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中华实验外科杂志 2010年第5期27卷 580-582页

作者：张金池王玉龙吴明祥郭平凡福建医科大学附属第一医院血管外科福建医科大学血管与腔内血管外科研究室福州350005

目的构建携带人碱性成纤维生长因子（bFGF）基因的重组慢病毒表达载体。方法采用聚合酶链反应（PCR）方法钓取人源性的bFGF和FGF4两个目的基因片段，将该基因克隆到慢病毒载体表达质粒pGC-FU[含绿色荧光蛋白（GFP）]中，得到pGCFU-FGF4-... 详细信息

目的构建携带人碱性成纤维生长因子（bFGF）基因的重组慢病毒表达载体。方法采用聚合酶链反应（PCR）方法钓取人源性的bFGF和FGF4两个目的基因片段，将该基因克隆到慢病毒载体表达质粒pGC-FU[含绿色荧光蛋白（GFP）]中，得到pGCFU-FGF4-bFGF，通过PCR、酶切、测序和对比验证bFGF后，通过Lipofectamine2000的介导把pGCFU-FGF4-bFGF质粒和包装质粒pHelper1．0、pHelper2．0共转染至包装细胞293T，经同源重组产生重组慢病毒pGCFU-FGF4-bFGF，pGCFU-FGF4-bFGF在293T细胞内大量扩增，应用实时定量PCR法鉴定和测定滴度。结果克隆得到500bp目的bFGF全长基因，经过PCR扩增、酶切鉴定、序列测定证实，bFGF基因成功克隆到慢病毒载体中，可实现bFGF基因的表达，且病毒滴度为2．0×10^9TU／ml。结论成功构建表达人bFGF基因的慢病毒载体并能在293T细胞中扩增获得足够高的病毒滴度，可作为后续基因治疗研究工作的基因转染工具。

关键词：碱性成纤维生长因子慢病毒载体基因转染

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体外诱导糖尿病鼠骨髓间充质干细胞向血管内皮样细胞分化的研究

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中华实验外科杂志 2012年第1期29卷 55-57页

作者：张金池欧阳亮远吴佳文王敬瀚福建医科大学附属第一医院血管外科福建医科大学血管与腔内血管外科研究室福州350005

目的观察链脲佐菌素（STZ）诱导的糖尿病大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）的体外培养方法和向血管内皮样细胞分化的能力。方法利用密度梯度离心分离和贴壁培养相结合的方法从STZ诱导的糖尿病大鼠骨髓中提纯单个核细胞，体外扩增3代，倒置... 详细信息

目的观察链脲佐菌素（STZ）诱导的糖尿病大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）的体外培养方法和向血管内皮样细胞分化的能力。方法利用密度梯度离心分离和贴壁培养相结合的方法从STZ诱导的糖尿病大鼠骨髓中提纯单个核细胞，体外扩增3代，倒置显微镜观察细胞生长及形态，流式细胞仪检测BMSCs表面抗原表达。取扩增第3代的BMSCs，分为2组，诱导组加入诱导培养剂[含10％胎牛血清、10μg/L血管内皮生长因子（VEGF）、2μg／L碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、100U／ml青霉素、100mg／L链霉素的M199培养基]中诱导分化，对照组则不加任何细胞因子。2周后行细胞形态学观察，免疫细胞化学法检测VEGF受体（VEGFR）-2表达，流式细胞仪测定CD34表达量，紫外线分光光度法测定一氧化碳（NO）含量，电镜观测胞质Weibel Palade小体。结果STZ腹腔注射可诱导糖尿病大鼠模型。流式细胞仪显示第3代BMSCs表达表面抗原：CIM4和CD90阳性细胞表达率分别为（97．8±0．9）％和（96．8±1．4）％，而CD11b／e和CD34阳性细胞表达率分别为（13．2±0．6）％和（1．2±0．5）％。诱导组大部分细胞形态变化不明显，呈长梭形、杆状、多角形，诱导组VEGFR-2、CD34阳性表达率分别为（97．1±1．0）％和（65．0±3．9）％，而对照组则为（7．0±1．0）％和（0．9±0．3）％，两组比较差异有统计学意义（P〈0．05）；诱导组胞外NO含量（94．14±3．25）μmol／L亦明显高于对照组（70．37±2．10）μmol/L（P〈O．05）；电镜两组均未观察到胞质Weibel Palade小体。结论经密度梯度离心分离和贴壁培养相结合的方法可从骨髓中提纯BMSCs。糖尿病鼠BMSCs可在体外诱导向血管内皮样细胞方向分化，BMSCs有望作为治疗糖尿病下肢缺血性疾病的种子细胞。

