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中华实验和临床病毒学杂志 2015年第6期29卷 488-492页

作者：李宝青田晓娟陈晓晴王红陶洪群郑育沈贤李文姝张丽芳薛向阳温州医科大学附属第二医院 325000 温州医科大学微生物学和免疫学教研室分子病毒与疫苗研究所热带医学研究所温州医科大学附属第一医院

目的利用毕赤酵母系统表达HPV16L1-HCMVUL138含多个B细胞表位片段的嵌合病毒样颗粒，并评价其免疫效应。方法选择富含B细胞表位的HCMVUL138 96-138片段，构建毕赤酵母真核表达质粒pPIC3．5K／HPV16L1／UL138 96-138线性化后的重组质粒... 详细信息

目的利用毕赤酵母系统表达HPV16L1-HCMVUL138含多个B细胞表位片段的嵌合病毒样颗粒，并评价其免疫效应。方法选择富含B细胞表位的HCMVUL138 96-138片段，构建毕赤酵母真核表达质粒pPIC3．5K／HPV16L1／UL138 96-138线性化后的重组质粒电转化GSll5毕赤酵母，甲醇诱导HPVl6L1／UL13896-138蛋白表达，采用肝素亲和层析法纯化嵌合VLPs，并加以鉴定。将纯化的嵌合VLPs免疫BALB／c小鼠，通过ELISA检测免疫小鼠血清的UL138特异性抗体水平。结果经PCR、酶切和测序分析表明成功构建了pPIC3．5K／HPV16L1／UL138 96-138嵌合重组质粒。经甲醇诱导后，SDS—PAGE和WesternBlot证实重组酵母菌裂解产物存在目的蛋白。肝素亲和纯化后，透射电镜观察到了直径大约55nm的病毒样颗粒。免疫小鼠血清的ELISA结果显示，***38B细胞表位嵌合病毒样颗粒能诱导小鼠产生较高水平的UL138特异性IgG抗体。结论以HPV16L1为载体，利用整合型重组毕赤酵母表达系统成功制备了HCMVULl38含多个B表位片段的嵌合病毒样颗粒，免疫小鼠可产生较高水平的体液免疫反应。

关键词：人巨细胞病毒病毒样颗粒疫苗

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趋化因子CXCL14在SLE患者外周血单个核细胞中的表达及启动子甲基化分析

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中国应用生理学杂志 2017年第3期33卷 197-201页

作者：王金丹黄茜茜叶璐璐范超凡郭刚强徐玲娟薛向阳盛秀胜温州医科大学检验医学院、生命科学院浙江温州325035 温州医科大学第二临床医学院浙江温州325035 温州医科大学微生物学和免疫学教研室分子病毒与疫苗研究所热带医学研究所浙江温州325035 金华市中医医院检验科浙江金华321017 金华职业技术学院医学院浙江金华321017

目的:分析趋化因子CXCL14在系统性红斑狼疮(SLE)患者外周血单个核细胞(PBMC)中的表达及其启动子甲基化特征。方法:收集28例SLE患者和20名健康人外周血单个核细胞(PBMC)标本,抽提细胞中RNA,逆转录后,以GAPDH为内参,通过定量PCR检测PBMC中... 详细信息

