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生物工程学报 2024年第2期40卷 350-366页

作者：唐秀兰邓安琦陈文聪赵妍王茂鹏李昌温州大学病毒学研究所温州市病毒学与免疫学重点实验室浙江温州325035 温州市农产品检验测试中心浙江温州325299 中国农业科学院长春兽医研究所吉林长春130122

纳米抗体(nanobody,Nb)是在骆驼科血清中发现的一种新型抗体,具有体积小、特异性强、稳定性高、易于表达和能识别隐藏的抗原表位等优势,在各个领域具有广泛的应用价值。本文介绍了纳米抗体筛选与优化过程,包括纳米抗体文库构建、体外展... 详细信息

纳米抗体(nanobody,Nb)是在骆驼科血清中发现的一种新型抗体,具有体积小、特异性强、稳定性高、易于表达和能识别隐藏的抗原表位等优势,在各个领域具有广泛的应用价值。本文介绍了纳米抗体筛选与优化过程,包括纳米抗体文库构建、体外展示和亲和力成熟3个重要技术阶段的分类与特点。其中,简要描述了天然、免疫及半合成/合成文库的制备方法与重要参数,并系统介绍了应用噬菌体、酵母、细菌、核糖体/mRNA和真核细胞等表面展示系统,以及酵母双杂交、高通量测序和质谱鉴定方法,共8种不同体外展示技术进行快速筛选的方法及其优缺点,汇总用于提升纳米抗体功能可靠性的体外及计算机辅助亲和力成熟技术平台,为综合运用各种技术手段快速获得稳定、可靠、特异的纳米抗体类药物或诊断制剂提供了参考。

关键词：纳米抗体体外展示筛选亲和力成熟

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Lyon IARC多瘤病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法的建立

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中国动物传染病学报 2024年第6期32卷 98-104页

作者：雷晓哓赵宸辰张昕宇李玉莹黄海鑫汪伟郑敏孙文超兰添温州大学病毒学研究所温州市病毒学与免疫学重点实验室温州 325035 广西动物疫病预防控制中心南宁 530004

Lyon IARC多瘤病毒(LIPyV)是2017年于人类皮肤样本中新发现的病毒,为更加了解其致病性和流行病学状况,本试验拟建立一种灵敏度高、可快速检测LIPyV的SYBR Green I实时荧光定量PCR方法,并对该方法的特异性、灵敏性和重复性进行评价.结果... 详细信息

Lyon IARC多瘤病毒(LIPyV)是2017年于人类皮肤样本中新发现的病毒,为更加了解其致病性和流行病学状况,本试验拟建立一种灵敏度高、可快速检测LIPyV的SYBR Green I实时荧光定量PCR方法,并对该方法的特异性、灵敏性和重复性进行评价.结果显示:该检测方法的Ct值与标准品模板线性关系良好,相关系数为0.9989;利用该方法检测CBoV、FBoV、AGV2这几种病毒的基因组均没有出现非特异性扩增;敏感性比普通PCR检测方法高100倍;组内和组间重复性试验的变异系数小于1%;通过60份样本检测发现LIPyV阳性率为6.67%,比普通PCR更灵敏可靠.结果表明,本试验建立的SYBR Green I实时荧光定量PCR方法可用于LIPyV的快速检测.

关键词： Lyon IARC多瘤病毒 SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR 特异性灵敏度

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猪乳头瘤病毒荧光定量PCR检测方法的建立

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中国兽医科学 2023年第1期53卷 23-28页

作者：张昕宇李玉莹雷晓哓赵宸辰黄海鑫汪伟郑敏孙文超兰添温州大学病毒学研究所温州市病毒学与免疫学重点实验室浙江温州325035 广西动物疫病预防控制中心广西南宁530001

为建立可以快速检测猪乳头瘤病毒(SsPV)的方法,根据SsPV E2基因的保守序列设计引物,利用普通PCR方法扩增SsPV E2保守基因片段,将其克隆到pMD18-T载体,构建重组质粒pMD18-T-SsPV作为标准品质粒,经实时荧光定量PCR(qPCR)条件优化后,进行... 详细信息

