目的利用饮水型砷中毒大鼠肝损伤模型,结合体外提取的大鼠原代肝实质细胞,探究氧化应激、应激诱导蛋白2/AMP依赖的蛋白激酶/自噬启动激酶1(SESTRIN2/the 5′-AMP activated protein kinase/Unc-51 like kinase 1,SESTRIN2/AMPK/ULK1)...
详细信息
目的利用饮水型砷中毒大鼠肝损伤模型,结合体外提取的大鼠原代肝实质细胞,探究氧化应激、应激诱导蛋白2/AMP依赖的蛋白激酶/自噬启动激酶1(SESTRIN2/the 5′-AMP activated protein kinase/Unc-51 like kinase 1,SESTRIN2/AMPK/ULK1)通路、溶酶体功能以及坏死在砷致肝损伤中的作用,为砷中毒的致病机制研究提供实验依据。材料和方法 24只大鼠随机分为空白组、低、中、高浓度组,每组6只,分别自由饮用0、25、50、100 mg/L亚砷酸钠水溶液24周,建立砷中毒大鼠肝损伤模型。体外提取大鼠原代肝实质细胞,分别采用NAC、Leupeptin或P62-siRNA预处理细胞后,8μmol/L NaAsO染毒24 h。采用比色法测定大鼠肝组织和原代肝实质细胞丙氨酸氨基转移酶(Alanine aminotransfer,ALT)、碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)、总胆汁酸(Total bile acid,TBA)含量以及脂质过氧化物(Lipid Peroxidation,LPO)、总抗氧化能力(Total antioxidant capacity,T-AOC)和过氧化氢酶(Catalase,CAT)水平;ELISA法检测溶酶体相关膜蛋白2(Lysosomal associated membrane protein 2,LAMP2)、组织蛋白酶B(Cathepsin B,CTSB)、酸性磷酸酶(Acid phosphatase2,ACP2)含量;实时荧光定量PCR(Realtime PCR,RT-qPCR)检测Sestrin2、肝激酶B1(Liver kinase B1,LKB1)、Ampk、Ulk1、微管相关蛋白1轻链3(Microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)、P62、受体相互作用蛋白激酶1(Receptor-interacting protein kinase1,RIPK1)、受体相互作用蛋白激酶3(Receptor-interacting protein kinase 3,RIPK3)转录表达;免疫组化检测肝组织SESTRIN2、LKB1、p-AMPK、p-ULK1、LC3、P62、RIPK1、RIPK3蛋白表达,蛋白免疫印迹法(Western blot,WB)检测原代细胞SESTRIN2、LKB1、p-AMPK、p-ULK1、LC3II/LC3I、P62、RIPK1、RIPK3的蛋白表达量。结果与空白组相比,染砷组ALT、ALP、TBA和LPO含量均升高,CAT、T-AOC、LAMP2、CTSB、ACP含量均降低,提示NaAsO2导致了肝损伤、氧化应激和溶酶体功能障碍;NAC处理后可减轻上述现象,P62 siRNA处理可缓解肝损伤,而Leupeptin处理后可加重溶酶体功能障碍和肝损伤。RT-qPCR、免疫组化和WB结果显示:染砷组Sestrin2、AMPK、ULK1、LC3、P62、RIPK1和RIPK3的转录和蛋白表达水平与空白组相比均增高,NAC处理能逆转这种现象;而Leupeptin处理可增加LC3、P62、RIPK1和RIPK3的转录和蛋白表达水平;采用P62 siRNA处理后,RIPK1和RIPK3的转录和蛋白表达水平均降低。结论 NaAsO可诱发氧化应激损伤肝脏,其机制可能是NaAsO诱发的氧化应激激活了SESTRIN2/AMPK/ULK1自噬通路,同时损伤溶酶体功能导致自噬降解受阻,P62表达增加,最终可能诱发坏死,损伤肝脏。
暂无评论