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产苦马豆素疯草内生真菌Alternaria SectionUndifilum oxytropis的诱变筛选

中国农业科学 2019年第15期52卷 2716-2728页

作者：郝宝成宋向东高艳王学红刘宇李元曦梁妍陈柯源胡毓瑶邢小勇胡永浩梁剑平中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所/农业部兽用药物创制重点实验室/甘肃省新兽药工程重点实验室甘肃农业大学动物医学院

【背景】疯草是黄芪属和棘豆属有毒植物的统称,疯草内生真菌Alternaria Section Undifilum oxytropis是从疯草中分离获得的一种具有产生苦马豆素(swainsonine,SW)能力的真菌。因其产物SW一方面体现出良好的抑制肿瘤细胞生长、浸润和转... 详细信息

【背景】疯草是黄芪属和棘豆属有毒植物的统称,疯草内生真菌Alternaria Section Undifilum oxytropis是从疯草中分离获得的一种具有产生苦马豆素(swainsonine,SW)能力的真菌。因其产物SW一方面体现出良好的抑制肿瘤细胞生长、浸润和转移作用及潜在的抗艾滋病病毒等多种药用活性,另一方面牛羊因大量误食疯草能导致中毒,对草原畜牧业健康发展造成了严重的危害,受到研究人员的广泛关注。但由于疯草内生真菌Alternaria Section Undifilum oxytropis产苦马豆素生物合成机制尚不清楚,严重制约了后续通过生物发酵大量获得SW用以抗肿瘤机制研究与临床应用,以及通过基因工程手段对疯草进行脱毒育种,使疯草成为牛羊可食用、无毒的天然牧草。【目的】利用有效的研究手段,阐明Alternaria Section Undifilum oxytropis产苦马豆素生物合成机制。【方法】以Alternaria Section Undifilum oxytropis为出发菌株,分别采用紫外辐照诱变、亚硝基胍化学诱变、紫外辐照与亚硝基胍复合诱变的3种诱变方式,在不同诱变时间、诱变剂量等条件下对其进行了诱变筛选研究。通过测定不同诱变方式和作用条件下对菌株的致死率,经发酵培养、连续5代传代培养、并采用α-甘露糖苷酶活性分析法检测诱变菌株产苦马豆素含量变化,优化确定了不同诱变方式下最佳诱变条件,并将优势突变菌株接种马铃薯葡萄糖琼脂培养基(potato dextrose agar,PDA)和改良察式液体培养基,连续培养32 d,测定并绘制了突变菌株D4和UD1的生长周期曲线。【结果】经上述3种诱变方式处理后,分别获得1株产苦马豆素含量变化较大、能稳定连续传代培养的突变菌株U4、D4、UD1。其优化的诱变条件,紫外辐照为辐照处理160 s,亚硝基胍化学诱变为亚硝基胍诱变剂量6μL、诱变处理时间5 min,紫外辐照与亚硝基胍复合诱变为紫外辐照20 s,亚硝基胍诱变剂量2μL,诱变处理时间5 min。突变菌株U4、D4、UD1较原始菌株,菌落形态偏小、中间凸起,菌落颜色呈微粉色或白色,且其产苦马豆素含量均有显著变化,其中U4突变菌株产苦马豆素量平均增加16.02%(P<0.01)、D4突变菌株产苦马豆素量平均降低23.58%(P<0.01),UD1突变菌株SW产量平均增加21.87%(P<0.01),但D4、UD1突变菌株生长周期与出发菌株一致,均为24 d。【结论】通过紫外辐照诱变、亚硝基胍化学诱变、紫外辐照与亚硝基胍复合诱变方法,成功筛选出产苦马豆素含量变化较原始菌株差异较大的3株突变菌株U4、D4、UD1,这为后续利用高通量测序等分子生物学手段,在分子水平上阐释疯草内生真菌Alternaria Section Undifilum oxytropis关键基因、关键酶在其生物合成苦马豆素机制关系方面奠定研究基础。

关键词： Alternaria Section Undifilum oxytropis 疯草内生真菌苦马豆素诱变筛选生物合成机制

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利用亚硝基胍诱变和高通量测序技术分析疯草内生真菌产SW生物合成通路

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畜牧兽医学报 2019年第1期50卷 169-182页

作者：郝宝成宋向东高艳王学红刘宇陈柯源梁妍胡毓瑶邢小勇温峰琴胡永浩梁剑平中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所农业部兽用药物创制重点实验室甘肃省新兽药工程重点实验室兰州730050 甘肃农业大学动物医学院兰州730070

