目的:本研究旨在建立同时测定蜂蜜中氧氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星和恩诺沙星的层状双氢氧化物-空气辅助-分散固相萃取-高效液相色谱法,并将所建方法应用于蜂蜜样品中四种喹诺酮类兽药残留的检测。方法:蜂蜜样品经水稀释后调节p H至碱性,加入镍/铝-层状双氢氧化物提取剂,通过空气辅助-分散固相萃取法提取蜂蜜中氧氟沙星、诺氟沙星、恩诺沙星和环丙沙星四种喹诺酮类兽药,离心后用磷酸溶液溶解提取剂,用高效液相色谱-荧光检测器检测。以保留时间定性,工作曲线法定量。通过扫描电子显微镜、透射电子显微镜、傅里叶变换红外光谱和X射线衍射等方法表征所选用的层状双氢氧化物的形貌、尺寸、官能团等理化性质。以四种喹诺酮类兽药的提取效率为指标,优化稀释液体积、p H值、提取剂种类和用量、辅助提取方式和时间、溶解液种类和用量,获得提取蜂蜜中四种喹诺酮类兽药的最佳条件。以分离度、分析时间和目标兽药的峰面积为指标,优化高效液相色谱法的波长、流动相、柱温和流速,获得高效液相色谱法测定蜂蜜中四种喹诺酮类兽药的最佳条件。通过测定方法的线性范围、检出限、定量限、加标回收率、日内和日间相对标准偏差来评估方法的灵敏度、准确度和精密度。将所建立的方法应用于43种蜂蜜样品中氧氟沙星、诺氟沙星、恩诺沙星和环丙沙星残留的测定。结果:本研究成功建立同时检测蜂蜜中氧氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星和恩诺沙星四种喹诺酮类兽药的空气辅助-分散固相萃取-高效液相色谱法。蜂蜜中喹诺酮类兽药的最佳提取条件为:用6 m L超纯水稀释1 g蜂蜜样品,调节p H值至8,取1 m L蜂蜜水溶液加入2 mg镍/铝-层状双氢氧化物,用注射器抽打50次进行空气辅助萃取,离心后加入250μL浓度为0.1%的磷酸溶液来溶解沉淀。优化后的高效液相色谱法条件为:色谱柱为C18色谱柱;流动相由甲醇、乙腈和磷酸-三乙胺水溶液(1 L水含3.4 m L磷酸和6 m L三乙胺)组成,三者体积比为18:6:76;荧光激发波长为280 nm,荧光发射波长为460 nm;柱温为35℃;流速为0.9 m L/min。在优化后的样品前处理和高效液相色谱条件下,10分钟即可完成蜂蜜中四种喹诺酮类兽药的提取,17分钟可完成蜂蜜中四种喹诺酮类兽药的测定。四种喹诺酮类兽药的线性范围为1.00~100 ng/g,相关系数为0.9996~0.9999;方法检出限和定量限分别为0.25~0.82 ng/g和0.82~2.73 ng/g;加标回收率为81.9%~90.4%;日内和日间相对标准偏差分别为4.39%~11.0%和2.16%~17.5%。在所测蜂蜜样品中均未检出氧氟沙星和诺氟沙星。分别在1种荆条蜜、槐花蜜和百花蜜中检出恩诺沙星,在1种枇杷花蜜中检出环丙沙星。在1种四川省蜂蜜样品中检出环丙沙星,分别在1种福建省、湖北省和湖南省生产的蜂蜜样品中检出恩诺沙星。在秋季蜂蜜样品中均未检出四种喹诺酮类兽药,在1种春季蜂蜜样品和2种夏季蜂蜜样品中检出恩诺沙星,在1种冬季蜂蜜样品检出环丙沙星。所检出的蜂蜜样品中喹诺酮类兽药含量均低于《食品安全国家标准食品中41种兽药最大残留限量》(GB 31650.1-2022)规定的氧氟沙星、诺氟沙星、恩诺沙星和环丙沙星的最大残留限量。结论:所建立的空气辅助-分散固相萃取-高效液相色谱法操作简便、灵敏、准确、提取效率高、成本低,环境友好,适用于蜂蜜中喹诺酮类兽药残留的测定。
【目的】基于16S r DNA扩增子测序技术建立灰尘样本的采集、DNA提取以及细菌高通量测序和分析的实验方法;初步探索不同地区的灰尘中细菌的变化情况,探讨基于细菌DNA数据对样本来源的地域之间的区分效果。【方法】1.样本采集:样本采集应...
