目的探讨蛋白质磷酸酶4催化亚基(protein phosphatase 4 catalytic subunit,PP4C)对乙型肝炎病毒X蛋白(hepatitis B virus X protein,HBx)在蛋白质水平的调控及生物学功能的影响,为乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)相关性肝癌提供...
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目的探讨蛋白质磷酸酶4催化亚基(protein phosphatase 4 catalytic subunit,PP4C)对乙型肝炎病毒X蛋白(hepatitis B virus X protein,HBx)在蛋白质水平的调控及生物学功能的影响,为乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)相关性肝癌提供潜在治疗靶点。方法通过免疫共沉淀(co-immunopreciptation,Co-IP)与GST pull-down试验验证HBx与PP4C在体内与体外的相互作用。采用Lipofectamine 3000试剂转染PP4C过表达真核质粒检测PP4C对HBx在蛋白质水平的影响,并用蛋白质合成抑制剂环己酮亚胺(cycloheximide,CHX)处理过表达PP4C的肝癌细胞,Western blot检测HBx半衰期变化。磷酸化试验检测PP4C对HBx磷酸化水平的影响。CCK8增殖、细胞划痕、Matrigel侵袭小室试验检测PP4C对HBx生物学功能的影响。结果Co-IP与GST pull-down试验证实HBx与PP4C在肝癌细胞内存在相互作用,在体外也存在相互作用。肝癌细胞中过表达PP4C可提高HBx蛋白水平,并明显延长HBx半衰期。磷酸化试验证实在肝癌细胞中过表达PP4C可降低HBx丝氨酸磷酸化水平。PP4C过表达对肝癌细胞的增殖没有影响,但是促进肝癌细胞的迁移与侵袭能力。结论HBx与PP4C的相互作用可提高HBx稳定性,最终促进肝癌细胞的迁移与侵袭,其机制与PP4C降低HBx丝氨酸磷酸化水平有关。本研究为发现HBx致病新机制提供理论依据,以PP4C和HBx蛋白相互作用为靶标,有望为HBV感染相关肝脏疾病的治疗提供有益思路。
目的探究泛素特异性肽酶22(ubiquitin specific peptidase 22,USP22)与乙型肝炎病毒X蛋白(hepatitis B virus X protein,HBx)相互作用对HBx蛋白水平及其生物学功能的影响。方法通过GST pull-down、免疫共沉淀以及激光共聚焦试验检测HBx...
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目的探究泛素特异性肽酶22(ubiquitin specific peptidase 22,USP22)与乙型肝炎病毒X蛋白(hepatitis B virus X protein,HBx)相互作用对HBx蛋白水平及其生物学功能的影响。方法通过GST pull-down、免疫共沉淀以及激光共聚焦试验检测HBx与USP22的相互作用。瞬时转染USP22真核表达质粒或干扰USP22表达的siRNA,Western blot检测肝细胞中HBx蛋白表达水平的变化。以环己酰亚胺(cycloheximide,CHX)、蛋白酶体抑制剂MG132(carbobenzoxy-Leu-Leu-leucinal,MG132)分别处理转染后的细胞,检测HBx蛋白的降解速率。进一步通过细胞内泛素化试验检测USP22对HBx泛素化的影响,明确USP22影响HBx蛋白稳定性的具体机制。最后,以双荧光素酶报告试验和平板克隆试验检测USP22对HBx生物学功能的影响。结果USP22与HBx存在相互作用。USP22显著增加HBx蛋白稳定性,并通过去除HBx的泛素化抑制HBx通过蛋白酶体降解,进而增强HBx的生物学功能。结论USP22抑制HBx通过泛素依赖-蛋白酶体途径降解,增强HBx蛋白稳定性并促进HBx功能。
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