合蛋白对人Caeo-2细胞IL-8基因表达和IL-8分泌的影响

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中华微生物学和免疫学杂志 2010年第1期30卷 60-65页

作者：谢旦立王波丁卉郑丽楼永良严杰温州医学院微生态学研究所浙江省医学遗传学重点实验室325035 浙江大学医学院病原生物学教研室

目的研究创伤弧菌溶细胞素融合蛋白（rVvhA）对人肠上皮细胞（human intestinal epithelial cell，Caco-2）IL-8基因表达的影响。方法IPTG诱导、表达、纯化、复性及Western blot鉴定rVvhA表达和纯化情况；CCK-8法检测rVvhA对Caco-2的细... 详细信息

目的研究创伤弧菌溶细胞素融合蛋白（rVvhA）对人肠上皮细胞（human intestinal epithelial cell，Caco-2）IL-8基因表达的影响。方法IPTG诱导、表达、纯化、复性及Western blot鉴定rVvhA表达和纯化情况；CCK-8法检测rVvhA对Caco-2的细胞毒性作用；RT—PCR检测rVvhA诱导Caco-2细胞IL-8基因的表达情况；ELISA检测Caco-2细胞培养上清IL-8的分泌情况。结果Ni^2＋-NTA亲和层析柱对rVvhA进行纯化后纯度可达95％以上；CCK-8结果显示rVvhA活性蛋白显著降低了Caco-2细胞的存活率，有效浓度为1．5HU／ml（P〈0．05）；RT—PCR结果显示，0．6HU／ml rVvhA 30 min即可诱导Caco-2细胞IL-8mRNA基因表达上调；ELISA结果显示，Caco-2细胞经rVvhA作用后，培养液上清中IL-8多肽的表达时相在4h。RT—PCR与ELISA结果皆显示，IL-8基因的转录及IL-8表达皆具有时间-剂量依赖性。结论rVvhA在转录水平上能诱导人Caco-2细胞IL-8 mRNA表达，促进IL-8的合成，在创伤弧菌引起的过度炎症反应和败血症的发生、发展中可能具有重要意义。

关键词：创伤弧菌溶细胞素人Caco-2细胞 IL-8

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SA/mIL15双功能融合蛋白的制备及其生物学鉴定

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细胞与分子免疫学杂志 2010年第2期26卷 107-110页

作者：陈艳丽许晓玲唐佳聂小霞宋志纯胡志明高基民温州医学院浙江省医学遗传学重点实验室浙江温州325035 南方医科大学生物技术学院生物治疗研究所广东广州510515

目的:制备链亲和素(SA)标记的鼠白细胞介素-15融合蛋白SA-mIL15和mIL15-SA,并研究其生物学功能。方法:构建pET24a-SA-L-mIL15和pET21a-mIL15-L-SA重组表达质粒,在大肠杆菌中表达融合蛋白SA-mIL15和mIL15-SA,对所表达的蛋白分别采用镍金... 详细信息

目的:制备链亲和素(SA)标记的鼠白细胞介素-15融合蛋白SA-mIL15和mIL15-SA,并研究其生物学功能。方法:构建pET24a-SA-L-mIL15和pET21a-mIL15-L-SA重组表达质粒,在大肠杆菌中表达融合蛋白SA-mIL15和mIL15-SA,对所表达的蛋白分别采用镍金属螯合(Ni-NTA)层析和阴离子交换(DEAE)层析进行纯化,透析复性。MTT法检测融合蛋白对ConA刺激的小鼠脾淋巴细胞增殖活性,流式细胞术(FCM)分析融合蛋白对生物素化的小鼠前列腺癌(RM-1)细胞表面锚定修饰效率。结果:SA-mIL15和mIL15-SA在大肠杆菌中实现了高效表达,约占细菌总蛋白的20%。制备的SA-mIL15和mIL15-SA融合蛋白纯度达到95%,并具有双重活性,即:mIL15促进ConA激活的小鼠脾淋巴细胞的增殖活性和SA介导的高效结合至表面已生物素化的RM-1细胞的功能(表面锚定修饰效率均大于95%)。其中,SA-mIL15双功能融合蛋白促进ConA激活的小鼠脾淋巴细胞增殖活性为1×106IU/mg,mIL15-SA活性为2×105IU/mg。结论:SA/mIL15双功能融合蛋白具有双重活性,为mIL15表面锚定修饰的肿瘤细胞疫苗的研制奠定了基础。

