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蛇毒半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因转染对小鼠黑色素瘤B16细胞蛋白质表达谱的影响

中国药理学通报 2011年第6期27卷 791-797页

作者：齐元麟纪明开谢群黄清玲林建银福建医科大学基础医学院分子医学研究中心消化道恶性肿瘤教育部重点实验室福建福州350004 福建医科大学附属第一医院皮肤科福建福州350004 莆田学院医学院福建莆田351100

目的研究蛇毒半胱氨酸蛋白酶抑制剂(sv-cystatin)基因转染对小鼠黑素瘤细胞B16F1的蛋白表达谱的影响,探讨其抗肿瘤机制。方法采用双向电泳-质谱的蛋白质组学研究策略,分析稳定表达sv-cystatin的B16F1细胞系B16F1/cystatin与转染空载体... 详细信息

目的研究蛇毒半胱氨酸蛋白酶抑制剂(sv-cystatin)基因转染对小鼠黑素瘤细胞B16F1的蛋白表达谱的影响,探讨其抗肿瘤机制。方法采用双向电泳-质谱的蛋白质组学研究策略,分析稳定表达sv-cystatin的B16F1细胞系B16F1/cystatin与转染空载体的对照细胞B16F1/pcDNA3.1的蛋白表达谱的差别,筛选鉴定差异表达蛋白;用实时定量PCR和Western blot进一步确定实验结果;对蛋白组数据和前期基因组数据进行比较分析。结果 B16F1/cystatin和B16F1/pcDNA3.1细胞总蛋白的双向电泳图谱上共有匹配蛋白点(412±20)个,其中有11个蛋白的表达差异在2倍以上,5个上调,6个下调。这11个蛋白和1个仅在B16F1/cystatin中表达的蛋白经MALDI-TOF-MS分析,其中10个蛋白得到了鉴定,它们分属于代谢酶系、小G蛋白Ran调控分子、真核翻译因子、核苷酸激酶等。Western blot显示NM23和RhoGDI-beta的蛋白表达分别上调了(2.23±0.34)倍和(1.57±0.11)倍;实时定量PCR结果显示NM23、RhoGDI-beta、RANBP1的mRNA表达上调,eIF5A、eEF1-beta2、MDH1表达下调;与蛋白质组学研究结果一致。基于Gene Ontology的分析提示sv-cystatin作用的靶分子主要定位于细胞外周、质膜和细胞核,与转录、半胱氨酸蛋白酶活性、细胞凋亡等过程有关。结论 sv-cystatin可能通过调控抑癌基因NM23、RhoGDI等蛋白质发挥其抗肿瘤作用。sv-cystatin的主要靶分子可能是转录因子、分泌蛋白和质膜受体。

关键词：蛇毒半胱氨酸蛋白酶抑制剂黑色素瘤小鼠蛋白质组学基因本体学

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眼镜蛇毒L-氨基酸氧化酶对人膀胱癌ECV304细胞增殖和细胞周期的影响及机制

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中国药理学通报 2011年第12期27卷 1660-1665页

作者：齐元麟张明芳赵蓉张旭吴玲珊林建银福建医科大学基础医学院分子医学研究中心消化道恶性肿瘤教育部重点实验室福建福州350004 福建医科大学生理学与病理生理学系福建福州350004

目的研究眼镜蛇毒L-氨基酸氧化酶(Naja atra L-a-mino acid oxidase,NA-LAAO)对人膀胱癌细胞株ECV304的生长抑制作用,探讨其作用机制。方法 CCK-8法测定NA-LAAO的细胞毒性及对细胞增殖抑制能力;流式细胞术分析NA-LAAO对ECV304细胞周期... 详细信息

