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鸭腺病毒3型Hexon基因的克隆及SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法的建立

中国兽医学报 2019年第6期39卷 1104-1112页

作者：陈翠腾万春和程龙飞傅光华施少华刘荣昌陈珍朱春华黄瑜福建省农业科学院畜牧兽医研究所福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心/福建省禽病防治重点实验室福建福州350013

鸭腺病毒3型(duck adenovirus type 3,DAdV-3)是近年来我国新发鸭源禽腺病毒。本试验根据NCBI数据库中DAdV-3 Hexon基因特征,设计特异性引物,获得番鸭源DAdV-3福建株(命名为W1FJ株)Hexon基因全长,明确其分子特征,并基于此建立检测DAdV-3... 详细信息

鸭腺病毒3型(duck adenovirus type 3,DAdV-3)是近年来我国新发鸭源禽腺病毒。本试验根据NCBI数据库中DAdV-3 Hexon基因特征,设计特异性引物,获得番鸭源DAdV-3福建株(命名为W1FJ株)Hexon基因全长,明确其分子特征,并基于此建立检测DAdV-3的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。结果表明,克隆的W1FJ株Hexon基因全长为2 814 bp,编码937个氨基酸,和DAdV-3(CH-GD-12-2014株)核苷酸同源性为100%,但和鸭源禽腺病毒B型(也称鸭腺病毒2型,DAdV-2,GR株)核苷酸同源性仅为76.6%。Hexon蛋白遗传进化分析表明,W1FJ株和CH-GD-12-2014株在遗传进化上形成一个独立的分支,与鸭源禽腺病毒B型和鹅源禽腺病毒A型(goose aviadenovirus A)在遗传进化上明显不同,建议将其命名为鸭源禽腺病毒C型(duck aviadenovirus C)。建立的检测DAdV-3的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法,灵敏度高,最低检测限为61拷贝/μL;特异性强,和鸭群常见传染病病原均无交叉反应,扩增产物的熔解曲线只出现1个特异性单峰,Tm值为(81.48±0.25)℃;重复性好,组内和组间重复试验变异系数分别为0.49%~1.64%和0.67%~2.40%。本试验为DAdV-3的科学分类和后续开展DAdV-3感染的流行病学调查及致病机理研究奠定基础。

关键词：鸭腺病毒3型 Hexon基因 SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法

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种公鸡精液在坦布苏病毒感染传播中的作用

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中国兽医学报 2019年第7期39卷 1275-1279页

作者：陈珍施少华刘荣昌蔡国漳傅光华陈翠腾朱春华刘斌琼黄瑜福建省农业科学院畜牧兽医研究所/福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心/福建省禽病防治重点实验室

利用建立的(RT-)PCR方法对35份表现产蛋下降、受精率低下的种母鸡卵巢组织和140份用于人工授精种公鸡的精液进行病毒感染检测。结果仅检出坦布苏病毒阳性,其阳性率分别为100.0%和57.8%;以建立的间接ELISA方法对该种鸡群的320份种母鸡血... 详细信息

利用建立的(RT-)PCR方法对35份表现产蛋下降、受精率低下的种母鸡卵巢组织和140份用于人工授精种公鸡的精液进行病毒感染检测。结果仅检出坦布苏病毒阳性,其阳性率分别为100.0%和57.8%;以建立的间接ELISA方法对该种鸡群的320份种母鸡血清和140份种公鸡血清检测坦布苏病毒抗体,其阳性率分别为100.0%和69.3%。以上结果表明,该种鸡群的种母鸡和种公鸡均感染坦布苏病毒。以自精液中分离的坦布苏病毒人工感染成年公鸡,5d后在其精液中检测到坦布苏病毒,第14天在其血清中检测到坦布苏病毒抗体;以检测为坦布苏病毒阳性的精液通过人工授精给开产蛋鸡后出现产蛋率下降,并在其卵巢和血清中分别检测到坦布苏病毒及其特异性抗体。可见,种公鸡也可感染坦布苏病毒,且可通过精液以人工授精方式水平传播给开产蛋鸡并造成产蛋下降。因此,应加强种公鸡坦布苏病毒感染的监测,并将其纳入种鸡场垂直传播疫病控制与净化计划中。