关键词：糖尿病骨髓间充质干细胞诱导分化内皮样细胞

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人碱性成纤维生长因子基因修饰大鼠骨髓间充质干细胞的研究

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中华实验外科杂志 2013年第5期30卷 928-930页

作者：张金池蔡森林吴佳文吴明祥郑国富欧阳亮远福建医科大学附属第一医院血管外科福建医科大学血管与腔内血管外科研究室福州350005

目的观察人碱性成纤维生长因子（bFGF）基因修饰大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）在体外向血管内皮样细胞分化的能力。方法利用密度梯度离心分离和贴壁培养相结合的方法从SD大鼠骨髓中提纯单个核细胞，体外扩增3代，倒置显微镜观察细胞生... 详细信息

目的观察人碱性成纤维生长因子（bFGF）基因修饰大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）在体外向血管内皮样细胞分化的能力。方法利用密度梯度离心分离和贴壁培养相结合的方法从SD大鼠骨髓中提纯单个核细胞，体外扩增3代，倒置显微镜观察细胞生长及形态，流式细胞仪检测BMSCs表面抗原表达。取扩增第3代的BMSCs，分为3组：阴性对照组（普通的BMSCs组）、空白对照组（不含bFGF基因但含有GFP的慢病毒载体转染组）、实验组（含bFGF目的基因的慢病毒载体转染组），3组同法培养[培养基10％胎牛血清、50μg／L血管内皮生长因子（VEGF）的L-DMEM培养基]。1周后各组上清液ELSIA法测定bFGF含量，4周后各组行细胞形态学观察，免疫细胞化学法检测细胞表面标记分子CD31、CD34及Ⅷ因子的表达及Dil—AC—LDL吞噬实验等。结果流式细胞仪显示分离、培养的第3代BMSCs表面抗原阳性表达率：CD11b／c和CD34分别为（14．16±0．72）％和（1．29±0．46）％，而CD44和CD90分别为（97．87±0．84）％和（96．85±1．49）％。实验组bFGF分泌量（5．50±0．12）ng／L明显高于空白对照组（2．65±0．40）ng／L和阴性对照组（2．76±0．25）ng／L，实验组与空白对照组以及阴性对照组比较差异有统计学意义（P〈0．01）；3组大部分细胞形态变化不明显，呈长梭形、杆状、多角形。实验组CD31、CD34及Ⅷ因子阳性表达率分别为（22．73±5．42）％、（26．32±3．95）％和（30．34±6．62）％，而空白对照组和阴性对照组则为[（7．85±1．83）％、（8．93±1．37）％、（10．23±1．21）％]和[（7．57±1．21）％、（8．41±0．97）％、（9．97±0．52）％]，实验组与空白对照组以及阴性对照组比较差异有统计学意义（P〈0．01）；诱导后实验组细胞能有效地吞噬Dil-AC-LDL，表达荧光的平均吸光度值，实验组（0．52±0．23）明显高于阴性对照组（0．05±0．03）和空白对照组（0．07±0．02），实验组与空白对照组以及阴性对照组比较差异有统计学意义（P〈0．01）。结论人bFGF基因修饰的BMSCs能分泌bFGF，在VEGF的诱导下该细胞能够更有效地向血管内皮细胞样细胞分化。

关键词：碱性成纤维生长因子骨髓间充质干细胞基因转染分化

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人碱性成纤维细胞生长因子基因转染大鼠骨髓间充质干细胞的研究

