目的:探讨顺铂对LTEP-a-2细胞内miR-34b、Bcl-2、Smad3表达的影响,明确顺铂的抗癌机制.方法:体外培养LTEP-a-2细胞,实验组加入不同浓度顺铂,阴性对照组为不加顺铂的细胞;给药组细胞在给予相应浓度顺铂作用36小时后,置于倒置显微镜下观察药物处理前后LTEP-a-2细胞的形态变化;收集细胞,加入培养液吹打混匀成细胞重悬液,吸取100μl细胞重悬液Trypan Blue stain染色3分钟,倒置显微镜下观察计数,计算各实验组细胞存活率台盼蓝染色法计算细胞存活率;加药36小时后,每孔加入10μl 0.5％MTT溶液,培养4小时后,置酶标仪上测490nm处各孔OD值,并计算各组细胞抑制率;应用miRNA提取试剂盒按说明提取小RNA,为小RNA加poly A尾后进行反转录,得到cDNA后进行实时荧光定量PCR检测细胞内miR-34b的含量;将收集的各加药组细胞进行SDS-PAGE蛋白电泳,电泳结束后,加入Bcl-2及Smad3蛋白一抗4℃摇床过夜后用TBST洗膜,加入HRP标记的二抗置振荡器孵育,于暗室内曝光并拍照.
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