阐明产苦马豆素(swainsonine,SW)疯草内生真菌Alternaria Section Undifilum oxytropis中SW的生物合成通路,可以为生物发酵获得大量SW用于抗肿瘤应用和疯草的脱毒育种奠定理论基础和技术支撑。采用不同作用剂量的化学诱变剂亚硝基胍,在2... 详细信息

阐明产苦马豆素(swainsonine,SW)疯草内生真菌Alternaria Section Undifilum oxytropis中SW的生物合成通路,可以为生物发酵获得大量SW用于抗肿瘤应用和疯草的脱毒育种奠定理论基础和技术支撑。采用不同作用剂量的化学诱变剂亚硝基胍,在28℃,120r·min^(-1)与Alternaria Section Undifilum oxytropis孢子悬液分别作用5、10、15、20、25、30min,选取生长良好的菌株接种PDA培养基,连续培养发酵24d,应用α-甘露糖苷酶活性分析法检测菌丝及发酵液中SW含量,评价其传代及产SW稳定性。联合使用玻璃珠、液氮破壁法预处理菌丝,选用真菌基因组提取试剂盒提取原始菌株和突变株D4基因组DNA,经纯化、酶切、构建菌株DNA文库,并应用荧光定量PCR法检测评价文库构建质量,利用Ion torrent PGM^(TM)测序平台进行突变株和原始株高通量全基因组测序。结果表明,经化学诱变成功获得1株突变株D4,利用MIRA软件对高通量测序序列拼接、组装,分别获得突变株D4和原始株相关基因组片段19、21条,经BLAST、GO分析,注释到AlternariaSection Undifilum oxytropis生物合成SW的关键基因SwnK、SwnH2、SwnH1、SwnR和关键酶putative amino acid transporter、pyrroline-5-carboxylate reductase、formate/glycerate dehydrogenase catalytic、saccharopine reductase-like protein,并结合KEGG数据库,预测了AlternariaSection Undifilum oxytropis产SW可能的生物合成通路。本研究为揭示AlternariaSection Undifilum oxytropis生物合成SW机制作出了新的探索尝试。

关键词： Alternaria Section Undifilum oxytropis 亚硝基胍诱变筛选高通量测序生物合成通路

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HPLC法测定阿司匹林丁香酚酯在咀嚼片中的含量

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动物医学进展 2019年第10期40卷 48-53页

作者：焦钰婷焦增华刘希望杨亚军杨孝朴李剑勇甘肃农业大学动物医学院甘肃兰州730070 中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所农业部兽用药物创制重点实验室/甘肃省新兽药工程重点实验室甘肃兰州730050

建立阿司匹林丁香酚酯(AEE)咀嚼片中AEE含量测定的高效液相色谱法(HPLC)。样品经甲醇溶解后,利用Hypersil ODS(4.6 mm×150 mm,5μm)色谱柱分离,流动相为甲醇∶水(77∶23),流速为0.9 mL/min,紫外检测波长为279 nm,柱温为35℃,进样... 详细信息

建立阿司匹林丁香酚酯(AEE)咀嚼片中AEE含量测定的高效液相色谱法(HPLC)。样品经甲醇溶解后,利用Hypersil ODS(4.6 mm×150 mm,5μm)色谱柱分离,流动相为甲醇∶水(77∶23),流速为0.9 mL/min,紫外检测波长为279 nm,柱温为35℃,进样量10μL。AEE在1.0μg^80.0μg范围内与峰面积呈良好的线性关系(R 2=0.9998),平均回收率为100.1%,RSD为1.21%(n=9)。结果表明,所建立的HPLC法快速简便、准确可靠,可用于AEE咀嚼片中AEE含量的测定。

关键词：阿司匹林丁香酚酯高效液相色谱法咀嚼片含量测定

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病原菌诊断技术及其在奶牛子宫内膜炎中的应用进展

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中国兽医学报 2019年第2期39卷 374-380页

作者：邵丹张世栋武小虎王东升董书伟桑梦琪喻琴严作廷中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所农业部兽用药物创制重点实验室甘肃省新兽药工程重点实验室甘肃兰州730050 甘肃农业大学动物医学院甘肃兰州730070

病原菌感染可以引起动物多种疾病,给畜牧业造成严重的经济损失。子宫内膜炎是奶牛重要的繁殖疾病,多由病原菌混合感染所致。若能及时、准确地检测出引起子宫内膜炎的致病菌,对该病的综合防治至关重要。目前,有关奶牛子宫内膜炎病原菌诊... 详细信息