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中华实验外科杂志 2010年第10期27卷 1436-1438页

作者：张金池吴明祥王玉龙郭平凡刘学强福建医科大学附属第一医院血管外科福建医科大学血管与腔内血管外科研究室福州350005

目的观察人碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）基因体外转染对大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）bFGF表达的影响.方法密度梯度离心、贴壁法培养分离SD雄性大鼠MSCs,体外扩增,流式细胞仪检测MSCs表面抗原表达.利用慢病毒载体系统介导将具有人... 详细信息

目的观察人碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）基因体外转染对大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）bFGF表达的影响.方法密度梯度离心、贴壁法培养分离SD雄性大鼠MSCs,体外扩增,流式细胞仪检测MSCs表面抗原表达.利用慢病毒载体系统介导将具有人源性bFGF基因转染至第2代MSCs,在倒置荧光显微镜下观察转染后细胞形态和生长的变化,应用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）、Western blot法鉴定bFGF在MSCs中的表达.结果密度梯度离心、贴壁法培养分离可获得MSCs,P3代大鼠细胞利用流式细胞仪检测CD11b/c阳性细胞表达率为（13.2±0.6）%,CD34阳性细胞表达率为（1.2±0.5）%,CD44阳性细胞表达率（97.8±0.9）%,CD90阳性细胞表达率（96.8±1.4）%.MSCs转染48 h后,绿色荧光蛋白的表达明显增强.RT-PCR证实转基因MSCs表达bFGF mRNA明显增强,Western blot检测证实转基因MSCs在49 KDr出现特异性条带,而空白和空载组的MSCs则未见阳性条带.结论采用慢病毒介导的基因转染技术可以将bFGF基因转染至MSCs中,并有外源性bFGFmRNA和蛋白的有效表达,MSCs可作为bFGF基因治疗的载体.

关键词：成纤维细胞生长因子骨髓间充质干细胞转染

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乌司他丁对大鼠骨骼肌缺血-再灌注损伤的保护作用

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中华急诊医学杂志 2008年第4期17卷 389-393页

作者：张金池王敬瀚郭平凡福建医科大学附属第一医院血管外科、福建医科大学血管外科研究室福州350005 350005福州福建医科大学附属第一医院血管外科、福建医科大学内科福州350005

目的探讨乌司他丁对大鼠骨骼肌缺血-再灌注损伤的保护作用。方法24只健康成年雄性SD大鼠随机分为3组（每组8只）：对照组（C组）、缺血-再灌注损伤组（I／R组）、乌司他丁处理组（U组）。C组仅麻醉肢体没有缺血操作；I／R组于再灌注前... 详细信息

目的探讨乌司他丁对大鼠骨骼肌缺血-再灌注损伤的保护作用。方法24只健康成年雄性SD大鼠随机分为3组（每组8只）：对照组（C组）、缺血-再灌注损伤组（I／R组）、乌司他丁处理组（U组）。C组仅麻醉肢体没有缺血操作；I／R组于再灌注前颈外静脉注入生理盐水0．5ml；U组于再灌注前同法给乌司他丁0．5ml（5×10^4／kg）。以橡皮带环绕结扎大鼠左后肢根部至趾掌无血流信号达4h后放开橡皮带，再灌注4h建立大鼠骨骼肌缺血-再灌注损伤模型。再灌注4h各组处死动物采集标本，采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）法测定骨骼肌组织TNF-α mRNA的表达；酶联免疫吸附试验法（ELISA）测定血浆TNF-α水平；比色法检测血浆乳酸脱氢酶（LDH）、肌酸激酶（CK）、丙二醛（MDA）和组织过氧化物酶（咖的）含量，测定湿质量／干质量均（W／D）及光镜、电镜观察骨骼肌组织结构的变化。应用SPSS10．0统计软件，用单因素方差分析。结果骨骼肌组织TNF-α mRNA的表达在I／R组明显高于C组（P〈0．05），而U组则低于I／R组（P〈0．01）；血浆俐Ra浓度I／R组明显高于C组（P〈0．01），而U组则低于I／R组（P〈0．05）；血浆LDH、MDA、CK和组织MDA、MPO水平以及W／D比值I／R组高于C组（P〈0．05），U组则低于I／R组（P〈0．05）；骨骼肌组织形态学和超微结构的损伤U组也较I／R组减轻。结论乌司他丁通过抑制细胞因子的生成、抑制氧自由基代谢产物MDA的产生和减少MPO的活性而对骨骼肌缺血，再灌注起保护作用。