为建立可以快速检测猪乳头瘤病毒(SsPV)的方法,根据SsPV E2基因的保守序列设计引物,利用普通PCR方法扩增SsPV E2保守基因片段,将其克隆到pMD18-T载体,构建重组质粒pMD18-T-SsPV作为标准品质粒,经实时荧光定量PCR(qPCR)条件优化后,进行特异性、灵敏性和重复性试验。结果显示,所建立的qPCR方法在7.2×10^(1)~7.2×10^(8)copies/μL模板浓度区间内与Ct值呈现良好的线性关系,检测下限为7.2×100copies/μL,灵敏度比普通PCR高100倍;与猪德尔塔冠状病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪捷申病病毒、猪圆环病毒2型、猪圆环病毒4型无交叉反应;该方法组内变异系数和组间变异系数均小于2.0%;对44份猪皮肤组织样品进行检测,检测阳性率为2.27%,普通PCR检测阳性率为0%。综上所述,本试验成功建立了SsPV qPCR检测方法,为SsPV的快速检测提供了可靠方法。

关键词：猪乳头瘤病毒实时荧光定量PCR 快速检测

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猪传染性胃肠炎病毒荧光RT-RAA方法的建立及初步应用

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畜牧兽医学报 2023年第5期54卷 2208-2214页

作者：吕荞赵钟毅尹德玮刘宇梦汪伟郑敏胡诗悦赵宸辰张昕宇雷晓哓陆景仪孙文超兰添温州大学病毒学研究所温州市病毒学与免疫学重点实验室温州325035 广西大学动物科学技术学院南宁530003 广西动物疫病预防控制中心南宁530004 长春市动物疫病预防控制中心长春130061

旨在建立一种简便、高效的猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus,TGEV)的检测方法。本研究针对TGEV N基因设计了特异性的引物和探针,并构建重组质粒标准品TGEV-N,经过筛选及优化后建立TGEV荧光逆转录重组酶介异等温... 详细信息

旨在建立一种简便、高效的猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus,TGEV)的检测方法。本研究针对TGEV N基因设计了特异性的引物和探针,并构建重组质粒标准品TGEV-N,经过筛选及优化后建立TGEV荧光逆转录重组酶介异等温扩增(reverse-transcription recombinase-aid amplification,RT-RAA)检测方法。结果显示,该方法在42℃恒温条件下进行,20 min即可完成检测,与猪流行性腹泻病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪丁型冠状病毒、猪肠道α冠状病毒等猪源病毒均无交叉反应;将TGEV-N稀释后,以10^(0)~10^(6)拷贝·μL^(-1)作为模板,进行敏感性试验,结果表明,该方法最低检出限可以达到6.62×10^(1)拷贝·μL^(-1);采用该方法对50份猪源样品进行检测,阳性率为6%(3/50),检测结果与RT-PCR一致。本试验建立的TGEV荧光RT-RAA检测方法简便、高效、特异、灵敏,为TGEV的临床筛查提供可行技术。

关键词：猪传染性胃肠炎病毒荧光RT-RAA 临床检测

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猪捷申病毒2型SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法的建立

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中国兽医科学 2022年第12期52卷 1525-1530页

作者：赵宸辰李玉莹张昕宇雷晓晓黄海鑫汪伟郑敏孙文超兰添温州大学病毒学研究所温州市病毒学与免疫学重点实验室浙江温州325035 广西动物疫病预防控制中心广西南宁530004

猪捷申病毒2型(PTV2)属于小RNA病毒科、捷申病毒属,主要引起猪的脑脊髓灰质炎、肺炎、下痢、心包炎、心肌炎和繁殖障碍等症状。为了建立一种快速且灵敏的PTV2检测方法,本研究扩增VP1基因保守区域,建立PTV2的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检... 详细信息