关键词：白细胞介素15 链亲和素融合蛋白锚定

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高嗜肝性8型重组腺相关病毒体内转导法制备乙型肝炎病毒持续感染小鼠模型

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病毒学报 2010年第6期26卷 425-431页

作者：董小岩尉迟捷王刚田文洪陆月张风卫王文王岳谭文杰吴小兵复旦大学生命科学学院遗传学研究所遗传工程国家重点实验室上海200433 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所病毒基因工程国家重点实验室北京100052 吉林大学生命科学学院长春130012 温州医学院浙江省医学遗传学重点实验室温州325035

用高嗜肝性的重组8型腺相关病毒(Recombinant adeno-associated virus type8,rAAV8)载体携带1.3拷贝乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)基因组(ayw亚型)体内转导法,建立持续表达HBV抗原的C57BL/6小鼠模型。首先,制备并纯化了携带1.3拷贝HBV基因组(ayw亚型)的重组8型腺相关病毒(rAAV8-1.3HBV);将rAAV8-1.3HBV以剂量2×10e11vg/只注射C57BL/6小鼠(Viralgenome,vg);在不同时间点实施尾静脉采血,采用ELISA方法监测血清中HBsAg和HBeAg的水平及动力学变化;10周后处死小鼠,取血液、肝组织样本,提取基因组DNA,荧光定量PCR检测HBVDNA拷贝数;利用鉴定HBVDNA环化形式的特异性引物进行PCR扩增以检测肝组织中环化的HBVDNA,并检测HBV抗原特异性的免疫组化和肝脏病理变化。结果显示,注射rAAV8-1.3HBV的3只C57BL/6小鼠第1周开始在血液中检测到HBsAg和HBeAg的表达,并持续至第10周均为阳性,其中HBsAg的表达水平经历了一个上升-下降-再上升的过程(注射后第4周时最低,第6周后维持较高水平),而HBeAg表达水平则持续阳性且比较稳定。荧光定量PCR结果显示,3只小鼠10周后血清中HBV DNA的拷贝数分别为4.2×103、3.6×103、2.5×103copies/mL,肝脏中则分别为8.0×106、5.7×106、2.6×106copies/g肝组织。在3只小鼠肝组织中均检测到环化HBV DNA,提示AAV8载体携带的线性HBV DNA成功回复成环化HB VDNA。免疫组化分析显示3只小鼠肝脏中均存在HBsAg和HBcAg表达;体内转染10周后肝脏组织切片的HE染色分析显示未见明显的炎性细胞浸润及组织结构异常。结果表明,本研究利用高嗜肝性重组8型腺相关病毒载体携带1.3拷贝乙型肝炎病毒基因组(ayw亚型)体内转导C57BL/6小鼠,成功地建立了HBV病毒在肝内稳定复制并持续表达HBV抗原的小鼠模型,为进一步研究HBV慢性持续感染的机制与应用于药物以及疫苗评价打下了基础。

关键词：动物模型乙型肝炎病毒 AAV8 持续感染

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双萤光素酶共表达载体构建及特性研究

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病毒学报 2010年第4期26卷 276-282页

作者：付昕阳王刚田文洪陈素云董小岩吴小兵谭万龙南方医科大学南方医院泌尿外科广州510515 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所病毒基因工程国家重点实验室北京100052 温州医学院浙江省医学遗传学重点实验室温州325035 北京五加和分子医学研究所有限责任公司北京100176

利用来源于TaV的自剪切多肽2A的编码序列构建一种分泌型萤光素酶Gluc和非分泌型萤光素酶Fluc共表达的载体,对其体内外表达及活体成像特点进行研究。采用重叠PCR技术获得Gluc-2A-Fluc片段,克隆入表达质粒pAAV2neoCAG中,获得重组质粒pAAV2... 详细信息