目的:分析趋化因子CXCL14在系统性红斑狼疮(SLE)患者外周血单个核细胞(PBMC)中的表达及其启动子甲基化特征。方法:收集28例SLE患者和20名健康人外周血单个核细胞(PBMC)标本,抽提细胞中RNA,逆转录后,以GAPDH为内参,通过定量PCR检测PBMC中CXCL14的表达,统计分析CXCL14表达水平与SLE各种临床资料的相关性,探讨PBMC中CXCL14表达与SLE的关系,通过重亚硫酸盐修饰的全基因组DNA用以BSP测序来明确不同标本中CXCL14启动子中甲基化位点的甲基化率。结果:CXCL14在SLE患者和正常人PBMC中的表达量存在显著差异(P<0.05)。与健康人PBMC中CXCL14的含量相比较,CXCL14在SLE患者PBMC中表达量显著降低。与进一步CXCL14表达水平与SLE各种临床资料的相关性分析显示,CXCL14表达水平与SSB抗体(干燥综合征B抗体)、蛋白尿及血小板计数相关。与SSB抗体阴性SLE患者比较,SSB抗体阳性患者CXCL14表达水平更低(P<0.05);与蛋白尿阴性SLE患者相比,蛋白尿阳性患者CXCL14表达水平更低(P<0.05);而血小板升高患者的CXCL14表达水平更高(P<0.05)。CXCL14表达水平与SLE活动、肾损害指标、抗ds-DNA、C反应蛋白(CRP)、补体C3水平等指标未见显著相关性。CXCL14启动子区甲基化分析显示,SLE患者Cp G岛甲基化明显高于正常对照。结论:PBMC中低表达的CXCL14与SLE发生发展相关,其启动子区Cp G岛过度甲基化是SLE患者CXCL14低表达的重要机制。

关键词：系统性红斑狼疮趋化因子 CXCL14 甲基化

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程序性死亡受体配体-1 B细胞表位预测与分析

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温州医科大学学报 2018年第1期48卷 7-12,19页

作者：陈旭东程开吕开绩张丽芳朱冠保温州医科大学附属第一医院胃肠外科浙江温州325015 温州医科大学微生物学与免疫学教研室分子病毒与免疫研究所热带医学研究所浙江温州325035

目的:预测和筛选程序性死亡受体配体-1(PD-L1)的B细胞表位,以期用于能够阻断程序性死亡受体(PD-1)和其配体结合的拮抗剂的研究。方法:以人和小鼠的PD-L1的全长氨基酸序列为基础,利用生物信息学方法,采用Hopp&Woods的亲水性方案、Zim... 详细信息

目的:预测和筛选程序性死亡受体配体-1(PD-L1)的B细胞表位,以期用于能够阻断程序性死亡受体(PD-1)和其配体结合的拮抗剂的研究。方法:以人和小鼠的PD-L1的全长氨基酸序列为基础,利用生物信息学方法,采用Hopp&Woods的亲水性方案、Zimmerman极性参数、Jameson-Wolf抗原指数方案和Emini表面可及性方案等,结合PD-L1的二级结构与其柔性区域对PD-L1的优势B细胞表位区段进行综合分析,建立3D模型,结合功能定位,进一步运用抗原指数分析预测,将人与小鼠的B细胞表位进行对比分析,并与多种实验动物进行同源性分析。结果:人和小鼠的PD-L1均为一型跨膜蛋白,均由290个氨基酸残基组成,相对分子质量均为33 kDa。人和小鼠PD-L1的胞外段分别位于N端的19~238和19~239。经综合分析,与PD-1、PDL1结合相关的人和小鼠的B细胞优势表位可能分别位于其氨基酸序列N端的41~46、60~63、71~75和40~48、58~63、72~88区段,即KFPVEK、EDKN、EEDLK和RFPVERELDL、EKEDE、EDLKPQH肽段;同源性分析显示包含本研究所预测的表位的氨基酸序列在多种动物之间高度保守。结论:将生物信息学预测B细胞表位的方法与3D模型建立及功能定位的方法相结合,筛选出人和鼠各3条与PD-L1功能区相近的优势B表位,为阻断PD-1和PD-L1结合的拮抗剂的研究提供了理论基础。

关键词：程序性死亡受体配体-1 B细胞表位肿瘤免疫疗法

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PD-L2蛋白B细胞表位预测及其与PD-1结合的三维结构分析

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温州医科大学学报 2018年第5期48卷 319-324,329页

作者：程开陈旭东吕开绩金劲激叶晓鲜张丽芳朱冠保温州医科大学附属第一医院胃肠外科浙江温州325015 温州医科大学微生物学与免疫学教研室分子病毒与免疫研究所热带医学研究所浙江温州325035

目的:对人源程序性死亡因子1配体2(PD-L2)的B细胞表位进行预测及其与PD-1结合的三维结构分析。方法:采用生物信息学分析软件及服务器上的在线分析系统预测人类PD-L2蛋白的二级结构,柔性区域,Hopp&Woods亲水性、Zimmerman极性参数和J... 详细信息