猪捷申病毒2型(PTV2)属于小RNA病毒科、捷申病毒属,主要引起猪的脑脊髓灰质炎、肺炎、下痢、心包炎、心肌炎和繁殖障碍等症状。为了建立一种快速且灵敏的PTV2检测方法,本研究扩增VP1基因保守区域,建立PTV2的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法,并进行敏感性、特异性和重复性试验。结果显示,本研究建立的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法Ct值与标准品模板在1.21×109~1.21×101copies/μL范围内呈良好的线性关系,相关系数为0.996 7,斜率为-3.743 4。本试验检测灵敏度可达到1.21×101copies/μL。该方法对PRoV、TGEV、PDCoV等猪常见病原检测均无特异性扩增。该方法组内组间变异率小于1%。运用该方法进行样本检测,PTV阳性检出率为12.24%,普通PCR检出率为0。综上所述,本研究成功建立了PTV2 SYBRGreenⅠ荧光定量PCR检测方法,为快速准确检测PTV2提供了高效技术支持。

关键词：猪捷申病毒2型 SYBR GreenⅠ荧光定量PCR 检测方法

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唾液乳杆菌CICC23174株全基因组测序及功能分析

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中国兽医学报 2024年第2期44卷 290-297页

作者：王丽屏邓玲聪王大红王茂鹏尹革芬云南农业大学动物医学院云南昆明650201 南京农业大学动物医学院江苏南京210000 温州大学病毒学研究所温州市病毒学与免疫学重点实验室浙江温州325035 广东省养猪与猪病防控技术研究企业重点实验室广东广州511400

为探究唾液乳杆菌CICC23174株的生物学特性和基因功能,本研究以从鸡肠道分离得到的唾液乳杆菌CICC23174株为研究对象,通过使用二代测序平台HiSeq2000进行测序,利用多种生物学信息软件对原始数据进行组装和优化,并对其基因信息进行功能... 详细信息

为探究唾液乳杆菌CICC23174株的生物学特性和基因功能,本研究以从鸡肠道分离得到的唾液乳杆菌CICC23174株为研究对象,通过使用二代测序平台HiSeq2000进行测序,利用多种生物学信息软件对原始数据进行组装和优化,并对其基因信息进行功能注释、细菌素和信号肽预测、基因共线性比较和分子进化树分析。基因预测结果表明,唾液乳杆菌CICC23174株基因组大小为203542 bp,GC含量约为32.84%,基因组特征显示其编码基因1890个,含有3个细菌素和50个信号肽。重要的是,唾液乳杆菌CICC23174株含有27个特有基因,构成4个系统分别为Ⅰ型-CRISPR-Cas基因防御系统、Ⅱ型毒素-抗毒素系统、肿瘤抑制基因和蛋白分泌途径。而且基因共线性分析发现CICC23174株与模式菌株UCC118唾液乳杆菌最为相似,但是16S rRNA分子进化树结果表明CICC23174株与唾液乳杆菌FZJTZ9M6株遗传距离较近。本研究结果为丰富唾液乳杆菌的物种进化库,挖掘唾液乳杆菌潜在的益生功能奠定了基础。

关键词：唾液乳杆菌CICC23174株基因组学生物信息学功能注释细菌素基因共线性分析

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唾液乳杆菌CICC23174全基因组测序及功能分析

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中国兽医学报 2024年第8期44卷 1659-1666页

作者：王丽屏邓玲聪王大红王茂鹏尹革芬云南农业大学动物医学院云南昆明650201 南京农业大学动物医学院江苏南京210000 广东省养猪与猪病防控技术研究企业重点实验室广东广州511400 温州大学病毒学研究所温州市病毒学与免疫学重点实验室浙江温州325035

为探究唾液乳杆菌CICC23174的生物学特性和基因功能,本研究以从鸡肠道分离得到的唾液乳杆菌CICC23174为研究对象,通过使用二代测序平台HiSeq2000进行测序,利用多种生物学信息软件对原始数据进行组装和优化,并对其基因信息进行功能注释... 详细信息

