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中华微生物学和免疫学杂志 2023年第7期43卷 509-516页

作者：王秋然郑艺俐吴天民陈媛媛廖文君张璐林旭吴琼陈婉南福建医科大学基础医学院消化道恶性肿瘤教育部重点实验室福州350122 福建省肿瘤微生物学重点实验室福建医科大学福州350122

目的探讨蛋白质磷酸酶4催化亚基(protein phosphatase 4 catalytic subunit,PP4C)对乙型肝炎病毒X蛋白(hepatitis B virus X protein,HBx)在蛋白质水平的调控及生物学功能的影响,为乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)相关性肝癌提供潜在治疗靶点。方法通过免疫共沉淀(co-immunopreciptation,Co-IP)与GST pull-down试验验证HBx与PP4C在体内与体外的相互作用。采用Lipofectamine 3000试剂转染PP4C过表达真核质粒检测PP4C对HBx在蛋白质水平的影响,并用蛋白质合成抑制剂环己酮亚胺(cycloheximide,CHX)处理过表达PP4C的肝癌细胞,Western blot检测HBx半衰期变化。磷酸化试验检测PP4C对HBx磷酸化水平的影响。CCK8增殖、细胞划痕、Matrigel侵袭小室试验检测PP4C对HBx生物学功能的影响。结果Co-IP与GST pull-down试验证实HBx与PP4C在肝癌细胞内存在相互作用,在体外也存在相互作用。肝癌细胞中过表达PP4C可提高HBx蛋白水平,并明显延长HBx半衰期。磷酸化试验证实在肝癌细胞中过表达PP4C可降低HBx丝氨酸磷酸化水平。PP4C过表达对肝癌细胞的增殖没有影响,但是促进肝癌细胞的迁移与侵袭能力。结论HBx与PP4C的相互作用可提高HBx稳定性,最终促进肝癌细胞的迁移与侵袭,其机制与PP4C降低HBx丝氨酸磷酸化水平有关。本研究为发现HBx致病新机制提供理论依据,以PP4C和HBx蛋白相互作用为靶标,有望为HBV感染相关肝脏疾病的治疗提供有益思路。

关键词： HBx 蛋白质磷酸酶4催化亚基去磷酸化肝细胞癌迁移侵袭

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泛素特异性肽酶22调控乙型肝炎病毒X蛋白水平及功能

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中华微生物学和免疫学杂志 2022年第6期42卷 434-442页

作者：周世颖吴琼张翼张璐林旭陈婉南福建医科大学基础医学院消化道恶性肿瘤教育部重点实验室福建省肿瘤微生物学重点实验室福州350122

目的探究泛素特异性肽酶22(ubiquitin specific peptidase 22,USP22)与乙型肝炎病毒X蛋白(hepatitis B virus X protein,HBx)相互作用对HBx蛋白水平及其生物学功能的影响。方法通过GST pull-down、免疫共沉淀以及激光共聚焦试验检测HBx... 详细信息

目的探究泛素特异性肽酶22(ubiquitin specific peptidase 22,USP22)与乙型肝炎病毒X蛋白(hepatitis B virus X protein,HBx)相互作用对HBx蛋白水平及其生物学功能的影响。方法通过GST pull-down、免疫共沉淀以及激光共聚焦试验检测HBx与USP22的相互作用。瞬时转染USP22真核表达质粒或干扰USP22表达的siRNA,Western blot检测肝细胞中HBx蛋白表达水平的变化。以环己酰亚胺(cycloheximide,CHX)、蛋白酶体抑制剂MG132(carbobenzoxy-Leu-Leu-leucinal,MG132)分别处理转染后的细胞,检测HBx蛋白的降解速率。进一步通过细胞内泛素化试验检测USP22对HBx泛素化的影响,明确USP22影响HBx蛋白稳定性的具体机制。最后,以双荧光素酶报告试验和平板克隆试验检测USP22对HBx生物学功能的影响。结果USP22与HBx存在相互作用。USP22显著增加HBx蛋白稳定性,并通过去除HBx的泛素化抑制HBx通过蛋白酶体降解,进而增强HBx的生物学功能。结论USP22抑制HBx通过泛素依赖-蛋白酶体途径降解,增强HBx蛋白稳定性并促进HBx功能。