关键词：乌司他丁骨骼肌再灌注损伤肿瘤坏死因子-α 丙二醛过氧化物酶

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中华实验外科杂志 2015年第2期32卷 274-276页

作者：张金池李文献欧阳亮远吴霖张连芳肖萌福建医科大学附属第一医院血管外科福建医科大学血管与腔内血管外科研究室福州350005

目的探讨构建人类生长因子受体结合蛋白2相关的接头蛋白1（Gab1）基因重组慢病毒RNA干扰载体的方法,研究其对人脐静脉血管内皮细胞株***926的沉默效率.方法针对人类Gab1基因设计5个靶点的小干扰RNA （siRNA）序列,并分别合成靶序列的O... 详细信息

目的探讨构建人类生长因子受体结合蛋白2相关的接头蛋白1（Gab1）基因重组慢病毒RNA干扰载体的方法,研究其对人脐静脉血管内皮细胞株***926的沉默效率.方法针对人类Gab1基因设计5个靶点的小干扰RNA （siRNA）序列,并分别合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经Hpa I和Xho I限制性内切酶双酶切后的GV118载体连接,产生Gab1-RNA干扰（RNAi）转化子,聚合酶链反应（PCR）筛选阳性克隆并进行测序鉴定.将测序正确的Gab1-RNAi、pHelper 1.0和pHelper 2.0质粒共转染239T细胞,包装产生LV-Gab1-RNAi慢病毒并测定其滴度.将获得的慢病毒分别转染***926细胞,通过荧光显微镜观察绿色荧光蛋白（GFP）的表达,测定其转染效率;通过反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测转染后的***926细胞中Gab1 mRNA表达水平来验证慢病毒干扰载体的基因沉默效率.结果经PCR分析和测序证实,成功构建LV-Gab1-RNAi慢病毒载体;病毒滴度为3×10^9 TU/ml;荧光显微镜下转染组细胞GFP荧光表达强烈,转染效率达70％以上;RT-PCR证实干扰组细胞Gab1 mRNA表达水平（0.088 ±0.003）较对照（0.947±0.087）组和空白组（0.999±0.067）显著降低（P＜0.01）.结论成功构建人Gab1基因RNAi慢病毒载体并能在293T细胞中扩增获得足够的病毒滴度,能明显抑制Gab1基因在***926细胞株中的表达.

关键词：生长因子受体结合蛋白2相关的接头蛋白1 RNA干扰慢病毒载体基因重组

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后腹腔镜腰交感神经节切除术治疗血栓闭塞性脉管炎

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中华实验外科杂志 2012年第9期29卷 1829-1830页

作者：张金池郑清水郭平凡蔡方刚刘学强福建医科大学附属第一医院血管外科福建医科大学血管外科研究室福州350005 福建医科大学附属第一医院泌尿外科

目的探讨应用后腹腔镜下腰交感神经节切除术（VALLS）治疗血栓闭塞性脉管炎（TAO）的可行性和临床疗效。方法26例TAO患者施行了VALLS，观察术前术后疼痛（VAS评分）、皮温和跛距的变化以及术后并发症。结果VALLS技术成功率为100％，24... 详细信息