目的研究眼镜蛇毒L-氨基酸氧化酶(Naja atra L-a-mino acid oxidase,NA-LAAO)对人膀胱癌细胞株ECV304的生长抑制作用,探讨其作用机制。方法 CCK-8法测定NA-LAAO的细胞毒性及对细胞增殖抑制能力;流式细胞术分析NA-LAAO对ECV304细胞周期的影响;实时定量PCR和Western blot分析细胞周期相关基因mRNA和蛋白质表达。结果 NA-LAAO对ECV304细胞有强烈抑制作用,且呈剂量-效应和时间-效应关系。NA-LAAO处理6、12、24 h对ECV304的IC50分别为(1.54±0.23)、(1.09±0.15)和(0.48±0.14)mg.L-1;细胞生长曲线显示,0.156 mg.L-1的NA-LAAO作用4 d可明显抑制ECV304细胞增殖;0.313 mg.L-1从d 2起就有明显效果;0.625 mg.L-1处理后细胞多数死亡;流式细胞术分析提示NA-LAAO可使ECV304细胞阻滞在G1期,并呈量效关系;实时定量PCR结果显示,NA-LAAO可下调Cyclin A2、B1、D1、E1、CDK2、CDK6、Survivin、Skp2,上调p21、p16、p27的表达,Western blot结果显示NA-LAAO可下调Cyclin A、CDK2、CDK6,上调p21,与实时PCR结果一致。结论 NA-LAAO可通过调节细胞周期相关分子,使ECV304细胞阻滞在G1期,抑制细胞增殖。

关键词：蛇毒中华眼镜蛇 L-氨基酸氧化酶细胞增殖细胞周期膀胱癌

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蛇毒半胱氨酸蛋白酶抑制剂重组蛋白对小鼠黑色素瘤血管生成拟态的影响及其机制

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西安交通大学学报（医学版） 2014年第2期35卷 169-174页

作者：谢群林扬元林丽琳翁剑武林建银福建医科大学分子医学研究中心消化道恶性肿瘤教育部重点实验室福建福州350004 福建省莆田学院基础医学院福建莆田351100

目的探讨蛇毒半胱氨酸蛋白酶抑制剂(snake venom cystatin,sv-cystatin)重组蛋白对小鼠黑色素瘤血管生成拟态(vasculogenic mimicry,VM)形成的影响及相关机制。方法建立Matrigel胶肿瘤细胞类血管生成模型,分析sv-cystatin重组蛋白(10、2... 详细信息

目的探讨蛇毒半胱氨酸蛋白酶抑制剂(snake venom cystatin,sv-cystatin)重组蛋白对小鼠黑色素瘤血管生成拟态(vasculogenic mimicry,VM)形成的影响及相关机制。方法建立Matrigel胶肿瘤细胞类血管生成模型,分析sv-cystatin重组蛋白(10、25、50、100、200mg/L)对B16F10细胞VM形成及基质金属蛋白酶-2、9[matrix metalloproteinase-2(MMP-2)、MMP-9]蛋白表达的影响;建立C57BL/6小鼠黑色素瘤实验性肺转移模型,经25、50mg/kg重组蛋白治疗后,应用CD34和过碘酸雪夫(periodic acid-schiff stain,PAS)双重染色法检测肺转移瘤VM形成,免疫组织化学法检测转移瘤MMP-2、MMP-9表达。结果与对照组相比,sv-cystatin重组蛋白作用后B16F10细胞体外VM形成及MMP-2、MMP-9蛋白表达明显减少,并呈剂量依赖性(P<0.05);两治疗组小鼠肺转移瘤VM形成及MMP-2、MMP-9表达明显下降(P<0.05)。结论 sv-cystatin重组蛋白能够抑制VM形成;下调MMP-2、MMP-9表达是其中的机制之一。

关键词：蛇毒半胱氨酸蛋白酶抑制剂血管生成拟态黑色素瘤基质金属蛋白酶-2 基质金属蛋白酶-9

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蛇毒半胱氨酸蛋白酶抑制剂重组腺病毒对人肝癌细胞 MHCC97H 侵袭转移的影响

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第二军医大学学报 2014年第6期35卷 668-671页

作者：谢群唐南洪林扬元林建银福建省莆田学院基础医学院莆田351100 福建医科大学分子医学研究中心消化道恶性肿瘤教育部重点实验室福州350004 福建医科大学附属协和医院省肝胆外科研究所福州350001

目的构建携带蛇毒半胱氨酸蛋白酶抑制剂(sv-cystatin)基因的重组腺病毒载体(Ad/sv-cystatin),研究其对人肝癌细胞MHCC97H在体内、外侵袭转移的影响。方法构建携带sv-cystatin的重组腺病毒,体外感染MHCC97H细胞,采用CCK-8法检测细胞生长,... 详细信息

