检索结果-内蒙古大学图书馆

中国病原生物学杂志 2016年第10期11卷 871-875,880页

作者：张婵琼宋易玲岑丹维蔡一奇叶晓鲜毛珊珊蒋朋飞李文姝张丽芳温州医科大学分子病毒与免疫研究所微生物学与免疫学教研室浙江温州325035 温州医科大学附属第一医院胃肠外科浙江温州325015

目的制备EB病毒(EBV)潜伏膜蛋白2(LMP2)串联B表位特异的兔血清多克隆抗体。方法利用分子克隆技术,将已鉴定的EBV LMP2蛋白的3个B细胞表位,即RIEDPPFNSLL,TLNLT和KSLSSTEFIPN,以柔性肽(GS)加以串联连接,经原核密码子优化后全基因合成,并... 详细信息

目的制备EB病毒(EBV)潜伏膜蛋白2(LMP2)串联B表位特异的兔血清多克隆抗体。方法利用分子克隆技术,将已鉴定的EBV LMP2蛋白的3个B细胞表位,即RIEDPPFNSLL,TLNLT和KSLSSTEFIPN,以柔性肽(GS)加以串联连接,经原核密码子优化后全基因合成,并经BamHⅠ和HindⅢ酶切位点克隆至pET32a(+)载体,测序鉴定正确的重组质粒转化至大肠埃希菌BL21(DE3),用异丙基硫代-B-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达,对表达蛋白进行SDS-PAGE分析和Western blot鉴定。用镍螯合亲和层析柱(Ni-NTA Agarose)纯化表达产物,与佐剂乳化后皮下多点注射日本大耳白兔,隔周免疫1次,共3次。分别于免疫的0、2、4、6、8周取血,采用ELISA方法检测IgG抗体水平,采用Western blot和细胞免疫荧光法检测兔血清抗体的免疫反应性和结合特异性。结果 EBV LMP2B表位重组蛋白可通过原核表达系统进行表达,纯化的表达蛋白免疫兔可产生特异性IgG抗体,效价达1∶30 000。经Western blot法和细胞免疫荧光法鉴定,制备的兔血清抗体可识别LMP2重组蛋白和LMP2天然蛋白。结论成功获得了EBV LMP2串联B表位重组蛋白,制备的兔多克隆血清抗体效价高,特异性强,为LMP2的生物学和免疫学研究奠定了基础。

关键词： EB病毒潜伏膜蛋白2 原核表达抗体制备

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人宫颈癌SiHa细胞荷瘤裸鼠模型的建立及鉴定

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温州医科大学学报 2016年第2期46卷 92-96页

作者：侯柏龙杜王琪熊一融蔡一奇宋易玲林晓云薛向阳张丽芳温州医科大学分子病毒与免疫研究所微生物学与免疫学教研室浙江温州325035 温州医科大学附属第一医院胃肠外科浙江温州325015

目的:建立人宫颈癌SiHa细胞裸小鼠体表荷瘤模型,并对其成瘤特性进行分析和鉴定。方法:将5×10~6/mL、1×10~7/mL及5×10~7/mL 3个浓度的SiHa细胞悬液分别在3组裸小鼠背部右腋近上肢皮下接种,建立人宫颈癌裸小鼠体表荷瘤模型... 详细信息

目的:建立人宫颈癌SiHa细胞裸小鼠体表荷瘤模型,并对其成瘤特性进行分析和鉴定。方法:将5×10~6/mL、1×10~7/mL及5×10~7/mL 3个浓度的SiHa细胞悬液分别在3组裸小鼠背部右腋近上肢皮下接种,建立人宫颈癌裸小鼠体表荷瘤模型,观察荷瘤裸鼠的成瘤率并测量肿瘤的大小,5周后取肿瘤组织经病理学方法观察其组织学特性,并采用PCR及免疫组织化学方法对肿瘤组织的HPV16E7 DNA表达进行检测。结果:3组裸小鼠接种SiHa细胞的成瘤率均为100%,5周后肿瘤大小分别达到(77.29±28.34)mm^3、(178.91±61.55)mm^3和(305.11±12.62)mm^3。3个浓度组间肿瘤体积大小差异有统计学意义(P<0.001)。病理学大体观察可见SiHa肿瘤的生长均以局部浸润为主;组织切片观察新生肿瘤细胞特点呈现体积大、核大深染及易见核分裂相的病理性特征;SiHa新生肿瘤组织经PCR检测证实了HPV16E7 DNA阳性,并经免疫组织化学检测证实了HPV16E7蛋白表达阳性。结论:成功建立了SiHa细胞荷瘤裸鼠模型,为人宫颈癌肿瘤靶向治疗及生物学特性研究提供了理想的动物模型。

