目的:卵巢粒层细胞瘤(ovary granulosa cell tumor,OGCT)与纤维卵泡膜细胞瘤(ovarian fibrothecoma,OF)是卵巢性索间质肿瘤较为常见的类型。由于二者均含有卵泡膜细胞且OGCT呈弥漫性生长模式时与富于细胞的OF和黄素化的OF组织学形态具有相似性,造成二者在病理诊断过程中鉴别困难。本文旨在通过探究OGCT与OF蛋白质组学差异、筛选二者间差异表达蛋白质(differentially expressed proteins,DEPs),发现鉴别诊断二者的生物学标志物。方法:选取5例OGCT和5例OF患者的新鲜肿瘤样本组织,采用蛋白质消化、肽段纯化技术及液相色谱-质谱/质谱分析进行蛋白质定量。运用软件对OGCT和OF的蛋白质进行DEPs分析;对DEPs进行基因本体(gene ontology,GO)和京都基因和基因组数据库(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析,并在生物过程(bioprocess,BP)、分子功能(molecular function,MF)和细胞组分(cell component,CC)方面对蛋白质/基因进行功能注释,探讨DEPs显著富集的信号通路;通过检索基因/蛋白质相互作用(search tool for the retrieval of interacting genes/proteins,STRING)数据库获得筛选出的DEPs相互作用信息,构建蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein interaction,PPI)网络。选取26例OGCT和28例OF石蜡包埋组织,通过组织芯片技术和免疫组织化学染色法验证筛选出的DEPs在OGCT和OF中的表达情况。结果:共筛选出24个OGCT与OF显著DEPs,其中13个蛋白质在OGCT中表达量显著上调,11个蛋白质在OF中表达量显著上调。GO富集分析结果显示:富集到BP上的通路包括细胞外基质(extracellular matrix,ECM)处理过程,细胞外结构组织,有机酸、羧酸、脂肪酸和单羧酸分解代谢过程;富集到CC上的通路包括含胶原蛋白的ECM、内质网腔和线粒体基质;富集到MF上的通路包括硫化物结合、ECM结构成分、酰胺结合、胶原结合、转移酶活性和转移酰基。KEGG富集分析结果显示:上调的DEPs主要富集于缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解途径;下调的DEPs主要富集于先天性谷胱甘肽代谢缺陷症、朊病毒疾病、花生四烯酸代谢途径、补体系统、细胞色素P450对异种生物的代谢作用和药物代谢-细胞色素P450。PPI结果显示24个DEPs与多种蛋白质存在相互作用关系。组织芯片免疫组织化学染色显示:PLOD3在OGCT中高表达,在OF中低表达,与富集分析结果一致。结论:通过蛋白质组学技术和生物信息学分析方法共筛选出24个DEPs,经免疫组织化学验证,PLOD3在OGCT与OF鉴别诊断中具有一定的临床应用价值,有望成为OGCT与OF鉴别诊断的生物学标志物。
目的探讨miR-let-7c-5p/c-myc信号轴在白血病细胞定向单核/巨噬细胞分化中的调控作用。方法采用PMA+LPS+IFN-γ诱导THP-1白血病细胞向单核/巨噬细胞定向分化,PBS作为对照组。诱导48 h后CCK8法测定细胞增殖水平;流式细胞仪测定细胞CD11b与CD14分化抗原表达水平;RT-qPCR检测白血病细胞分化前后miR-let-7c-5p和c-myc的表达变化;蛋白质印迹法检测c-myc蛋白表达变化;双荧光素酶结合实验检测miR-let-7c-5p与c-myc的3′UTR靶向结合和活性调控关系;转染miR-let-7c-5p mimic观察c-myc表达变化后细胞的增殖分化水平变化;过表达c-myc拯救实验观察miR-let-7c-5p对PMA+LPS+IFN-γ诱导的THP-1细胞增殖分化的影响。THP-1细胞转染miR-let-7c-5p inhibitor,观察c-myc表达变化对THP-1定向分化为M1样巨噬细胞的影响。结果与PBS对照组相比,PMA+LPS+IFN-γ诱导48 h后,THP-1细胞的增殖能力明显降低(0.64±0.01 vs 0.33±0.01,t=45.190,P<0.001)。PMA+LPS+IFN-γ实验组的CD11b和CD14平均阳性表达率升高[(5.51±0.89)%vs(17.72±0.86)%,t=17.050,P<0.001;(6.22±0.70)%vs(16.42±0.14)%,t=24.650,P<0.001]。PMA+LPS+IFN-γ实验组的c-myc蛋白表达水平降低(0.87±0.02 vs 0.64±0.06,t=6.041,P=0.004)。PMA+LPS+IFN-γ实验组的miR-let-7c-5p基因表达量高于对照组,而c-myc基因表达量低于对照组,均P<0.001。Luciferase实验证实,miR-let-7c-5p mimic+c-myc-WT组的荧光素酶活性明显低于mimics NC+c-myc-WT组(0.88±0.09 vs 0.62±0.05,t=4.320,P=0.013)。转染miR-let-7c-5p mimic后,miR-let-7c-5p mimic组的c-myc蛋白表达水平低于miR-let-7c-5p mimic NC组(1.03±0.08 vs 0.39±0.07,t=10.420,P<0.001),伴有细胞增殖水平的降低(0.64±0.01 vs 0.42±0.01,t=30.160,P<0.001),CD11b和CD14阳性表达率升高[(2.18±0.53)%vs(22.10±0.87)%,t=33.530,P<0.001;(3.37±0.73)%vs(22.98±5.43)%,t=6.195,P=0.004]。拯救实验结果表明,miR-let-7c-5p mimics+c-myc vector组的c-myc蛋白表达水平高于miR-let-7c-5p mimics组(0.53±0.02 vs 0.84±0.05,t=9.250,P<0.001)。miR-let-7c-5p mimics组的THP-1细胞增殖D值低于miR-let-7c-5p mimics+c-myc vector组(0.62±0.01 vs 0.42±0.01,t=20.330,P<0.001)。miR-let-7c-5p mimics组的平均CD11b、CD14阳性表达率高于miR-let-7c-5p mimics+c-myc vector组[(6.17±0.76)%vs(19.57±5.96)%,t=3.865,P=0.018;(10.36±1.13)%vs(34.89±3.19)%,t=12.56,P<0.001]。miR-let-7c-5p inhibitor干预PMA+LPS+IFN-γ实验组结果显示,与对照组相比较,PMA+LPS+IFN-γ诱导THP-1细胞分化后,c-myc蛋白的表达水平显著降低(0.97±0.05 vs 0.34±0.19,t=5.377,P=0.006),CXCL9、CXCL10、iNOS基因的相对表达水平明显升高,均P<0.001。与PMA+LPS+IFN-γ实验组相比较,PMA+LPS+IFN-γ+miR-let-7c-5p inhibitor组的c-myc蛋白相对表达水平显著升高(0.34±0.06 vs 0.96±0.07,t=11.310,P<0.001),而CXCL9、CXCL10、iNOS基因的相对表达水平明显降低,均P<0.001。结论miR-let-7c-5p可以靶向结合c-myc 3′UTR区,miR-let-7c-5p/c-myc信号轴是白血病细胞定向分化为单核/巨噬细胞的重要途径之一
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