基本局部比对搜索工具(basic local alignment search tool,BLAST)是核酸或蛋白质序列相似性分析最常用的工具之一。因为程序涉及参数较多,一些学生和研究者有时不根据实际情况也不阅读说明书就直接选择默认参数,可能会得出错误结论。BL...
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基本局部比对搜索工具(basic local alignment search tool,BLAST)是核酸或蛋白质序列相似性分析最常用的工具之一。因为程序涉及参数较多,一些学生和研究者有时不根据实际情况也不阅读说明书就直接选择默认参数,可能会得出错误结论。BLAST可以进行核酸、蛋白质序列及其相互间的比对,一些低年级学生会有困惑,不知如何进行程序的选择等问题。鉴于这些情况,笔者尝试用2020年初网络的热议话题"新冠病毒极有可能源于实验室"作为引子吸引学生注意力,通过复现并从理论上初步分析其错误,以及产生错误的原因来达到让本科生快速熟悉BLAST的使用及易错点,达到BLAST理论教学的目的。在实验课中,虚构恐龙基因,即一个小组在基因中插入"密码",由另一小组解开"密码",通过小组间利用BLAST工具进行加密与解密的趣味活动,从而加深对程序正确选择的理解,同时巩固了理论教学内容。此教学设计利用当下新冠病毒起源的热点话题不仅提高了学生的学习兴趣,同时也帮助他们利用该工具解决实际问题,培养了学生利用专业知识进行言论分辨的能力。希望此文能对BLAST工具的正确使用和新医科背景下生物医学教学有所启发和帮助。
目的构建人T细胞活化核因子C2(NFATc2)基因启动子荧光素酶报告基因载体pGL3-NFATc2-promoter,检测其转录活性,探究二甲双胍和脂多糖对其转录活性的影响。方法利用UCSC网站查找人NFATc2基因的启动子序列并设计上下游引物PCR扩增人NFATc2基因启动子片段;用限制性内切酶KpnⅠ和HindⅢ双酶切质粒pGL3-basic,将人NFATc2基因启动子片段插入到pGL3-basic质粒,重组质粒命名为pGL3-NFATc2-promoter。将pGL3-NFATc2-promoter与内参质粒pRL-TK共转染293F细胞,检测其荧光素酶活性。同时构建人NFATc2基因启动子不同片段长度的报告基因载体并进行荧光素酶活性检测,分别给予不同浓度的二甲双胍和脂多糖处理24 h后检测二甲双胍和脂多糖对NFATc2转录活性的影响。进一步突变NFATC2基因启动子上转录因子RUNX2的结合位点探究二甲双胍和脂多糖对NFATc2的转录调控作用。结果研究成功构建了不同片段长度(2170、2077、1802、1651、1083、323 bp)的人NFATC2基因启动子荧光素酶报告基因载体pGL3-NFATc2-promoter,经酶切及测序鉴定完全正确。将不同片段长度的pGL3-NFATc2-promoter转染到293F细胞,发现pGL3-1651 bp具有最高转录活性,荧光素酶活性约为pGL3-2170 bp的3.3倍(1.8433±0.1457 vs 0.5467±0.0850)。中浓度(5 mmol/L)和高浓度(10 mmol/L)的二甲双胍分别上调pGL3-1651 bp的转录活性多达2.5、3倍(1.3467±0.1601 vs 0.8867±0.0321,1.8124±0.2771 vs 0.8867±0.0321)。不同剂量的脂多糖均能上调pGL3-1651 bp的转录活性不低于1.6倍(1.4813±0.0616 vs 0.8867±0.0321)。突变pGL3-1651 bp上的RUNX2结合位点后,二甲双胍和脂多糖上调的pGL3-1651 bp转录活性均受到抑制,转录活性下降(2.1667±0.1527 vs 1.233±0.1155;2.3667±0.2887 vs 1.1333±0.3786)。结论pGL3-NFATc2-promoter在293F细胞中能被转录激活,并证实脂多糖和二甲双胍转录激活pGL3-NFATc2-promoter依赖于转录因RUNX2。
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