目的构建携带蛇毒半胱氨酸蛋白酶抑制剂(sv-cystatin)基因的重组腺病毒载体(Ad/sv-cystatin),研究其对人肝癌细胞MHCC97H在体内、外侵袭转移的影响。方法构建携带sv-cystatin的重组腺病毒,体外感染MHCC97H细胞,采用CCK-8法检测细胞生长,Transwell小室检测细胞侵袭和迁移能力,通过裸鼠皮下肝癌细胞肺转移模型观察Ad/sv-cystatin瘤内注射对裸鼠的治疗作用。结果体外实验证实Ad/sv-cystatin能够感染MHCC97H细胞。与对照组及空载体组相比,Ad/sv-cystatin对MHCC97H细胞体外生长、侵袭和迁移均具有明显的抑制作用,瘤内注射Ad/sv-cystatin可以显著降低MHCC97H细胞的肺转移。结论重组腺病毒Ad/sv-cystatin具有抑制人肝癌细胞MHCC97H体内外侵袭转移的作用,在肝癌基因治疗方面具有开发应用潜能。

关键词：蛇毒半胱氨酸蛋白酶抑制剂腺病毒肝细胞癌肿瘤侵袭肿瘤转移

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竹叶青素的基因合成、原核表达及生物学功能的初步研究

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中国药理学通报 2013年第1期29卷 36-41页

作者：齐元麟张明芳胡建石徐剑文林建银福建医科大学基础医学院分子医学研究中心消化道恶性肿瘤教育部重点实验室福建福州350004 福建医科大学生理学与病理生理学系福建福州350004 福建医科大学人体解剖学与组织胚胎学系福建福州350004

目的合成竹叶青素trigramin基因,在原核系统中表达、纯化,对其功能进行初步研究。方法缓慢退火-PCR法合成竹叶青素基因并克隆入原核表达载体;IPTG诱导表达;亲和层析法纯化重组蛋白;常规柱层析和HPLC纯化天然竹叶青素;Born法测定竹叶青... 详细信息

目的合成竹叶青素trigramin基因,在原核系统中表达、纯化,对其功能进行初步研究。方法缓慢退火-PCR法合成竹叶青素基因并克隆入原核表达载体;IPTG诱导表达;亲和层析法纯化重组蛋白;常规柱层析和HPLC纯化天然竹叶青素;Born法测定竹叶青素对血小板聚集的抑制能力;CCK-8法测定竹叶青素对细胞增殖的影响;划痕实验分析竹叶青素对细胞运动的影响。结果合成了竹叶青素基因并在大肠杆菌中表达;获得纯度为89.1%的重组竹叶青素;重组竹叶青素抑制血小板聚集的IC50为0.78μmol.L-1,而天然竹叶青素为0.35μmol.L-1;竹叶青素不能抑制肿瘤细胞增殖,但可抑制细胞体外运动能力。结论本研究成功合成竹叶青素基因并在大肠杆菌系统进行了有功能的表达和纯化,竹叶青素可抑制肿瘤细胞体外运动。

关键词：蛇毒去整合素竹叶青素原核表达蛋白纯化细胞运动

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蛇毒半胱氨酸蛋白酶抑制剂重组蛋白对人肝癌MHCC97H细胞TGF-β2、TNF-α表达的影响

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中国药理学通报 2013年第9期29卷 1208-1212页

作者：谢群林扬元唐南洪林建银福建医科大学分子医学研究中心消化道恶性肿瘤教育部重点实验室福建福州350004 福建省莆田学院基础医学院福建莆田351100 福建医科大学附属协和医院省肝胆外科研究所福建福州350001

目的研究蛇毒半胱氨酸蛋白酶抑制剂(snake venom cystatin,sv-cystatin)重组蛋白对人肝癌MHCC97H细胞转化生长因子-β2(transforming growth factor-β2,TGF-β2)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)表达的影响。方法采用ELISA方法检测不同浓度sv-cystatin重组蛋白对人肝癌MHCC97H细胞TGF-β2、TNF-α分泌的影响;实时定量PCR和Western blot法分别分析不同浓度sv-cystatin重组蛋白体外处理人肝癌MHCC97H细胞后TGF-β2、TNF-α的mRNA及蛋白表达。结果与对照组相比,5种浓度的sv-cystatin重组蛋白对MHCC97H细胞TGF-β2、TNF-α的分泌具有明显的抑制作用,并呈剂量依赖性(P<0.05);25、50、100、200 mg·L-14种浓度的重组蛋白能够抑制TGF-β2的mRNA及蛋白表达,与对照组比较差异具有统计学意义(P<0.05);而50、100、200 mg·L-13种浓度的重组蛋白能够抑制TNF-α的mRNA及蛋白表达,与对照组比较差异具有统计学意义(P<0.05)。结论 sv-cystatin重组蛋白可能通过抑制TGF-β2和TNF-α的表达来发挥多方面的抗肿瘤作用。