目的:对人源程序性死亡因子1配体2(PD-L2)的B细胞表位进行预测及其与PD-1结合的三维结构分析。方法:采用生物信息学分析软件及服务器上的在线分析系统预测人类PD-L2蛋白的二级结构,柔性区域,Hopp&Woods亲水性、Zimmerman极性参数和Jameson-Wolf抗原指数以及Emini表面可及性方案等,预测结果被用以对PD-L2的优势B细胞表位区段进行多方面分析。运用抗原指数分析,预测PD-L2的B细胞表位。使用BLAST分析人源PD-L2与小鼠PD-L2的同源性,将人源PD-L2的B表位与小鼠PD-L2的序列进行匹配。将与人源PD-L2表位匹配的序列在小鼠PD-1与小鼠PD-L2的结合模型上定位,对其立体结构进行模拟,进一步直观地分析B细胞表位与蛋白结合位点的关系。结果:PD-L2的全长氨基酸序列共含有273个氨基酸,相对分子质量为31 k Da的可溶性蛋白;经综合分析,其B细胞优势表位可能为氨基酸序列N端的60~72、93~97、133~139、164~171区段。模拟立体结构分析显示表位60~72区段"QKVENDTSPHRER"位于PD-1与PDL2的结合区域内。结论:利用生物信息学预测发现PD-L2的优势B细胞表位中,60~72、93~97、133~139、164~171区段为PD-L2的B细胞表位,其中表位60~72区段"QKVENDTSPHRER"位于PD-1与PD-L2的结合区域内。可为PD-L2抗体设计和研究提供理论基础。

关键词：程序性死亡因子1 程序性死亡因子配体2 B细胞表位立体结构

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人巨细胞病毒US31蛋白的特异性抗体的制备及鉴定

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中国卫生检验杂志 2020年第17期30卷 2102-2105,2108页

作者：李宝青项超丽谢尚丹施昕妤郭刚强薛向阳温州医科大学附属第二医院浙江温州325000 温州医科大学第二临床医学院浙江温州325000 温州医科大学微生物学和免疫学教研室分子病毒与疫苗研究所热带医学研究所浙江温州325000

目的制备人巨细胞病毒(HCMV)US31原核表达蛋白及其多克隆抗体。方法HCMV US31基因经原核密码子优化后进行全基因合成,克隆至p ET21a(+)原核表达载体,构建p ET21a(+)/HCMV US31重组质粒,测序鉴定;将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG... 详细信息

目的制备人巨细胞病毒(HCMV)US31原核表达蛋白及其多克隆抗体。方法HCMV US31基因经原核密码子优化后进行全基因合成,克隆至p ET21a(+)原核表达载体,构建p ET21a(+)/HCMV US31重组质粒,测序鉴定;将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导目的蛋白表达,Ni-NTA亲和层析法纯化US31蛋白,免疫新西兰兔制备多克隆抗体,ELISA、Western blot及免疫荧光方法检测抗体效价和特异性。结果在大肠杆菌中诱导出高表达的HCMV US31融合蛋白,经镍柱亲和纯化后获得高纯度的目的蛋白;免疫新西兰兔诱导产生特异性的Ig G抗体,效价为1∶49600;经ELISA、Western blot以及免疫荧光均证实制备的特异性抗体可识别细胞中表达的US31蛋白。结论成功制备了HCMV US31蛋白及特异性抗体,为进一步研究US31蛋白的生物学功能奠定了基础。

关键词：人巨细胞病毒 US31蛋白多克隆抗体

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人巨细胞病毒US31基因序列特征分析及B细胞表位预测

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温州医科大学学报 2016年第11期46卷 781-786页

作者：郭刚强谢尙丹叶思思孙祥威张良张丽芳薛向阳温州医科大学微生物学与免疫学教研室分子病毒与免疫研究所热带医学研究所浙江温州325035 温州医科大学第二临床医学院浙江温州325035 温州医科大学附属第一医院胃肠外科浙江温州325015