关键词：乙型肝炎病毒X蛋白泛素特异性肽酶22 泛素蛋白酶体蛋白降解

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幽门螺杆菌CagA与YWHAE互作区段的确定

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中国人兽共患病学报 2022年第11期38卷 975-981页

作者：张晓艳温春燕陈豪佘菲菲福建医科大学基础医学院消化道恶性肿瘤教育部重点实验室福建省肿瘤微生物学重点实验室福州350122

目的探讨幽门螺杆菌CagA蛋白与宿主细胞YWHAE蛋白相互作用的区段。方法先在酵母细胞水平构建CagA区段蛋白[-N、-M、-(N+M)、-C]的表达载体,经“滤纸法”检测、一对一交配试验及“ONPG液相法”分析,筛选互作区段;进而在哺乳动物细胞水平... 详细信息

目的探讨幽门螺杆菌CagA蛋白与宿主细胞YWHAE蛋白相互作用的区段。方法先在酵母细胞水平构建CagA区段蛋白[-N、-M、-(N+M)、-C]的表达载体,经“滤纸法”检测、一对一交配试验及“ONPG液相法”分析,筛选互作区段;进而在哺乳动物细胞水平,选用Cos7细胞经共转染、Co-IP方法确定互作区段,选用AGS细胞经上调/下调YWHAE表达、共转染、双荧光素酶报告基因检测等分析细胞NF-κB活性检测CagA候选区段与YWHAE互作的功能。结果成功构建CagA蛋白的N、M、(N+M)和C区段的酵母表达载体,CagA各区段蛋白“滤纸法”检测反式激活特性均为阴性,“一对一”交配后“液相法”筛选到CagA区段[-N、-(N+M)、-C]分别可与YWHAE在酵母中相互作用;Cos7细胞实验确定CagA区段[-N、-C]可分别沉淀外源性YWHAE,AGS细胞中CagA区段[-N、-C]对细胞NF-κB的激活,上调YWHAE能增强、下调YWHAE则抑制。结论幽门螺杆菌CagA蛋白N-末端与C-末端均分别与宿主细胞YWHAE蛋白相互作用,并可激活细胞NF-κB。

关键词：幽门螺杆菌 CagA YWHAE 相互作用 NF-κB

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含MPN结构域蛋白(MPND)通过上调乙型肝炎病毒X蛋白水平影响其功能

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病毒学报 2022年第6期38卷 1372-1381页

作者：张翼吴琼施佳健张璐林旭陈婉南福建医科大学消化道恶性肿瘤教育部重点实验室福州350122 福建省肿瘤微生物学重点实验室福州350122 福建医科大学基础医学院病原生物学系福州350122

乙型肝炎病毒X蛋白(Hepatitis B virus X protein,HBx)在生成后即被快速降解,但目前影响HBx稳定性的机制仍未完全阐明。课题组前期通过酵母双杂交筛选与HBx具有相互作用的去泛素化酶(Deubiqutinases,DUBs),含MPN结构域蛋白(MPN domain c... 详细信息