关键词：宫颈肿瘤动物模型 BALB/c-nu裸小鼠 SiHa细胞

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人巨细胞病毒US31基因序列特征分析及B细胞表位预测

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温州医科大学学报 2016年第11期46卷 781-786页

作者：郭刚强谢尙丹叶思思孙祥威张良张丽芳薛向阳温州医科大学微生物学与免疫学教研室分子病毒与免疫研究所热带医学研究所浙江温州325035 温州医科大学第二临床医学院浙江温州325035 温州医科大学附属第一医院胃肠外科浙江温州325015

目的：分析人巨细胞病毒（HCMV）US31基因序列，预测US31基因编码蛋白的B细胞优势表位。方法：基于US31基因编码蛋白的氨基酸序列，结合亲水性参数、可及性参数、抗原性参数、柔韧性参数及二级结构方案对HCMVUS31基因编码各型蛋白的B细... 详细信息

目的：分析人巨细胞病毒（HCMV）US31基因序列，预测US31基因编码蛋白的B细胞优势表位。方法：基于US31基因编码蛋白的氨基酸序列，结合亲水性参数、可及性参数、抗原性参数、柔韧性参数及二级结构方案对HCMVUS31基因编码各型蛋白的B细胞表位进行预测，参照已建立的预测方法综合评价US31基因B细胞优势表位。结果：US31核苷酸序列变异较少，大部分是同义突变，氨基酸序列高度保守；其编码蛋白全长为162个氨基酸，相对分子质量20kD，等电点7.66，为可溶性蛋白，二级结构中以无规则卷曲为主。经综合分析，US31基因的B细胞优势表位可能存在于氨基酸序列N端的5～19、32～47、58～68、110～124区段。结论：多参数预测HCMVpUS31的B细胞优势表位，为进一步研究蛋白特征、制备单克隆抗体及表位疫苗提供依据。

关键词：人巨细胞病毒 US31基因 B细胞表位

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HPV16型E6蛋白的B细胞线性表位预测及分析

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中国病原生物学杂志 2015年第3期10卷 220-223,227页

作者：杨恩张燕侯柏龙杜王琪张丽芳温州医科大学第一临床医学院浙江温州325035 温州医科大学分子病毒与免疫研究所微生物学与免疫学教研室

目的对高危型人乳头瘤病毒(Human papillomavirus)16型E6蛋白的B细胞线性表位进行预测。方法以HPV16型E6蛋白(P03126)的全长氨基酸序列为基础,采用EXPASY网站上的生物信息学软件和DNAstar软件包中的Protean软件分析E6蛋白的二级结构,跨... 详细信息

目的对高危型人乳头瘤病毒(Human papillomavirus)16型E6蛋白的B细胞线性表位进行预测。方法以HPV16型E6蛋白(P03126)的全长氨基酸序列为基础,采用EXPASY网站上的生物信息学软件和DNAstar软件包中的Protean软件分析E6蛋白的二级结构,跨膜趋势及其亲水性,表面可及性,抗原性,极性和柔韧性等特性。综合以上参数预测HPV16型E6蛋白的B细胞线性表位,并进一步进行同源性匹配分析。结果综合多个参数分析显示B细胞线性表位可能位于E6蛋白N端2-7、9-19、30-36、45-49、105-109、119-125和148-158区段及其附近,进一步同源性匹配分析支持其中区段2-7、9-19、119-125及148-158为可能的B细胞线性表位,其中区段148-158(RSSRTRRETQL)为HPV16型E6蛋白所特有的序列,而区段2-7(HQKRTA)、9-19(FQDPQERPRKL)与HPV9型E6蛋白具有同源性,区段119-125(PEEKQRH)与HPV31型E6蛋白具有同源性。结论综合分析预测HPV16型E6蛋白的B细胞线性表位可能位于E6蛋白N端2-7、9-19、119-125及148-158区段,为HPV16型E6蛋白的进一步研究奠定了基础。

关键词： HPV16型 E6蛋白 B细胞线性表位预测同源性匹配分析

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沙眼衣原体主要外膜蛋白_(21-387)的原核表达及其免疫原性

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温州医学院学报 2015年第2期45卷 95-99,105页