关键词：公鸡精液坦布苏病毒传播作用

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鸭甲肝病毒2型TaqMan实时荧光定量PCR方法的建立

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中国家禽 2019年第15期41卷 23-27页

作者：万春和陈翠腾施少华程龙飞傅光华刘荣昌陈红梅傅秋玲黄瑜福建省农业科学院畜牧兽医研究所福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心福建省禽病防治重点实验室

研究利用全基因合成技术合成DHAV-2全基因组序列,并以此为标准品建立检测DHAV-2的TaqMan实时荧光定量PCR方法。结果表明:建立的方法敏感性高,最低检测限仅为33.7拷贝/μL;特异性强,对鸭甲肝病毒1型(DHAV-1)、鸭甲肝病毒3型(DHAV-3)、禽... 详细信息

研究利用全基因合成技术合成DHAV-2全基因组序列,并以此为标准品建立检测DHAV-2的TaqMan实时荧光定量PCR方法。结果表明:建立的方法敏感性高,最低检测限仅为33.7拷贝/μL;特异性强,对鸭甲肝病毒1型(DHAV-1)、鸭甲肝病毒3型(DHAV-3)、禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)、番鸭呼肠孤病毒(Muscovy duck reovirus,MDRV)、新型鸭呼肠孤病毒(Novel duck reovirus,N-DRV)、鸭源禽Ⅰ型副黏病毒(Duck-origin avian paramyxovirus type 1,APMV-1)和禽坦布苏病毒(Avian Tembusu virus,ATmV)均无交叉扩增;重复性佳,组内和组间变异系数最高分别为1.68%和2.19%。对2018年福建地区临床收集的128份鸭源病料进行检测,结果未检测DHAV-2感染阳性。研究结果为DHAV-2的快速检测试剂盒研究及储备DHAV-2检测技术奠定了基础。

关键词：鸭甲肝病毒2型 TaqMan 实时荧光定量PCR

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鸭腺病毒3型PCR检测方法的建立

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中国家禽 2019年第2期41卷 20-23页

作者：万春和陈翠腾施少华程龙飞傅光华刘荣昌陈红梅傅秋玲黄瑜福建省农业科学院畜牧兽医研究所福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心福建省禽病防治重点实验室福建福州350013

鸭3型腺病毒(Duck adenovirus type 3,DAdV-3)为近年来新发的以引起鸭肝脏肿大出血、肾脏大面积出血点为特征的鸭群新发疫病。为建立特异性的检测DAdV-3的PCR方法,研究通过分析鸭群中鸭腺病毒A型(DAdV-A)、鸭源禽腺病毒4型(FAdV-4)、鸭... 详细信息

鸭3型腺病毒(Duck adenovirus type 3,DAdV-3)为近年来新发的以引起鸭肝脏肿大出血、肾脏大面积出血点为特征的鸭群新发疫病。为建立特异性的检测DAdV-3的PCR方法,研究通过分析鸭群中鸭腺病毒A型(DAdV-A)、鸭源禽腺病毒4型(FAdV-4)、鸭2型腺病毒(DAdV-2)和DAdV-3的Fiber 2基因特征,建立特异性检测DAdV-3的PCR方法。结果显示:优化后的PCR方法最佳退火温度为54℃,对DAdV-3扩增片段大小为548 bp;敏感性强,最低检测限为36.4 pg;特异性好,对DAdV-A、FAdV-4、鸭病毒性肠炎(DEV)、番鸭细小病毒(MDPV)、鹅细小病毒(GPV)、鸭圆环病毒(DuCV)和鹅多瘤病毒(GHPV)均无特异性扩增。表明该方法可有效用于开展新发DAdV-3的流行病学调查。

关键词：鸭3型腺病毒 Fiber 2基因 PCR

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鸭3型腺病毒的分离鉴定及其fiber基因分析

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中国家禽 2019年第11期41卷 47-50页

作者：程龙飞刘荣昌傅光华施少华万春和陈红梅傅秋玲陈翠腾黄瑜福建省农业科学院畜牧兽医研究所福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心福建省禽病防治重点实验室福建福州350013