利用来源于TaV的自剪切多肽2A的编码序列构建一种分泌型萤光素酶Gluc和非分泌型萤光素酶Fluc共表达的载体,对其体内外表达及活体成像特点进行研究。采用重叠PCR技术获得Gluc-2A-Fluc片段,克隆入表达质粒pAAV2neoCAG中,获得重组质粒pAAV2neoCAG-Gluc-2A-Fluc。将重组质粒瞬时转染BHK-21细胞,24h后在细胞上清液和细胞裂解液中均能检测到Gluc和Fluc的表达,其中Gluc98%以上分布在上清液中,而Fluc98%以上存在于细胞中,随时间延长Gluc活性在上清液中逐步增加,而细胞内Fluc活性则保持相对平稳。用水动力法经小鼠尾静脉注射pAAV2neoCAG-Gluc-2A-Fluc质粒DNA,通过尾静脉微量采血(2.5μl/次)即可实时地监测体内Gluc的表达情况。活体成像结果显示,注射Gluc的底物腔肠素时小鼠明显表现为全身显像,显像在10min内迅速衰减;而注射Fluc的底物D-Luciferin时显像主要集中在肝脏,显像在30min内都比较稳定。本研究设计和构建的pAAV2neoCAG-Gluc-2A-Fluc质粒实现了分泌型和非分泌型萤光素酶的共表达,既可以在不裂解细胞或处死动物的情况下直接在细胞培养上清或血液中动态检测Gluc的活性,又可以利用活体成像技术准确定位Fluc表达部位,比单一的萤光素酶报告载体在细胞标记和体内示踪研究方面更具优越性。

关键词： Gaussia萤光素酶萤火虫萤光素酶 TaV2A 水动力注射共表达

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可溶性肿瘤坏死因子受体II-脂联素球部融合蛋白的真核表达及生物学活性检测

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生物工程学报 2010年第2期26卷 207-215页

作者：陈素云何秋山董小岩吴小兵高基民温州医学院浙江省医学遗传学重点实验室温州325035 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所病毒基因工程国家重点实验室北京100052 南方医科大学生物技术学院广州510515 北京五加和分子医学研究有限公司北京100176

本研究设计和构建了一种人肿瘤坏死因子受体II胞外区与人脂联素球部的融合基因sTNFRII-gAD,且相应的融合蛋白在哺乳动物细胞BHK-21S的无血清培养体系中实现了表达,并对该融合蛋白进行了初步鉴定。首先,用RT-PCR方法从人的外周血淋巴细胞... 详细信息

本研究设计和构建了一种人肿瘤坏死因子受体II胞外区与人脂联素球部的融合基因sTNFRII-gAD,且相应的融合蛋白在哺乳动物细胞BHK-21S的无血清培养体系中实现了表达,并对该融合蛋白进行了初步鉴定。首先,用RT-PCR方法从人的外周血淋巴细胞总RNA中扩增人肿瘤坏死因子II型受体胞外区基因片段,与脂联素球部基因片段融合,克隆至pAAV2neo表达载体中,构建成pAAV2neo-sTNFRII-gAD。随后,用pAAV2neo-sTNFRII-gAD转染BHK-21S细胞获得G418抗性细胞BHK-21S/pAAV2neo-sTNFRII-gAD;然后,将原来含有血清的培养液换成无血清的化学成分限定的培养液,细胞从贴壁培养方式转换成悬浮培养方式;最后,收集BHK-21S/pAAV2neo-sTNFRII-gAD无血清悬浮培养24h后的培养上清,进行sTNFRII-gAD融合蛋白的鉴定分析。酶切鉴定和测序结果显示,所构建的pAAV2neo-sTNFRII-gAD质粒结构正确,sTNFRII-gAD序列与预期一致;分别用抗人肿瘤坏死因子受体II和抗人脂联素球部的单克隆抗体检测pAAV2neo-sTNFRII-gAD瞬时转染的BHK-21S细胞,免疫荧光呈现阳性;免疫印迹分析在pAAV2neo-sTNFRII-gAD稳定转染的BHK-21S细胞上清中检测到sTNFRII-gAD融合蛋白的表达,并以单体、三聚体和三聚体以上的多聚体形式存在。活性测定结果表明,sTNFRII-gAD融合蛋白具有显著抑制TNFα杀伤L929细胞的活性。因此,本研究为下一步大量制备sTNFRII-gAD融合蛋白用于体内外功能研究提供了良好基础。