作者：刘巧琼涂建欣林晓云熊一融朱珊丽陈韶张丽芳温州医科大学分子病毒和免疫研究所微生物学和免疫学教研室浙江温州325035

目的:探讨沙眼衣原体(Ct)E血清型主要外膜蛋白(MOMP21-387)的原核表达及其免疫原性。方法:利用PCR方法扩增Ct E血清型MOMP第21至第387氨基酸的基因序列,克隆至p ET21a(+)原核表达载体构建重组质粒p ET21a(+)/MOMP21-387,并进行原核表达... 详细信息

目的:探讨沙眼衣原体(Ct)E血清型主要外膜蛋白(MOMP21-387)的原核表达及其免疫原性。方法:利用PCR方法扩增Ct E血清型MOMP第21至第387氨基酸的基因序列,克隆至p ET21a(+)原核表达载体构建重组质粒p ET21a(+)/MOMP21-387,并进行原核表达和纯化,经SDS-PAGE和Western blot法分析鉴定后,通过BALB/c小鼠免疫检测MOMP21-387蛋白的免疫原性,即通过ELISA法检测小鼠血清Ig G和生殖道分泌物Ig A抗体反应,乳酸脱氢酶(LDH)法检测其脾细胞的特异性杀伤作用。结果:在原核表达系统成功表达了MOMP21-387融合蛋白,经SDS-PAGE及Western blot法鉴定在相对分子质量(Mr)约44 000处出现特异性条带;并经NiNTA亲和层析的方法获得了纯化的MOMP21-387融合蛋白,免疫BALB/c小鼠可诱导产生特异性血清Ig G抗体和生殖道分泌物Ig A抗体,至第6周达到高峰,MOMP21-387组的Ig G和Ig A抗体较PBS组差异均有统计学意义(P<0.05);LDH检测结果显示,MOMP21-387组小鼠脾细胞对靶细胞的杀伤率,在10:1、20:1和40:1和80:1时均明显高于PBS组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:Ct E型MOMP21-387融合蛋白具有良好的免疫原性,为基于MOMP21-387的Ct的ELISA法检测方法的开发和疫苗研究奠定了基础。

关键词：沙眼衣原体主要外膜蛋白原核表达免疫原性

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金黄色葡萄球菌蛋白A Z结构域的原核表达及多克隆抗体的制备

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温州医学院学报 2015年第1期45卷 1-5页

作者：林晓云侯柏龙熊一融叶璐璐杜王琪陈韶薛向阳朱珊丽张丽芳温州医科大学分子病毒与免疫研究所微生物学与免疫学教研室浙江温州325035

目的:制备金黄色葡萄球菌蛋白A(Sp A)Z结构域的原核表达蛋白及其多克隆抗体,并对其进行特异性鉴定。方法:3段Sp A-Z结构域经柔性肽(GS)串联连接构成三串联体(Sp A-3Z),经原核密码子优化后全基因合成,克隆至p ET21a(+)载体,构建p ET21a(+... 详细信息

目的:制备金黄色葡萄球菌蛋白A(Sp A)Z结构域的原核表达蛋白及其多克隆抗体,并对其进行特异性鉴定。方法:3段Sp A-Z结构域经柔性肽(GS)串联连接构成三串联体(Sp A-3Z),经原核密码子优化后全基因合成,克隆至p ET21a(+)载体,构建p ET21a(+)/Sp A-3Z重组质粒,测序鉴定;将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经异丙基硫代-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导表达重组蛋白,用Ni-NTA亲和层析法纯化并经SDS-PAGE及Western Blot法分析鉴定;纯化的Sp A-3Z重组蛋白免疫日本大耳白兔,并分别于免疫前和免疫后采集血清,用ELISA法检测其多克隆抗体的反应和效价,并用Western Blot法分析多克隆抗体结合天然Sp A的特异性。结果:成功构建了p ET21a(+)/Sp A-3Z重组质粒;该重组质粒在原核表达系统表达并获得纯化的Sp A-3Z重组蛋白,SDS-PAGE电泳显示该蛋白的分子质量约为21 k Da,与理论分子量大小相符;日本大耳白兔经该蛋白免疫后可产生特异性的多克隆血清Ig G抗体,效价可达1:40 000;Western Blot法检测结果显示,在分子质量约42 k Da(天然Sp A蛋白)处出现单一条带,提示兔多克隆血清抗体可识别天然Sp A。结论:Sp A-3Z原核蛋白有较好的免疫原性和抗原性,制备的Sp A-3Z兔多克隆血清抗体Ig G效价高、特异性好,可进一步用于Sp A-Z相关的生物学和免疫学等功能研究。

关键词：金黄色葡萄球菌蛋白A 多克隆抗体

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人巨细胞病毒UL138含多个B细胞表位病毒样颗粒的构建及鉴定