为确诊引起福建某番鸭场以肝脏肿大出血为特征的病原,采用病毒分离、PCR检测、动物回归试验、电镜观察、组织病理学诊断、fiber基因序列测定与分析等方法进行研究。结果显示:所采样品盲传15代后获得病毒,PCR可以扩增出鸭3型腺病毒(DAdV... 详细信息

为确诊引起福建某番鸭场以肝脏肿大出血为特征的病原,采用病毒分离、PCR检测、动物回归试验、电镜观察、组织病理学诊断、fiber基因序列测定与分析等方法进行研究。结果显示:所采样品盲传15代后获得病毒,PCR可以扩增出鸭3型腺病毒(DAdV-3)的特异性片段,分离病毒可引起3日龄番鸭发病死亡,死亡率为28.6%。人工感染死亡鸭的肝脏超薄切片呈现大量晶格状排列的典型禽腺病毒颗粒,肝脏的组织病理学以'包涵体肝炎'病变为特征。其fiber基因与已报道的DAdV-3毒株核苷酸同源性均为100%。以上结果证实分离的病原为DAdV-3。本试验为DAdV-3的诊断提供了科学依据。

关键词：鸭3型腺病毒分离鉴定 fiber基因

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禽源多杀性巴氏杆菌拓扑异构酶基因突变与耐恩诺沙星的相关性

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中国家禽 2019年第17期41卷 61-63页

作者：程龙飞刘荣昌陈红梅万春和傅光华施少华傅秋玲陈翠腾黄瑜福建省农业科学院畜牧兽医研究所福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心福建省禽病防治重点实验室福建福州350013

为探讨gyrA和parC基因的突变与禽源多杀性巴氏杆菌耐氟喹诺酮类药的相关性,采用微量稀释法测定84株临床分离菌对恩诺沙星的敏感性,PCR扩增其gyrA和parC基因并测序,分析基因编码的氨基酸序列与耐药表型的关系发现,GyrA发生单点突变(S94→... 详细信息

为探讨gyrA和parC基因的突变与禽源多杀性巴氏杆菌耐氟喹诺酮类药的相关性,采用微量稀释法测定84株临床分离菌对恩诺沙星的敏感性,PCR扩增其gyrA和parC基因并测序,分析基因编码的氨基酸序列与耐药表型的关系发现,GyrA发生单点突变(S94→I或S94→R)时,细菌对恩诺沙星的耐受性明显提高,发生双点突变(S94→I和D98→N),细菌则必然获得对恩诺沙星的耐药性。ParC发生单点突变(S84→L)时,细菌对恩诺沙星的耐受性也提高。ParC的变异能与GyrA的变异起协同作用,共同提高细菌对恩诺沙星的耐受性。这些结果为今后以gyrA和parC基因为靶位,建立快速鉴定禽源多杀性巴氏杆菌对氟喹诺酮类药耐药性的方法提供理论依据。

关键词：禽多杀性巴氏杆菌拓扑异构酶基因突变氟喹诺酮耐药

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鹅圆环病毒JX1株ORF3基因序列分析

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福建畜牧兽医 2020年第6期42卷 1-5页

作者：万春和黄瑜福建省农业科学院畜牧兽医研究所/福建省禽病防治重点实验室/福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心福州350013 龙岩学院/预防兽医学与生物技术福建省高校重点实验室福建龙岩364012

为明确鹅圆环病毒(Goose circovirus,GoCV)ORF3基因特征,本研究通过对朗德鹅源GoCV代表株(JX1株)基因组分析发现,JX1株ORF3基因全长为300 bp,编码99个氨基酸,未发现典型的核定位信号。所编码ORF3蛋白理论等电点为8.84、不稳定指数为80.... 详细信息

为明确鹅圆环病毒(Goose circovirus,GoCV)ORF3基因特征,本研究通过对朗德鹅源GoCV代表株(JX1株)基因组分析发现,JX1株ORF3基因全长为300 bp,编码99个氨基酸,未发现典型的核定位信号。所编码ORF3蛋白理论等电点为8.84、不稳定指数为80.95,为不稳定蛋白;脂肪系数为89.70;总平均疏水性指数为-0.472。ORF3基因核苷酸同源性分析比较发现,JX1株与yk1株(AY633653)、yk3株(DQ192280)核苷酸同源性最高,均为100%;与DG1株(KT808650)的核苷酸同源性最低,仅为89.0%。ORF3基因遗传进化分析发现,ORF3基因的进化频率并不完全与GoCV全基因组一致,ORF3基因在遗传进化上表现出明显的地域性,但不表现出时间性。本研究首次对GoCV ORF3基因特征进行分析探讨,为后续开展GoCV ORF3基因生物学功能研究奠定基础。