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【目的】基于16S r DNA扩增子测序技术建立灰尘样本的采集、DNA提取以及细菌高通量测序和分析的实验方法;初步探索不同地区的灰尘中细菌的变化情况,探讨基于细菌DNA数据对样本来源的地域之间的区分效果。【方法】1.样本采集:样本采集应选择自然掉落的新鲜落尘采集,并采用滚动擦拭的方式来采集灰尘,以获得高质量的灰尘DNA。采集实验室居住环境的门框上缘的灰尘进行方法建立。进行地域区分时样本采集北京、福州、昆明和乌鲁木齐四个城市小区单元门门框外上缘的灰尘,北京采集10个小区的样本,昆明12个小区的样本,福州13个小区的样本,乌鲁木齐13个小区的样本。使用尼龙植绒拭子进行采样,每个小区不低于三个单元门,每个单元门不低于五个重复,并做好标记,每次采完样后立即将其放在干冰盒保存,运输至实验室后保存于-80℃冰箱,直至进一步分析。***提取:采用商业化试剂盒(DNeasy Power Soil Pro kit)进行DNA提取。在DNA的提取步骤中,将样本保存管内的沉淀和拭子一起进行DNA提取,用生物样品均质仪震荡裂解样本2min取代商业化试剂盒推荐的震荡裂解15min。最后DNA过滤柱时吸附时,将平行重复的样本用同一个过滤柱进行DNA吸附以增加DNA浓度,使用Qubit?3.0进行DNA定量。***扩增:使用针对细菌16S r DNA V4区域的通用引物515F(5’-GT GYCAGCMGCCGCGGTAA-3’)和806R(5’-GGACTACNVGGGTWTCT AAT-3’)进行扩增,用Agilent DNA 1000 Kit对扩增的目标片段进行检测,最后利用Qu Bit和q PCR两种定量方式对文库进行定量比较。4.测序和生物信息学分析:将城市样本利用建立的检测方法进行测序文库构建,在Illumina Mi Seq平台测序,按照不同城市将样本分组,测序的原始数据利用QIIME2软件处理,用处理后的数据进行α、β多样性和差异物种分析,最后利用R软件对数据进行可视化分析。【结果】1.利用515F-806R引物成功扩增到所需目标片段,两种文库定量方法之间并无显著差异。2.建立的细菌微生物检测方法能够得到灰尘中的细菌DNA信息进行下游生物信息学分析。3.在细菌注释的门和科水平,同一小区不同单元门之间优势物种和相对丰度基本一致,不同城市之间物种组成和相对丰度之间存在很大差异。***多样性分析显示北京的灰尘拥有四个城市中最高的物种丰度和菌群多样性。Beta多样性组间分析显示基于不同的距离矩阵可以将不同城市进行区分,PCA、PCo A和NMDS分析显示各城市的样本菌群较为集中,北京的样本是最为集中的小区样本之间差异小,福州样本较为分散,说明福州小区样品间的差异程度较大。5.在对两个城市之间进行的差异物种分析中,特吕珀菌科(Trueperaceae)只出现在昆明与其他三个城市的差异物种分析中。肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、甲基杆菌科(ethylobacteriaceae)只出现在乌鲁木齐和其他三个城市之间的差异分析中。慢生根瘤菌科(Bradyrhizobiaceae)、孢囊桿菌科(Cystobacteraceae)、草酸杆菌科(Oxalobacteraceae)、红杆菌科(Rhodobacteraceae)、红螺菌科(Rhodospirillaceae)只出现在北京和其他三个城市之间进行差异分析中。微球菌科(Micrococcaceae)基本只存在于福州与其他城市之间的差异分析中。【结论】灰尘这种微量复杂的样本通过相应的微生物检测方法,可以用于不同地理来源之间样本的区分,并能找出城市之间的差异和特有物种,这些物种可能是具有城市特征性的代表性物种,可根据差异物种挖掘相关性显著的特异标志微生物用于更精确区分不同城市。
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