目的探讨应用后腹腔镜下腰交感神经节切除术（VALLS）治疗血栓闭塞性脉管炎（TAO）的可行性和临床疗效。方法26例TAO患者施行了VALLS，观察术前术后疼痛（VAS评分）、皮温和跛距的变化以及术后并发症。结果VALLS技术成功率为100％，24例随访（随访牢92．31％）8～78个月，平均24个月，患者原有下肢临床症状改善或消失。术后3个月患肢疼痛VAS评分手术后（3．14±1．57）较手术前（7．684-1．66）有明显改善（t=38．12，P〈0．01）；患肢足背皮肤温度术后[（32．92±1．68）℃]比VALLS前[（31．21±1．55）℃]升高（t=4．93，P〈0．05）；跛行距离术后f（801．65±145．88）m]较手术前[（136．89±114．52）m]有明显改善（t=37．34，P〈0．01），没有严重并发症发生。结论VALLS技术成功率高，临床疗效满意，本组无严重并发症，治疗TAO安全、微创和有效。

关键词：腹腔镜腰交感神经节切除术血栓闭塞性脉管炎

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微创刨吸术治疗下肢静脉曲张166例临床报告

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中国中西医结合外科杂志 2005年第5期11卷 415-416页

作者：张金池郭平凡福建医科大学附属第一医院血管外科福州350005 福建医科大学血管外科研究室

我院自2003年6月引进美国TriVex系统（Smith ＆ Nepher公司）进行曲张静脉刨吸术（transilluminated powered phlebectomy,TPP）的微创治疗,共166例189条肢体,疗效满意,现报告如下.

关键词：下肢静脉曲张刨吸术微创治疗

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体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向血管内皮细胞分化的研究

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中国中西医结合外科杂志 2006年第4期12卷 401-403页

作者：张金池王敬瀚郭平凡王中心福建医科大学附属第一医院血管外科福州350005 福建医科大学血管外科研究室

目的探讨大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)的体外培养方法和向血管内皮细胞分化的能力。方法利用淋巴细胞分离液分离出MSCs,体外扩增,流式细胞仪检测MSCs表面抗原表达,以含VEGF、bFGF的诱导分化培养液定向诱导传代使细胞向血管内皮细胞分化,... 详细信息

目的探讨大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)的体外培养方法和向血管内皮细胞分化的能力。方法利用淋巴细胞分离液分离出MSCs,体外扩增,流式细胞仪检测MSCs表面抗原表达,以含VEGF、bFGF的诱导分化培养液定向诱导传代使细胞向血管内皮细胞分化,流式细胞仪进行内皮细胞特异性标志物鉴定,测定内皮细胞NO的释放量,电镜观测W-P小体。结果MSCs在体外传代扩增后流式细胞仪检测结果显示CD29表达阳性,CD34、CD45为阴性,分化后的细胞具有内皮细胞的形态学特征并具特异性W-P小体,可表达CD34,而不表达CD45,能释放NO。结论骨髓间充质干细胞可在体外诱导向内皮细胞方向分化。

关键词：骨髓间充质干细胞诱导分化内皮细胞大鼠

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基因修饰骨髓干细胞治疗下肢缺血的研究进展

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国际外科学杂志 2009年第8期36卷 538-541页

作者：王玉龙张金池福建医科大学附属第一临床医学院血管外科福建医科大学血管与腔内血管外科研究室福州350005

随着基因技术的发展，基因修饰干细胞用于下肢缺血疾病的治疗逐渐成为可能。基因修饰能使干细胞更好应用于下肢缺血的治疗。在细胞移植前，进行细胞基因修饰，提高了细胞的存活，尤其是干细胞，且可增强细胞治疗效果，但该治疗方法目前... 详细信息

随着基因技术的发展，基因修饰干细胞用于下肢缺血疾病的治疗逐渐成为可能。基因修饰能使干细胞更好应用于下肢缺血的治疗。在细胞移植前，进行细胞基因修饰，提高了细胞的存活，尤其是干细胞，且可增强细胞治疗效果，但该治疗方法目前仅限于实验阶段。本文就基因修饰骨髓间充质干细胞目前在下肢缺血疾病治疗应用方面做一综述。

关键词：基因治疗干细胞下肢缺血

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