关键词：肿瘤坏死因子α拮抗剂可溶性肿瘤坏死因子受体Ⅱ 脂联素融合蛋白真核表达

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链亲和素标记的GM-CSF治疗膀胱癌疗效的初步观察

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临床泌尿外科杂志 2010年第11期25卷 828-831页

目的:将链亲和素标记的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(SA-GM CSF)原位锚定成瘤小鼠膀胱,探求该新疗法的可行性和有效性。方法:选择雌性C57BL/6小鼠50只,随机均分成5组,组1到组4建立原位表浅膀胱癌模型后,按照处理的不同又分为PBS组、GM CS... 详细信息

目的:将链亲和素标记的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(SA-GM CSF)原位锚定成瘤小鼠膀胱,探求该新疗法的可行性和有效性。方法:选择雌性C57BL/6小鼠50只,随机均分成5组,组1到组4建立原位表浅膀胱癌模型后,按照处理的不同又分为PBS组、GM CSF组、SA-GFP组和SA-GM-CSF组,分别给予相应治疗;6次治疗后,SA-GM-CSF组和组5(对照组)接受第二次肿瘤细胞攻击;观察所有小鼠的一般情况、肿瘤情况和生存期,并对死亡小鼠进行解剖,留取器官组织做病理切片或免疫组织化学染色。结果:SA-GM CSF组与其它各组比较,肿瘤出现的时间晚,肿瘤生长速度慢,小鼠生存期长(P_(max)=0.023,P<0.05);MB49细胞二次攻击后,SAGM-CSF组与对照组相比,生存期差异有显著统计学意义(x^2=9.551.P=0.002)。结论:SA GM-CSF原位锚定于雌性C57BL/6成瘤小鼠膀胱黏膜,有效抑制了膀胱肿瘤的生长,延长了小鼠的生存时间,并且能抵抗同源肿瘤的再次攻击,提示可能诱导了小鼠针对MB49的免疫保护作用;SA-GM-CSF原位锚定治疗比单纯细胞因子灌注法疗效更好。

关键词：膀胱肿瘤生物素链亲和素免疫治疗粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子

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实时定量PCR检测细菌中bla_(CTX-M-14)基因

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中国抗生素杂志 2009年第8期34卷 505-508页

作者：王震钱凯吕建新邹立林陈栋孙宝昌温州医学院浙江省医学遗传学重点实验室细胞与分子医学研究所温州325035 温州市疾病预防控制中心温州325000

目的探索实时定量PCR检测临床、环境细菌中blaCTX-M-14基因流行情况。方法将收集的65份标本先用ESBL表型确认试验及其KB琼脂扩散法初筛,然后通过菌落平板计数,实时定量PCR方法测出细菌blaCTX-M-14基因C(t)值,最终计算得到平均每个待测... 详细信息

目的探索实时定量PCR检测临床、环境细菌中blaCTX-M-14基因流行情况。方法将收集的65份标本先用ESBL表型确认试验及其KB琼脂扩散法初筛,然后通过菌落平板计数,实时定量PCR方法测出细菌blaCTX-M-14基因C(t)值,最终计算得到平均每个待测细菌中的blaCTX-M-14基因的单个拷贝数。结果从65份标本中分离得到4株产ESBLs的大肠埃希菌,实时定量PCR检测后得到四株细菌的blaCTX-M-14基因C(t)值依次为11.08,11.63,11.80,13.46,拷贝数分别为6.92×107copies/μl菌液,4.67×107copies/μl菌液,4.22×107copies/μl菌液,1.35×107copies/菌液,即1.05copies/细菌,1.90copies/细菌,2.92copies/细菌,1.10copies/细菌。结论细菌blaCTX-M-14基因拷贝数的高低与细菌多重耐药现象正相关,建立的实时定量PCR检测细菌中blaCTX-M-14基因的方法具有直观,快捷的优点,有助于检测临床及其环境中耐药菌blaCTX-M-14基因流行情况。

关键词：超广谱β-内酰胺酶 CTX—M-14 实时定量PCR

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