病原菌感染可以引起动物多种疾病,给畜牧业造成严重的经济损失。子宫内膜炎是奶牛重要的繁殖疾病,多由病原菌混合感染所致。若能及时、准确地检测出引起子宫内膜炎的致病菌,对该病的综合防治至关重要。目前,有关奶牛子宫内膜炎病原菌诊断技术的报道很少,现对当前用于该病病原菌诊断的传统方法、免疫检测标记技术及分子生物学技术的研究进展进行综述,同时对各种诊断方法的优缺点进行了比较,并简要介绍这些诊断方法在奶牛子宫内膜炎中的应用情况,旨在为奶牛子宫内膜炎病原菌的诊断技术研究提供参考。

关键词：奶牛子宫内膜炎病原菌诊断技术

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五氯柳胺阿苯达唑复方混悬液辅料相容性研究

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畜牧与兽医 2019年第6期51卷 57-62页

作者：李晓婷白玉彬李冰刘利利董朕孙继超张继瑜中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所/农业部兽用药物创制重点实验室/甘肃省新兽药工程重点实验室甘肃兰州730050 甘肃农业大学动物医学院甘肃兰州730070

为了考察五氯柳胺、阿苯达唑与不同辅料的相容性,为复方混悬液处方设计提供依据,采用影响因素试验方法对辅料进行筛选,将原料药五氯柳胺、阿苯达唑和不同辅料按照一定的比例混合后存放于高温(60℃)和强光(4500±500)Lx条件下,并于第... 详细信息

为了考察五氯柳胺、阿苯达唑与不同辅料的相容性,为复方混悬液处方设计提供依据,采用影响因素试验方法对辅料进行筛选,将原料药五氯柳胺、阿苯达唑和不同辅料按照一定的比例混合后存放于高温(60℃)和强光(4500±500)Lx条件下,并于第0天和第10天考察原辅料混合样品的性状、含量及有关物质的变化。结果显示:第0天时,五氯柳胺、阿苯达唑与硅酸铝镁、海藻酸钠、焦亚硫酸钠的混合样品溶液中阿苯达唑含量低于95%,且杂质含量也增加。第10天时,60℃高温条件下,五氯柳胺、阿苯达唑与卡波姆、十二烷基硫酸钠、吐温-20、维生素E、焦亚硫酸钠、抗坏血酸棕榈酸酯、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、山梨酸钾的样品溶液中阿苯达唑含量低于95%,杂质含量增加且伴有性状变化;(4500±500)Lx光照条件下,抗坏血酸棕榈酸酯样品溶液中五氯柳胺含量大于105%,山梨酸钾样品溶液中五氯柳胺含量低于95%,杂质含量增加且伴有性状变化。而五氯柳胺、阿苯达唑与辅料羧甲基纤维素钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄原胶、黄蓍树胶、大豆油、甘油、吐温-80、二甲基硅油、柠檬酸、柠檬酸钠、磷酸氢二钠、苯甲酸、苯甲酸钠相容性好,可作为后续处方筛选研究依据。

关键词：五氯柳胺阿苯达唑辅料相容性影响因素试验

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病原菌分子生物学诊断技术及其在奶牛子宫内膜炎诊断中的应用进展

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动物医学进展 2019年第2期40卷 109-112页

作者：邵丹张世栋武小虎王东升董书伟桑梦琪喻琴严作廷中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所/农业部兽用药物创制重点实验室/甘肃省新兽药工程重点实验室甘肃兰州730050 甘肃农业大学动物医学院甘肃兰州730070

子宫内膜炎(Endometritis)是奶牛常见的生殖系统疾病,影响奶牛的生产性能,给奶牛养殖业带来了巨大的经济损失。奶牛子宫内膜炎多由病原菌混合感染,若能及时、准确地检测出致病菌,对该病的综合防控至关重要。目前,奶牛子宫内膜炎病原菌... 详细信息

子宫内膜炎(Endometritis)是奶牛常见的生殖系统疾病,影响奶牛的生产性能,给奶牛养殖业带来了巨大的经济损失。奶牛子宫内膜炎多由病原菌混合感染,若能及时、准确地检测出致病菌,对该病的综合防控至关重要。目前,奶牛子宫内膜炎病原菌诊断技术的相关报道甚少,为进一步研究开发奶牛子宫内膜炎病原菌诊断技术,论文对目前应用于其诊断的PCR技术、环介导等温扩增(LAMP)技术、基因芯片技术等的研究进展进行了综述,并对其应用情况和优缺点进行了分析与总结,以期为奶牛子宫内膜炎病原菌诊断技术研究提供参考。