乙型肝炎病毒X蛋白(Hepatitis B virus X protein,HBx)在生成后即被快速降解,但目前影响HBx稳定性的机制仍未完全阐明。课题组前期通过酵母双杂交筛选与HBx具有相互作用的去泛素化酶(Deubiqutinases,DUBs),含MPN结构域蛋白(MPN domain containing protein,MPND)为筛选获得的蛋白之一。本研究首先采用免疫共沉淀和激光共聚焦实验验证HBx与MPND的相互作用,并通过酵母双杂交实验进一步分析两者相互作用的区域。Western blot检测过表达MPND的肝癌细胞中HBx蛋白水平的变化。以蛋白合成抑制剂环己酮亚胺(Cycloheximide,CHX)或蛋白酶体抑制剂MG132处理细胞,检测MPND对HBx蛋白半衰期及降解途径的影响。通过泛素化实验分析MPND对HBx泛素化水平的影响。采用双荧光素酶报告基因检测实验和克隆形成实验检测MPND对HBx生物学功能的影响。结果显示,MPND与HBx在肝癌细胞内存在相互作用,且HBx的26~50和81~120位氨基酸与MPND的272~362位氨基酸介导HBx与MPND的结合;过表达MPND的肝癌细胞中,HBx蛋白水平显著增高,HBx的半衰期明显延长,且蛋白酶体抑制剂处理后,MPND对HBx蛋白降解的抑制效果更为显著,但HBx泛素化水平没有变化;共表达MPND与HBx的肝癌细胞中,MPND通过上调HBx蛋白水平,进而促进了HBx对NF-κB启动子的反式激活作用,且进一步抑制克隆形成。本研究表明,MPND通过泛素非依赖-蛋白酶体途径抑制HBx降解,从而增加HBx蛋白水平,调控HBx功能,可能参与HBV致病机制,以此蛋白相互作用为靶标,将为HBV感染相关肝脏疾病的治疗提供有益思路。

关键词：乙型肝炎病毒X蛋白去泛素化酶蛋白酶体蛋白降解

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HBV转基因小鼠肝原代细胞分离纯化及其在肝损伤研究中的应用

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中国实验动物学报 2022年第4期30卷 526-532页

作者：贺云黄敏健陈艺生福建医科大学基础医学院消化道恶性肿瘤教育部重点实验室福建省肿瘤微生物学重点实验室福州350122 福建省立医院临床医学实验研究中心福建医科大学福州350001

目的分离鉴定乙型肝炎病毒(HBV)转基因小鼠肝原代细胞,为HBV体外相关研究提供有利模型。方法HBV转基因C57 BL/6小鼠深度麻醉后,通过二步灌注法,首先用不含钙灌注液将肝中的血液冲洗干净,然后用含钙的IV型胶原缓冲液将肝细胞消化下,通过... 详细信息

目的分离鉴定乙型肝炎病毒(HBV)转基因小鼠肝原代细胞,为HBV体外相关研究提供有利模型。方法HBV转基因C57 BL/6小鼠深度麻醉后,通过二步灌注法,首先用不含钙灌注液将肝中的血液冲洗干净,然后用含钙的IV型胶原缓冲液将肝细胞消化下,通过3次低速低温离心法纯化去除杂质,则成功分离提取肝原代细胞。进而通过糖原染色法对提取的细胞进行鉴定,并检测7 d内肝细胞的增殖活力,以及第1天和第3天细胞凋亡情况。最后,将提取的肝细胞应用于过氧化氢诱导肝细胞损伤表型检测,包括细胞内活性氧、线粒体膜电位、多个氧化应激因子转录水平检测和LDH泄露情况。结果(1)分离的HBV小鼠肝原代细胞为典型性肝细胞形态,并呈现糖原阳性染色结果;(2)肝细胞活性检测发现肝细胞贴壁后,活性增强,第5~6天时活性最高,然后逐渐下降;(3)对比肝细胞提取后第1天和第3天的细胞死亡情况,未发生明显自发性死亡;(4)细胞通过过氧化氢诱导后,发现胞内活性氧积聚,线粒体膜电位改变,氧化应激因子转录水平上调,以及乳酸脱氢酶泄露增加。结论在本实验条件下,成功分离鉴定HBV小鼠肝原代细胞,并应用于肝损伤相关实验。

关键词：原代细胞二步灌注法模型肝损伤

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基于网络药理学和分子对接技术研究千金子引发腹泻的作用机制

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毒理学杂志 2023年第3期37卷 181-188页

作者：鲁家彤吴亚娇李楚涛鲍文强陈小鹰侯绍章朱安福建医科大学基础医学院福建福州350108 宁夏医科大学基础医学院宁夏银川750000 福建医科大学消化道恶性肿瘤教育部重点实验室、肿瘤微生物学福建省重点实验室福建福州350108