为探究唾液乳杆菌CICC23174的生物学特性和基因功能,本研究以从鸡肠道分离得到的唾液乳杆菌CICC23174为研究对象,通过使用二代测序平台HiSeq2000进行测序,利用多种生物学信息软件对原始数据进行组装和优化,并对其基因信息进行功能注释、细菌素和信号肽预测、基因共线性比较和分子进化树分析。基因预测结果表明,唾液乳杆菌CICC23174基因组大小为203542 bp,GC含量约为32.84%,基因组特征显示其编码基因1890个,含有3个细菌素和50个信号肽。重要的是,唾液乳杆菌CICC23174菌株含有27个特有基因,构成4个系统分别为Ⅰ型-CRISPR-Cas基因防御系统、Ⅱ型毒素-抗毒素系统、抑制肿瘤逃逸基因和蛋白分泌途径。而且基因共线性分析发现CICC23174菌株与模式菌株UCC118唾液乳杆菌最为相似,但是16S rRNA分子进化树结果表明CICC23174菌株与唾液乳杆菌FZJTZ9M6遗传距离较近。本研究结果为丰富唾液乳杆菌的物种进化库,挖掘唾液乳杆菌潜在益生功能奠定了基础。

关键词：唾液乳杆菌基因组学生物信息学功能注释细菌素基因共线性分析

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植物乳杆菌表达重组新冠病毒M抗原表位及免疫原性分析

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中国兽医学报 2024年第8期44卷 1719-1727页

作者：邓安琦叶丹妮艾雪言唐秀兰陈文聪陈嘉豪郝嘉翼邓玲聪李昌陈永福金俊杰王茂鹏温州大学病毒学研究所温州市病毒学与免疫学重点实验室浙江温州325035 中国农业科学院长春兽医研究所吉林长春130122 内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室内蒙古呼和浩特010018 温州科技职业学院(温州市农业科学研究院) 浙江温州325006

新型冠状病毒(SARS-CoV-2)是引起新冠肺炎的病原体,其变异快、传播强,导致疫情广泛流行,以疫苗接种为主要防控措施。尽管已有大量新冠肽表位疫苗和黏膜型疫苗的研究,但靶向黏膜的肽表位疫苗和其功能评价的研究鲜有报道。本研究以IEDB数... 详细信息

新型冠状病毒(SARS-CoV-2)是引起新冠肺炎的病原体,其变异快、传播强,导致疫情广泛流行,以疫苗接种为主要防控措施。尽管已有大量新冠肽表位疫苗和黏膜型疫苗的研究,但靶向黏膜的肽表位疫苗和其功能评价的研究鲜有报道。本研究以IEDB数据库预测SARS-CoV-2结构蛋白M肽表位作为抗原靶点,设计含3050及1229信号肽和DCpep优化的MS-3S基因,插入MS2噬菌体衣壳蛋白中,通过PCR和无缝克隆技术构建表达质粒pSIP:MS-3S,转化到植物乳杆菌LP18中获得重组菌LP18:MS-3S。通过对诱导时间、诱导剂质量浓度、转速和初始pH值等表达条件进行优化及鼻内免疫实验,验证重组菌免疫效果。结果显示,获得出916 bp修饰和优化的目的基因MS-3S,并成功构建重组菌LP18:MS-3S,经Western blot、流式细胞术、免疫荧光等检测方法验证,获得重组蛋白表达的最佳条件:诱导时间为4 h,诱导肽质量浓度为100μg/L,培养基初始pH值为7.0,转速为100 r/min。通过ELISA试验验证,在小鼠的血清、肺泡灌洗液和粪便稀释液中,检测出抗肽表位的特异性抗体。本研究成功构建了1株表达新冠M蛋白肽表位抗原的重组菌,并且可诱导机体产生体液和黏膜免疫,为新冠黏膜免疫候选疫苗的研制奠定了基础。

关键词： SARS-CoV-2 M蛋白肽表位植物乳杆菌鼻内免疫

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猪急性腹泻综合征病毒N基因多克隆抗体的制备及其生物信息学分析

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中国病原生物学杂志 2022年第8期17卷 873-879页

作者：于子萍兰添陈伟月张华韵于宁吕荞施瑶凯刘宇梦李程凯鲁会军孙文超金宁一温州大学病毒学研究所温州市病毒学与免疫学重点实验室浙江温州325035 中国农业科学院长春兽医研究所吉林大学动物医学学院广西大学动物科学技术学院温州医科大学附属第二医院育英儿童医院