关键词：奶牛子宫内膜炎病原菌分子诊断技术

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产苦马豆素疯草内生真菌***的发酵培养及苦马豆素检测方法的建立

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中国兽医学报 2019年第2期39卷 328-336页

作者：宋向东郝宝成梁剑平续文君王保海刘建枝夏晨阳邢小勇包世俊胡永浩甘肃农业大学动物医学院甘肃兰州730070 中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所农业部兽用药物创制重点实验室甘肃省新兽药工程重点实验室甘肃兰州730050 西藏自治区农牧科学院畜牧兽医研究所西藏拉萨850009

通过对生长初期疯草内生真菌***菌丝复苏后连续培养32d,每隔4d取样1次,并设3个平行培养组,测定其不同培养时期菌丝干重变化,利用超声减压旋蒸法提取菌丝和发酵液中苦马豆素(SW),并分别利用薄层层析法、气相色谱法和α-甘露糖苷酶抑制法... 详细信息

通过对生长初期疯草内生真菌***菌丝复苏后连续培养32d,每隔4d取样1次,并设3个平行培养组,测定其不同培养时期菌丝干重变化,利用超声减压旋蒸法提取菌丝和发酵液中苦马豆素(SW),并分别利用薄层层析法、气相色谱法和α-甘露糖苷酶抑制法对菌丝、发酵液中SW含量进行测定。结果显示,经测定疯草内生真菌***菌丝干重质量,确定疯草内生真菌***生长周期为24d;薄层层析法、气相色谱法和α-甘露糖苷酶抑制法都可快速对菌丝和发酵液中提取的SW进行定性、定量检测,并比较3种检测方法,发现气相色谱法检测限低、灵敏度更高。本试验完成了疯草内生真菌***生长周期的测定,并建立了菌丝、发酵液中SW的有效、快速提取及检测方法,为下一步产苦马豆素疯草内生真菌***生物合成机理的研究奠定基础。

关键词：疯草内生真菌U.oxytropis 苦马豆素生长周期 α-甘露糖苷酶抑制法

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菪可轮蒲水煎液对多杀性巴氏杆菌体内外抑菌活性研究

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动物医学进展 2019年第7期40卷 43-48页

作者：高艳郝宝成吴金措姆格桑卓嘎班旦四郎玉珍邢小勇梁云杨志伟王兰芳胡永浩梁剑平拉巴次旦中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所/农业部兽用药物创制重点实验室/甘肃省新兽药工程重点实验室甘肃兰州730050 甘肃农业大学动物医学院甘肃兰州730070 西藏自治区农牧科学院畜牧兽医研究所西藏拉萨850009 兰州市肺科医院甘肃兰州730046

研究菪可轮蒲水煎液对多杀性巴氏杆菌的体内外抑菌活性作用。用传统水煎法制备菪可轮蒲水煎液,用HPLC法测定菪可轮蒲水煎液中龙胆苦苷浓度,并用龙胆苦苷浓度标定复方药物浓度,分别采用牛津杯法和宏量肉汤稀释法测定菪可轮蒲水煎液对多... 详细信息

研究菪可轮蒲水煎液对多杀性巴氏杆菌的体内外抑菌活性作用。用传统水煎法制备菪可轮蒲水煎液,用HPLC法测定菪可轮蒲水煎液中龙胆苦苷浓度,并用龙胆苦苷浓度标定复方药物浓度,分别采用牛津杯法和宏量肉汤稀释法测定菪可轮蒲水煎液对多杀性巴氏杆菌的抑菌圈直径和最小抑菌浓度(MIC),通过建立死亡率为75%的多杀性巴氏杆菌体内感染小鼠模型,测定浓度为0.0232mg/mL的菪可轮蒲水煎液,在感染前和感染后给药方式下,分别给予0.1、0.3、0.5mL药物时对小鼠多杀性巴氏杆菌感染的预防和治疗作用。结果显示,菪可轮蒲水煎液浓度为0.0464mg/mL时,对多杀性巴氏杆菌的抑菌圈平均直径为13.5mm,MIC值为0.0029mg/mL,经病理剖检、细菌镜检、全自动微生物鉴定及药敏系统(VITEK2COMPACT)细菌鉴定,表明死亡率为75%的多杀性巴氏杆菌体内感染小鼠模型建立成功,且预防组各组和治疗组各组小鼠死亡率依次为58.3%、41.7%、83.3%、66.7%、58.3%和91.7%。综合以上试验结果,菪可轮蒲水煎液对多杀性巴氏杆菌具有良好的体内外抑菌活性,且其预防作用较治疗作用明显。