目的基于网络药理学和分子对接技术探讨千金子引发腹泻的作用机制。方法通过TCMSP数据库收集千金子化学成分信息,在PubChem、SwissTargetPrediction和GeneCards等数据库收集其化学成分作用靶点及腹泻相关靶点,利用DAVID数据库对千金子... 详细信息

目的基于网络药理学和分子对接技术探讨千金子引发腹泻的作用机制。方法通过TCMSP数据库收集千金子化学成分信息,在PubChem、SwissTargetPrediction和GeneCards等数据库收集其化学成分作用靶点及腹泻相关靶点,利用DAVID数据库对千金子与腹泻的共有靶点进行基因本体(gene ontology,GO)功能富集及京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路富集;使用Cytoscape软件构建PPI网络图及“活性成分-靶点-疾病”网络,筛选出主要活性成分与核心靶点进行分子对接。培养人结肠癌细胞系HCT116,采用实时荧光定量PCR(real time quantitative PCR,RT-qPCR)验证计算模拟结果。结果经筛选得到千金子潜在活性成分12个及其对应靶点389个,腹泻相关靶点570个,二者共同靶点43个。GO功能富集分析发现共同靶点主要参与ATP结合和ERBB2信号传导途径等生物过程,KEGG信号通路分析发现千金子主要影响Rap1信号通路、PI3K-AKT信号通路、Ras信号通路、ERBB信号通路、HIF-1信号通路、HTLV-I感染和FoxO信号通路。分子对接结果显示,各活性成分与SRC、PIK3CA、AKT1和PIK3R1等靶点结合良好。千金子甾醇可抑制细胞活性,使EGFR和mTOR基因表达异常。结论千金子可能通过beta-sitosterol、stigmasterol、artemetin和euphorbiasteroid等关键活性成分作用于SRC、PIK3CA、AKT1和PIK3R1等靶点和通路,从而引发腹泻。

关键词：千金子腹泻网络药理学分子对接千金子甾醇

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蛋白质犹素修饰及其生理学与病理学作用的研究进展

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福建医科大学学报 2022年第6期56卷 459-469页

作者：许静(综述) 吴淑香林旭(审校) 福建医科大学基础医学院消化道恶性肿瘤教育部重点实验室福州350122 福建医科大学基础医学院肿瘤微生物学福建省重点实验室福州350122

蛋白质翻译后修饰(post-translational modification,PTM)在细胞的生命活动过程中起重要作用,如蛋白质降解、基因表达、信号转录调节、细胞周期进展、应激反应和炎症的发生、发展等。常见的PTM包括糖基化、甲基化、磷酸化、乙酰化、泛... 详细信息

蛋白质翻译后修饰(post-translational modification,PTM)在细胞的生命活动过程中起重要作用,如蛋白质降解、基因表达、信号转录调节、细胞周期进展、应激反应和炎症的发生、发展等。常见的PTM包括糖基化、甲基化、磷酸化、乙酰化、泛素化和类泛素化等。

关键词：犹素修饰犹素蛋白质生理学病理学翻译后修饰

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微囊藻毒素-LR对小鼠原代肝细胞线粒体功能的影响

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中国实验动物学报 2021年第6期29卷 816-822页

作者：贺云陈艺生任岚尹一杰胡桂玲吴云丽福建医科大学基础医学院消化道恶性肿瘤教育部重点实验室福建省肿瘤微生物学重点实验室福州350122 福建省立医院临床医学实验研究中心福州350001

目的蓝藻水华引起的微囊藻毒素污染是世界性关注话题之一,微囊藻毒素LR(MC-LR)具有强特异性肝毒性,但其引起肝损伤的确切机制尚未完全阐明。为解决这一问题,本研究从细胞分子层面探讨MC-LR造成肝细胞线粒体功能改变的分子机制。方法提... 详细信息