目的制备SADS-CoV N蛋白的多克隆抗体,进一步了解及探究SADS-CoV N蛋白的基本结构,为猪急性腹泻综合征病毒疫苗的研制奠定基础。方法将N蛋白基因片段克隆至pColdⅡ载体,并将其转化至BL21感受态细胞,采用1 mmol/L IPTG诱导蛋白表达,经Ni-... 详细信息

目的制备SADS-CoV N蛋白的多克隆抗体,进一步了解及探究SADS-CoV N蛋白的基本结构,为猪急性腹泻综合征病毒疫苗的研制奠定基础。方法将N蛋白基因片段克隆至pColdⅡ载体,并将其转化至BL21感受态细胞,采用1 mmol/L IPTG诱导蛋白表达,经Ni-NTA柱纯化后免疫小鼠,制备多克隆抗体。利用生物信息学软件对SADS-CoV N蛋白的理化性质、亲疏水性、信号肽、二级结构、三级结构及B淋巴细胞与T淋巴细胞抗原表位进行预测。结果重组菌在37℃经1mmol/L IPTG诱导表达分子质量为48 ku的目的蛋白,与预期N蛋白分子质量相符。用该蛋白免疫小鼠,制备的抗N蛋白多克隆抗体的效价可达1︰200000;经IFA、Western blot鉴定,制备的多克隆抗体能够特异性识别SADS-CoV感染猴肾细胞(Vero)表达的N蛋白,具有较高的抗体效价及特异性。生物信息学分析SADS-CoV N由375个氨基酸组成,分子质量为41.636 ku,等电点为9.90;N蛋白为亲水性蛋白,无信号肽,无跨膜结构;螺旋和无规则卷曲是N蛋白二级结构中主要的蛋白质元件;N蛋白存在9个潜在的B细胞表位,第127-135位、134-142位、275-283位可能存在T细胞表位。结论成功构建pColdⅡ-SADS-CoV-N重组质粒,用表达的重组蛋白免疫BALB/c小鼠获得高效的特异抗体血清。生物信息学预测SADS-CoV N含有丰富的螺旋和无规则卷曲结构,以及B、T淋巴细胞抗原表位,为揭示SADS-CoV N蛋白的功能及SADS-CoV相关的转录机制奠定了基础。

关键词：猪急性腹泻综合征病毒 N蛋白生物信息学原核表达多克隆抗体

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Lyon IARC多瘤病毒SYBR Green I实时荧光定量PCR方法的建立

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中国动物传染病学报 2024年第6期32卷 98-104页

作者：雷晓哓赵宸辰张昕宇李玉莹黄海鑫汪伟郑敏孙文超兰添温州大学病毒学研究所温州市病毒学与免疫学重点实验室温州325035 广西动物疫病预防控制中心南宁530004

Lyon IARC多瘤病毒(LIPyV)是2017年于人类皮肤样本中新发现的病毒,为更加了解其致病性和流行病学状况,本试验拟建立一种灵敏度高、可快速检测LIPyV的SYBR Green I实时荧光定量PCR方法,并对该方法的特异性、灵敏性和重复性进行评价。结... 详细信息

Lyon IARC多瘤病毒(LIPyV)是2017年于人类皮肤样本中新发现的病毒,为更加了解其致病性和流行病学状况,本试验拟建立一种灵敏度高、可快速检测LIPyV的SYBR Green I实时荧光定量PCR方法,并对该方法的特异性、灵敏性和重复性进行评价。结果显示:该检测方法的Ct值与标准品模板线性关系良好,相关系数为0.9989;利用该方法检测CBoV、FBoV、AGV2这几种病毒的基因组均没有出现非特异性扩增;敏感性比普通PCR检测方法高100倍;组内和组间重复性试验的变异系数小于1%;通过60份样本检测发现LIPyV阳性率为6.67%,比普通PCR更灵敏可靠。结果表明,本试验建立的SYBR Green I实时荧光定量PCR方法可用于LIPyV的快速检测。

关键词： Lyon IARC多瘤病毒 SYBR Green I实时荧光定量PCR 特异性灵敏度

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