关键词：菪可轮蒲水煎液多杀性巴氏杆菌最小抑菌浓度(MIC) 感染模型抑菌活性

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五氯柳胺混悬液对家兔的刺激性试验研究

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中兽医医药杂志 2019年第2期38卷 62-64页

作者：董朕张继瑜白玉彬李晓婷周绪正王玮玮中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所农业部兽用药物创制重点实验室甘肃省新兽药工程重点实验室甘肃兰州730050 甘肃农业大学动物医学院甘肃兰州730070

对家兔进行眼刺激性和皮肤刺激性试验,评价五氯柳胺混悬液的刺激性,给临床安全用药提供参考。眼刺激性试验选择日本大耳白兔8只,采用自体左右对照,五氯柳胺混悬液的平均刺激积分为1.13,其中4只试验兔在眼中滴入五氯柳胺混悬液后用温水冲... 详细信息

对家兔进行眼刺激性和皮肤刺激性试验,评价五氯柳胺混悬液的刺激性,给临床安全用药提供参考。眼刺激性试验选择日本大耳白兔8只,采用自体左右对照,五氯柳胺混悬液的平均刺激积分为1.13,其中4只试验兔在眼中滴入五氯柳胺混悬液后用温水冲洗,72 h后观察无刺激性反应;皮肤刺激性试验选择日本大耳白兔8只,分别为完好皮肤组、破损皮肤组,采用自体左右对照,72 h后,得到完整和破损皮肤组的刺激积分分别为0.25和0。结果表明,五氯柳胺混悬液对家兔眼睛及皮肤均无刺激性,临床用药安全。

关键词：五氯柳胺混悬液眼刺激性皮肤刺激性家兔

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翼草景香水煎液对多杀性巴氏杆菌体外抑菌活性及小鼠感染模型的防治效果研究

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中国兽药杂志 2019年第2期53卷 57-66页

作者：高艳郝宝成吴金措姆格桑卓嘎拉巴次旦班旦四郎玉珍邢小勇梁云杨志伟胡永浩梁剑平甘肃农业大学动物医学院甘肃兰州730070 中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所农业部兽用药物创制重点实验室甘肃省新兽药工程重点实验室甘肃兰州730050 西藏自治区农牧科学院畜牧兽医研究所西藏拉萨850009 兰州市肺科医院甘肃兰州730046

研究翼草景香水煎液对多杀性巴氏杆菌的体外抑菌活性及小鼠感染模型的防治效果。利用传统水煎法制备翼草景香水煎液,用HPLC方法测定翼草景香水煎液中红景天苷浓度,并用红景天苷浓度标定翼草景香水煎液药物浓度,分别采用牛津杯法和试管2... 详细信息

研究翼草景香水煎液对多杀性巴氏杆菌的体外抑菌活性及小鼠感染模型的防治效果。利用传统水煎法制备翼草景香水煎液,用HPLC方法测定翼草景香水煎液中红景天苷浓度,并用红景天苷浓度标定翼草景香水煎液药物浓度,分别采用牛津杯法和试管2倍稀释法测定翼草景香水煎液对多杀性巴氏杆菌抑菌圈直径和最小抑菌浓度(MIC),通过建立死亡率为75%的多杀性巴氏杆菌体内感染小鼠模型,测定翼草景香水煎液浓度为0.12316 mg/m L时,在感染前和感染后给药方式下,分别给与0.1、0.3、0.5 m L药物时对小鼠的体内感染防治作用。结果表明,当翼草景香水煎液浓度为0.49263 mg/m L时,抑菌圈平均直径为28.5 mm; MIC值为0.00385 mg/m L,经病理解剖、细菌镜检、全自动微生物鉴定及药敏系统(VTEK 2 COMPACT)系统细菌鉴定,表明死亡率为75%的多杀性巴氏杆菌体内感染小鼠模型建立成功,当水煎液浓度为0.12316 mg/m L时,0.1、0.3、0.5 m L预防组和治疗组小鼠死亡率分别依次为50%,41.7%,81.8%,66.7%,50%和75%。因此,翼草景香水煎液对多杀性巴氏杆菌具有良好的体内、外抑菌活性,且其预防作用较治疗作用明显。

关键词：翼草景香多杀性巴氏杆菌最小抑菌浓度感染模型抑菌活性

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