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中华实验和临床病毒学杂志 2015年第6期29卷 488-492页

作者：李宝青田晓娟陈晓晴王红陶洪群郑育沈贤李文姝张丽芳薛向阳温州医科大学附属第二医院 325000 温州医科大学微生物学和免疫学教研室分子病毒与疫苗研究所热带医学研究所温州医科大学附属第一医院

目的利用毕赤酵母系统表达HPV16L1-HCMVUL138含多个B细胞表位片段的嵌合病毒样颗粒，并评价其免疫效应。方法选择富含B细胞表位的HCMVUL138 96-138片段，构建毕赤酵母真核表达质粒pPIC3．5K／HPV16L1／UL138 96-138线性化后的重组质粒... 详细信息

目的利用毕赤酵母系统表达HPV16L1-HCMVUL138含多个B细胞表位片段的嵌合病毒样颗粒，并评价其免疫效应。方法选择富含B细胞表位的HCMVUL138 96-138片段，构建毕赤酵母真核表达质粒pPIC3．5K／HPV16L1／UL138 96-138线性化后的重组质粒电转化GSll5毕赤酵母，甲醇诱导HPVl6L1／UL13896-138蛋白表达，采用肝素亲和层析法纯化嵌合VLPs，并加以鉴定。将纯化的嵌合VLPs免疫BALB／c小鼠，通过ELISA检测免疫小鼠血清的UL138特异性抗体水平。结果经PCR、酶切和测序分析表明成功构建了pPIC3．5K／HPV16L1／UL138 96-138嵌合重组质粒。经甲醇诱导后，SDS—PAGE和WesternBlot证实重组酵母菌裂解产物存在目的蛋白。肝素亲和纯化后，透射电镜观察到了直径大约55nm的病毒样颗粒。免疫小鼠血清的ELISA结果显示，***38B细胞表位嵌合病毒样颗粒能诱导小鼠产生较高水平的UL138特异性IgG抗体。结论以HPV16L1为载体，利用整合型重组毕赤酵母表达系统成功制备了HCMVULl38含多个B表位片段的嵌合病毒样颗粒，免疫小鼠可产生较高水平的体液免疫反应。

关键词：人巨细胞病毒病毒样颗粒疫苗

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HPV16型E7重组蛋白的表达及其多克隆抗体的制备

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细胞与分子免疫学杂志 2014年第2期30卷 167-170,175页

作者：王冰冰涂建欣吕艳侯柏龙刘巧琼林晓云陈韶薛向阳朱珊丽张丽芳温州医科大学分子病毒与免疫研究所/微生物学与免疫学教研室浙江温州325000

目的制备人乳头瘤病毒(HPV)16型E7原核表达蛋白及其多克隆抗体。方法用PCR方法从宫颈癌组织中扩增HPV16 E7基因,克隆至pET21a(+)载体并构建pET21a(+)/HPV16 E7重组质粒,测序鉴定;将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3),经异丙基硫代-β-D-... 详细信息

目的制备人乳头瘤病毒(HPV)16型E7原核表达蛋白及其多克隆抗体。方法用PCR方法从宫颈癌组织中扩增HPV16 E7基因,克隆至pET21a(+)载体并构建pET21a(+)/HPV16 E7重组质粒,测序鉴定;将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3),经异丙基硫代-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导后表达重组蛋白,用Ni-NTA亲和层析法纯化并经SDS-PAGE及Western blot分析鉴定;纯化的HPV16 E7重组蛋白免疫日本大耳白兔制备多克隆抗体,用ELISA检测多克隆抗体的效价,并用Western blot法及免疫荧光技术分析多克隆抗体的特异性。结果 HPV16 E7重组蛋白可通过原核表达系统进行表达和纯化;通过兔免疫后可制备特异性的多克隆IgG抗体,效价达1∶30 000;经Western blot法和免疫荧光染色结果证实兔多克隆抗体可特异性识别HPV16 E7蛋白。结论成功进行了HPV16 E7原核表达并制备了HPV16 E7兔多克隆抗体。

关键词：人乳头瘤病毒 E7蛋白多克隆抗体

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宫颈肿瘤组织高危型HPV新分型检测方法的建立及应用

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肿瘤学杂志 2015年第11期21卷 889-894页

作者：谢旺凯王慧静肖兰兰计苏惠王俭陈向敏邹阮敏陈俊薛向阳温州医科大学第二临床学院浙江温州325035 温州医科大学检验医学院生命科学学院浙江温州325035 温州医科大学附属第一医院浙江温州325000 温州医科大学微生物学与免疫学教研室分子病毒与免疫研究所热带医学研究所浙江温州325035