目的：分析人巨细胞病毒（HCMV）US31基因序列，预测US31基因编码蛋白的B细胞优势表位。方法：基于US31基因编码蛋白的氨基酸序列，结合亲水性参数、可及性参数、抗原性参数、柔韧性参数及二级结构方案对HCMVUS31基因编码各型蛋白的B细... 详细信息

目的：分析人巨细胞病毒（HCMV）US31基因序列，预测US31基因编码蛋白的B细胞优势表位。方法：基于US31基因编码蛋白的氨基酸序列，结合亲水性参数、可及性参数、抗原性参数、柔韧性参数及二级结构方案对HCMVUS31基因编码各型蛋白的B细胞表位进行预测，参照已建立的预测方法综合评价US31基因B细胞优势表位。结果：US31核苷酸序列变异较少，大部分是同义突变，氨基酸序列高度保守；其编码蛋白全长为162个氨基酸，相对分子质量20kD，等电点7.66，为可溶性蛋白，二级结构中以无规则卷曲为主。经综合分析，US31基因的B细胞优势表位可能存在于氨基酸序列N端的5～19、32～47、58～68、110～124区段。结论：多参数预测HCMVpUS31的B细胞优势表位，为进一步研究蛋白特征、制备单克隆抗体及表位疫苗提供依据。

关键词：人巨细胞病毒 US31基因 B细胞表位

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诱导性表达人巨细胞病毒UL138蛋白的胃癌细胞株构建及其效应评价

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温州医科大学学报 2017年第2期47卷 79-84页

作者：张良陈文静郭刚强孙祥威叶璐璐胡畅远金劲激沈贤薛向阳温州医科大学附属第一医院胃肠外科浙江温州325015 温州医科大学微生物学与免疫学教研室分子病毒与免疫研究所热带医学研究所浙江温州325035 温州医科大学附属第二医院胃肠外科浙江温州325027

目的:构建可诱导表达人巨细胞病毒(HCMV)UL138蛋白的稳定遗传胃癌细胞系,并评价UL138对胃癌细胞的生物学效应。方法:将p CMV-tet3G质粒转染BGC-823胃癌细胞,通过G418及荧光素酶活性检测筛选BGCTet-on细胞株。再将含有UL138外源基因的p T... 详细信息

目的:构建可诱导表达人巨细胞病毒(HCMV)UL138蛋白的稳定遗传胃癌细胞系,并评价UL138对胃癌细胞的生物学效应。方法:将p CMV-tet3G质粒转染BGC-823胃癌细胞,通过G418及荧光素酶活性检测筛选BGCTet-on细胞株。再将含有UL138外源基因的p TRE3G-UL138质粒转染稳定BGCTet-on细胞株,通过G418及潮霉素双抗筛选,获得诱导性表达UL138基因的胃癌细胞(BGC-UL138_(Tet-on))。强力霉素(DOX)诱导后,采用Western blot验证UL138蛋白表达,采用流式细胞术及CCK8试剂盒检测UL138蛋白表达对胃癌细胞的生长周期及增殖的影响。构建荷瘤裸鼠模型,体内验证UL138蛋白表达对胃癌细胞增殖的影响。结果:成功构建了DOX诱导性表达的、携带UL138基因的BGC-UL138_(Tet-on)稳转细胞株。UL138蛋白表达可显著抑制胃癌细胞增殖;流式细胞术检测显示UL138蛋白表达阻滞BGC-823细胞周期在G_1期。荷瘤裸鼠模型体内实验发现,DOX腹腔注射诱导UL138蛋白表达后,BGC-UL138_(Tet-on)移植瘤体积缩小甚至消失。结论:成功构建可诱导表达UL138蛋白的胃癌细胞株,进一步证实HCMV基因UL138的表达可在体内和体外抑制胃癌细胞的增殖,细胞实验提示细胞周期阻断在G_1期。