关键词：蛇毒半胱氨酸蛋白酶抑制剂肝癌 MHCC97H 转化生长因子β2 肿瘤坏死因子α

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eNOS G894T基因多态性与胃癌发生发展关系的研究

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重庆医科大学学报 2010年第12期35卷 1816-1819页

作者：陈淑勤洪斌斌林贤东朱进伟唐阳林建银福建医科大学基础医学院病理学系肿瘤研究室福州350004 福建医科大学教育部消化道恶性肿瘤教育部重点实验室分子医学研究中心福州350004

目的:探讨内皮型一氧化氮合酶(Endothelial NOS,eNOS)基因多态性与胃癌发生发展的关系。方法:采用PCR-RFLP技术,检测福建地区汉族324例胃癌患者(病例组)和200例健康对照者(对照组)eNOS基因G894T多态性。结果:(1)在病例组和对照组中e,NOS... 详细信息

目的:探讨内皮型一氧化氮合酶(Endothelial NOS,eNOS)基因多态性与胃癌发生发展的关系。方法:采用PCR-RFLP技术,检测福建地区汉族324例胃癌患者(病例组)和200例健康对照者(对照组)eNOS基因G894T多态性。结果:(1)在病例组和对照组中e,NOS G894T SNP基因型频率G/G分别为76.5%(248/324)和73.0%(146/200),G/T+T/T分别为23.5%(76/324)和27.0%(54/200),等位基因频率G分别为88.0%(570/648)和86.3%(345/400),T分别为12.0%(78/648)和13.7%(55/400)。eNOS G894T SNP基因型和等位基因频率在病例组与对照组的分布差异无统计学意义(均P>0.05);弥漫型胃癌和肠型胃癌分别与对照组比较,任一基因型或等位基因亦未增加患癌风险(均P>0.05)。(2)eNOS G894T基因型频率分布与胃癌的临床病理特征无明显关系(均P>0.05)。结论:福建地区汉族人群eNOS基因G894T多态性与胃癌的发生和发展无关。

关键词：胃癌e NOS G894T基因多态性疾病遗传易感性

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HBV转基因小鼠肝原代细胞分离纯化及其在肝损伤研究中的应用

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中国实验动物学报 2022年第4期30卷 526-532页

作者：贺云黄敏健陈艺生福建医科大学基础医学院消化道恶性肿瘤教育部重点实验室福建省肿瘤微生物学重点实验室福州350122 福建省立医院临床医学实验研究中心福建医科大学福州350001

目的分离鉴定乙型肝炎病毒(HBV)转基因小鼠肝原代细胞,为HBV体外相关研究提供有利模型。方法HBV转基因C57 BL/6小鼠深度麻醉后,通过二步灌注法,首先用不含钙灌注液将肝中的血液冲洗干净,然后用含钙的IV型胶原缓冲液将肝细胞消化下,通过... 详细信息

目的分离鉴定乙型肝炎病毒(HBV)转基因小鼠肝原代细胞,为HBV体外相关研究提供有利模型。方法HBV转基因C57 BL/6小鼠深度麻醉后,通过二步灌注法,首先用不含钙灌注液将肝中的血液冲洗干净,然后用含钙的IV型胶原缓冲液将肝细胞消化下,通过3次低速低温离心法纯化去除杂质,则成功分离提取肝原代细胞。进而通过糖原染色法对提取的细胞进行鉴定,并检测7 d内肝细胞的增殖活力,以及第1天和第3天细胞凋亡情况。最后,将提取的肝细胞应用于过氧化氢诱导肝细胞损伤表型检测,包括细胞内活性氧、线粒体膜电位、多个氧化应激因子转录水平检测和LDH泄露情况。结果(1)分离的HBV小鼠肝原代细胞为典型性肝细胞形态,并呈现糖原阳性染色结果;(2)肝细胞活性检测发现肝细胞贴壁后,活性增强,第5~6天时活性最高,然后逐渐下降;(3)对比肝细胞提取后第1天和第3天的细胞死亡情况,未发生明显自发性死亡;(4)细胞通过过氧化氢诱导后,发现胞内活性氧积聚,线粒体膜电位改变,氧化应激因子转录水平上调,以及乳酸脱氢酶泄露增加。结论在本实验条件下,成功分离鉴定HBV小鼠肝原代细胞,并应用于肝损伤相关实验。