[目的]建立一种新型宫颈肿瘤组织高危型人乳头瘤病毒(HPV)检测及分型方法,并评价其临床应用。[方法]基于我国人群流行的5种高危型HPV(HPV 16、18、31、33、51)的E6/E7早期基因序列,设计特异性引物,以明确HPV型别的宫颈癌细胞株及宫颈肿... 详细信息

[目的]建立一种新型宫颈肿瘤组织高危型人乳头瘤病毒(HPV)检测及分型方法,并评价其临床应用。[方法]基于我国人群流行的5种高危型HPV(HPV 16、18、31、33、51)的E6/E7早期基因序列,设计特异性引物,以明确HPV型别的宫颈癌细胞株及宫颈肿瘤组织为模板,进行PCR检测,结合基因测序验证引物的特异性。进一步优化条件,建立高危型HPV多重PCR检测方法,检测65例宫颈肿瘤组织标本,与临床上使用的流式荧光杂交HPV检测法比较,评价其敏感性和特异性。[结果]成功建立可同时检测5种高危型HPV的多重PCR检测方法,对65例宫颈肿瘤组织进行高危型HPV检测,检出率为72.3%,明显高于临床流式荧光杂交检测法的检出率(32.31%)(χ2=3.86,P<0.05)。[结论 ]基于HPV E6/E7早期基因的高危型HPV多重PCR检测方法是特异、灵敏的高危型HPV检测方法。

关键词：人乳头瘤病毒多聚酶链反应基因分型宫颈肿瘤

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HCMV-UL138 CTL表位肽重组酵母菌的构建及其免疫效应

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温州医学院学报 2015年第6期45卷 406-412页

作者：张跃进柳献云陈向敏田晓娟李文姝薛向阳温州医科大学护理学院浙江温州325035 温州医科大学附属第一医院中药房浙江温州325015 温州医科大学生物学实验教学中心浙江温州325035 温州医科大学分子病毒与疫苗研究所微生物与免疫学教研室浙江温州325035

目的:以乙肝病毒表面抗原为载体,制备含人巨细胞病毒(HCMV)-UL138 CTL表位肽的重组酵母菌并分析其免疫效应。方法:根据蛋白质数据库获得HCMV-UL138氨基酸序列,综合应用SYFPEITHI、NetCTL及HLA-Bind方法筛选富含CTL表位的UL138多肽,插入... 详细信息

目的:以乙肝病毒表面抗原为载体,制备含人巨细胞病毒(HCMV)-UL138 CTL表位肽的重组酵母菌并分析其免疫效应。方法:根据蛋白质数据库获得HCMV-UL138氨基酸序列,综合应用SYFPEITHI、NetCTL及HLA-Bind方法筛选富含CTL表位的UL138多肽,插入到乙肝表面抗原前S2(Pre S2)1-9区末端再与HBsAg序列连接,在不改变氨基酸密码的前提下,根据酵母偏爱密码子优化序列,进行全序列合成,克隆入pPIC3.5K酵母载体,构建pPIC3.5K/Pre S2-HBsAg-UL13815-27重组质粒。重组质粒经Bgl I处理线性化后,电转化至GS115菌株中,构建Pre S2-HBsAg-UL13815-27重组酵母,阳性整合菌株经甲醇诱导后,通过Western blot及ELISA方法鉴定目的蛋白表达。鉴定的重组酵母菌经灭活后,全菌体皮下免疫BALB/c小鼠,通过ELISA法检测HBsAg特异性血清Ig G抗体;UL13815-27 CTL表位肽(VMLVLIVAILCYL)刺激免疫小鼠的脾细胞,通过检测IFN-γ表达分析诱导产生的CTL反应。结果:PCR、酶切和测序分析表明成功构建了pPIC3.5K/Pre S2-HBsAg-UL13815-27重组质粒。重组酵母经甲醇诱导后,酵母裂解液中可检测到HBsAg特异性抗体识别的、分子量约33 kD目的蛋白。表达Pre S2-HBsAg-UL13815-27灭活全菌体免疫小鼠后,可检测到HBsAg特异性抗体,免疫小鼠脾细胞经UL13815-27 CTL表位肽刺激,IFN-γ表达水平比对照组明显升高。结论:重组酵母全菌体成功表达了Pre S2-HBsAg-UL13815-27重组蛋白,且重组酵母菌全菌体免疫小鼠可诱导产生UL13815-27特异性的细胞免疫。

关键词：人类巨细胞病毒 CTL表位乙肝病毒表面抗原重组酵母

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