关键词：巨细胞病毒 UL138 Tet-on系统胃肿瘤基因,肿瘤抑制

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宫颈肿瘤组织高危型HPV新分型检测方法的建立及应用

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肿瘤学杂志 2015年第11期21卷 889-894页

作者：谢旺凯王慧静肖兰兰计苏惠王俭陈向敏邹阮敏陈俊薛向阳温州医科大学第二临床学院浙江温州325035 温州医科大学检验医学院生命科学学院浙江温州325035 温州医科大学附属第一医院浙江温州325000 温州医科大学微生物学与免疫学教研室分子病毒与免疫研究所热带医学研究所浙江温州325035

[目的]建立一种新型宫颈肿瘤组织高危型人乳头瘤病毒(HPV)检测及分型方法,并评价其临床应用。[方法]基于我国人群流行的5种高危型HPV(HPV 16、18、31、33、51)的E6/E7早期基因序列,设计特异性引物,以明确HPV型别的宫颈癌细胞株及宫颈肿... 详细信息

[目的]建立一种新型宫颈肿瘤组织高危型人乳头瘤病毒(HPV)检测及分型方法,并评价其临床应用。[方法]基于我国人群流行的5种高危型HPV(HPV 16、18、31、33、51)的E6/E7早期基因序列,设计特异性引物,以明确HPV型别的宫颈癌细胞株及宫颈肿瘤组织为模板,进行PCR检测,结合基因测序验证引物的特异性。进一步优化条件,建立高危型HPV多重PCR检测方法,检测65例宫颈肿瘤组织标本,与临床上使用的流式荧光杂交HPV检测法比较,评价其敏感性和特异性。[结果]成功建立可同时检测5种高危型HPV的多重PCR检测方法,对65例宫颈肿瘤组织进行高危型HPV检测,检出率为72.3%,明显高于临床流式荧光杂交检测法的检出率(32.31%)(χ2=3.86,P<0.05)。[结论 ]基于HPV E6/E7早期基因的高危型HPV多重PCR检测方法是特异、灵敏的高危型HPV检测方法。

关键词：人乳头瘤病毒多聚酶链反应基因分型宫颈肿瘤

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miR-29a在系统性红斑狼疮患者血浆中的表达及意义

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浙江医学 2015年第19期37卷 1565-1569页

作者：徐玲娟叶璐璐陈阿琼黄茜茜章慧娣陈朝生薛向阳浙江中医药大学附属金华市中医医院检验科 321017 温州医科大学微生物学和免疫学教研室分子病毒与疫苗研究所热带医学研究所宁波李惠利医院风湿免疫科温州医科大学附属第一医院肾内科

目的分析microRNA-29a（miR-29a）在系统性红斑狼疮（SLE）患者血浆中的表达水平及与SLE临床特征的相关性.方法建立检测miR-29a的实时荧光定量PCR（RT-qPCR）方法,分析48例SLE患者和20例健康体检者血浆中miR-29a的表达水平,ROC曲线评... 详细信息

目的分析microRNA-29a（miR-29a）在系统性红斑狼疮（SLE）患者血浆中的表达水平及与SLE临床特征的相关性.方法建立检测miR-29a的实时荧光定量PCR（RT-qPCR）方法,分析48例SLE患者和20例健康体检者血浆中miR-29a的表达水平,ROC曲线评估其作为SLE诊断标记物的意义,统计分析其表达与SLE患者临床特征的相关性.结果与健康体检者比较,SLE患者血浆miR-29a表达水平明显上调（Z=3.476,P=0.0009）;血清miR-29a诊断SLE的ROC AUC为0.794 （95％Cl：0.689～0.898）,具较好诊断SLE的效能;抗β 2GP1抗体＞20RU/ml患者的血浆miR-29a水平明显升高（P=0.033）,Pearson相关分析显示,SLE患者血浆miR-29a表达水平与抗β2GP1抗体水平呈正相关（r=0.584,P=0.001）,而与不同SLEDAI评分及其他SLE活动相关指标等差异均无统计学意义（均P ＞0.05）. 结论 miR-29a在SLE患者血浆中的表达水平明显上调,且血浆miR-29a上调与SLE患者自身抗体水平相关,其调节机制尚待进一步的研究.

关键词：系统性红斑狼疮临床诊断

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