关键词：原代细胞二步灌注法模型肝损伤

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微囊藻毒素-LR对小鼠原代肝细胞线粒体功能的影响

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中国实验动物学报 2021年第6期29卷 816-822页

作者：贺云陈艺生任岚尹一杰胡桂玲吴云丽福建医科大学基础医学院消化道恶性肿瘤教育部重点实验室福建省肿瘤微生物学重点实验室福州350122 福建省立医院临床医学实验研究中心福州350001

目的蓝藻水华引起的微囊藻毒素污染是世界性关注话题之一,微囊藻毒素LR(MC-LR)具有强特异性肝毒性,但其引起肝损伤的确切机制尚未完全阐明。为解决这一问题,本研究从细胞分子层面探讨MC-LR造成肝细胞线粒体功能改变的分子机制。方法提... 详细信息

目的蓝藻水华引起的微囊藻毒素污染是世界性关注话题之一,微囊藻毒素LR(MC-LR)具有强特异性肝毒性,但其引起肝损伤的确切机制尚未完全阐明。为解决这一问题,本研究从细胞分子层面探讨MC-LR造成肝细胞线粒体功能改变的分子机制。方法提取小鼠原代肝细胞,加入梯度剂量的MC-LR(2.5~10 nmol/L)作用48 h,以未加毒素处理组为对照,检测MC-LR对线粒体功能的影响(包括ATP水平和线粒体膜电位检测),DNA损伤(包括彗星试验和8-OHdG水平检测),并分析p53抑制剂pft-α作用下线粒体功能损伤情况。结果 MC-LR造成肝细胞线粒体功能障碍,DNA损伤且p53蛋白表达水平上调;p53特异性抑制剂pft-α减轻MC-LR造成的线粒体损伤。结论在本试验条件下,MC-LR造成小鼠肝细胞线粒体功能异常的机制与其造成DNA损伤诱导p53上调有关。

关键词：微囊藻毒素-LR 原代肝细胞线粒体功能 DNA损伤 p53

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眼镜蛇毒L-氨基酸氧化酶诱导人胃癌细胞MGC-803细胞凋亡的实验研究

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中国临床药理学与治疗学 2012年第2期17卷 121-125页

作者：齐元麟张明芳赵蓉林建银福建医科大学基础医学院分子医学研究中心消化道恶性肿瘤教育部重点实验室福建医科大学生理学与病理生理学系

目的:研究眼镜蛇毒L-氨基酸氧化酶(NA-LAAO)对人胃癌细胞MGC-803的细胞毒性、诱导凋亡作用及可能机制。方法:采用CCK-8法测定细胞毒性;采用DNA倍体分析和An-nexin V/碘化丙啶染色测定细胞凋亡;采用发色底物法测定Caspase-3酶活性;采用We... 详细信息

目的:研究眼镜蛇毒L-氨基酸氧化酶(NA-LAAO)对人胃癌细胞MGC-803的细胞毒性、诱导凋亡作用及可能机制。方法:采用CCK-8法测定细胞毒性;采用DNA倍体分析和An-nexin V/碘化丙啶染色测定细胞凋亡;采用发色底物法测定Caspase-3酶活性;采用Western-blot方法测定聚二磷酸腺苷核糖多聚酸-1(PARP-1)切割。结果:NA-LAAO可抑制MGC-803细胞增殖,6、12、24h的IC50分别为(2.48±0.41)、(1.74±0.27)和(0.83±0.19)mg/L;NA-LAAO可使细胞DNA分布出现亚二倍体凋亡峰,并可促使细胞膜磷脂酰丝氨酸外翻;NA-LAAO可激活Caspase-3并可促使其底物PARP-1降解。结论:NA-LAAO可能通过激活Caspase-3这一分子机制而诱导细胞凋亡,从而抑制肿瘤细胞增殖。

关键词：蛇毒中华眼镜蛇 L-氨基酸氧化酶细胞增殖细胞凋亡

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