目的蓝藻水华引起的微囊藻毒素污染是世界性关注话题之一,微囊藻毒素LR(MC-LR)具有强特异性肝毒性,但其引起肝损伤的确切机制尚未完全阐明。为解决这一问题,本研究从细胞分子层面探讨MC-LR造成肝细胞线粒体功能改变的分子机制。方法提取小鼠原代肝细胞,加入梯度剂量的MC-LR(2.5~10 nmol/L)作用48 h,以未加毒素处理组为对照,检测MC-LR对线粒体功能的影响(包括ATP水平和线粒体膜电位检测),DNA损伤(包括彗星试验和8-OHdG水平检测),并分析p53抑制剂pft-α作用下线粒体功能损伤情况。结果 MC-LR造成肝细胞线粒体功能障碍,DNA损伤且p53蛋白表达水平上调;p53特异性抑制剂pft-α减轻MC-LR造成的线粒体损伤。结论在本试验条件下,MC-LR造成小鼠肝细胞线粒体功能异常的机制与其造成DNA损伤诱导p53上调有关。

关键词：微囊藻毒素-LR 原代肝细胞线粒体功能 DNA损伤 p53

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临床宏基因组学应用现状及存在问题分析

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中国微生态学杂志 2021年第5期33卷 594-598页

作者：邱薇钟民涛伦永志莆田学院药学与医学技术学院医学微生态学福建省高校重点实验室福建莆田351100 大连医科大学基础医学院微生物学教研室

众所周知,宏基因组学是一种通过提取样品中微生物的总DNA,构建宏基因组文库,研究环境中全部微生物的遗传组成及其菌落功能的方法。而宏基因组新一代测序(metagenome next-generation sequencing, mNGS)是在宏基因组学基础上进一步发展... 详细信息

众所周知,宏基因组学是一种通过提取样品中微生物的总DNA,构建宏基因组文库,研究环境中全部微生物的遗传组成及其菌落功能的方法。而宏基因组新一代测序(metagenome next-generation sequencing, mNGS)是在宏基因组学基础上进一步发展起来的新一代测序技术,无需对患者标本进行培养,直接分析标本中的微生物DNA或RNA。本文介绍了宏基因组学在临床上的应用,包括传染病的诊断、疾病和健康状态下的微生物组分析、人类宿主反应分析和肿瘤相关病毒及其基因组鉴定,并简要探讨了临床宏基因组学研究中所遇到的挑战及解决方法。

关键词：临床微生物学宏基因组学传染病诊断生物信息学

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乙型肝炎病毒通过抑制AGE-Rs表达促进AGEs诱导的肝癌细胞增殖

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福建医科大学学报 2021年第2期55卷 99-103页

作者：王标陈艳福建医科大学基础医学院消化道恶性肿瘤教育部重点实验室福建省肿瘤微生物学重点实验室福州350122

目的探讨乙型肝炎病毒(HBV)对晚期糖基化终产物受体(AGE-Rs)表达及AGEs诱导下肝癌细胞增殖的影响。方法利用HepG2.2.15细胞或肝癌细胞HepG2瞬时转染1.2倍HBV基因组,采用实时荧光定量PCR技术和蛋白质免疫印迹法(Western-blot),从mRNA水... 详细信息

目的探讨乙型肝炎病毒(HBV)对晚期糖基化终产物受体(AGE-Rs)表达及AGEs诱导下肝癌细胞增殖的影响。方法利用HepG2.2.15细胞或肝癌细胞HepG2瞬时转染1.2倍HBV基因组,采用实时荧光定量PCR技术和蛋白质免疫印迹法(Western-blot),从mRNA水平和蛋白水平检测HBV对AGE-Rs表达的影响。使用AGEs(100μg/mL)处理细胞,采用CCK-8法比较HepG2和HepG2.2.15细胞在AGEs诱导下的增殖情况。结果在HepG2.2.15细胞或瞬时转染HBV的HepG2细胞中,AGE-R1和AGE-R3的mRNA和蛋白表达水平降低(P<0.05),而AGE-R2表达水平无变化。细胞增殖实验表明,在AGEs诱导下,HepG2.2.15细胞的增殖能力强于HepG2细胞(P<0.05)。结论HBV可以抑制肝癌细胞AGE-R1和AGE-R3的表达,并促进AGEs诱导下肝癌细胞的增殖。

关键词：乙型肝炎病毒晚期糖基化终产物细胞增殖肝癌细胞

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