关键词：鹅圆环病毒 ORF3基因序列分析

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禽源多杀性巴氏杆菌耐药性分析及氟苯尼考耐药基因floR分布

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畜牧与兽医 2019年第3期51卷 93-96页

作者：陈红梅程龙飞邓辉刘荣昌傅光华施少华万春和傅秋玲郑庆礼白丁平黄小红黄瑜福建省农业科学院畜牧兽医研究所福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心/福建省禽病防治重点实验室福建福州350013 福建农林大学中西兽医结合与动物保健福建省高校重点实验室福建福州350002

为了解禽源多杀性巴氏杆菌的药物敏感性及氟苯尼考的耐药基因的分布特征,采用琼脂二倍稀释法,对分离自福建、广东和江西等南方数省部分地区113株禽源多杀性巴氏杆菌进行9种抗生素的耐药性分析,并应用PCR方法检测氟苯尼考耐药基因floR的... 详细信息

为了解禽源多杀性巴氏杆菌的药物敏感性及氟苯尼考的耐药基因的分布特征,采用琼脂二倍稀释法,对分离自福建、广东和江西等南方数省部分地区113株禽源多杀性巴氏杆菌进行9种抗生素的耐药性分析,并应用PCR方法检测氟苯尼考耐药基因floR的分布情况。结果显示:上述菌株对四环素表现高水平耐药,耐药率为65.49%(74/113);对链霉素、甲氧苄啶/磺胺甲噁唑、氟苯尼考、卡那霉素与恩诺沙星表现中等水平耐药,耐药率分别是43.36%(49/113)、39.82%(45/113)、27.43%(31/113)、25.66%(29/113)与24.78%(28/113);对氨苄西林、头孢噻呋与头孢克洛较为敏感,耐药率分别为4.42%(5/113),2.65%(3/113)与1.77%(2/113);其中52.21%(59/113)菌株能耐受3类及3类以上的抗菌药物;氟苯尼考耐药基因floR的检出率为64.04%(72/113),且所有氟苯尼考耐药菌株均含有floR基因。结论:113株禽源多杀性巴氏杆菌存在多重耐药现象,且floR耐药基因较为流行。本研究结果为上述地区针对禽源多杀性巴氏杆菌临床用药提供科学依据。

关键词：多杀性巴氏杆菌耐药性耐药基因 floR基因

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鸭源多杀性巴氏杆菌对磺胺类药物的耐药性检测及耐药基因分析

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中国畜牧兽医 2019年第1期46卷 223-230页

作者：陈红梅程龙飞邓辉刘荣昌傅光华施少华傅秋玲万春和郑庆礼黄瑜黄小红福建农林大学生命科学学院福州350002 福建省农业科学院畜牧兽医研究所福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心福建省禽病防治重点实验室福州350013 福建农林大学动物科学学院中西兽医结合与动物保健福建省高校重点实验室福州350002

为明确鸭源多杀性巴氏杆菌对磺胺类药物的耐药性及耐药基因的分布特征,试验采用琼脂二倍稀释法对分离自福建、广东和江西等地的89株鸭源多杀性巴氏杆菌进行甲氧苄啶/磺胺甲噁唑的耐受性检测,用PCR法检测各耐药菌株的磺胺类耐药基因(sul1... 详细信息

为明确鸭源多杀性巴氏杆菌对磺胺类药物的耐药性及耐药基因的分布特征,试验采用琼脂二倍稀释法对分离自福建、广东和江西等地的89株鸭源多杀性巴氏杆菌进行甲氧苄啶/磺胺甲噁唑的耐受性检测,用PCR法检测各耐药菌株的磺胺类耐药基因(sul1、sul2和sul3),并利用多位点序列分型(MLST)分析耐药菌株间的亲缘关系。结果显示,33株鸭源多杀性巴氏杆菌对甲氧苄啶/磺胺甲噁唑耐受,耐药率为37.1%(33/89);在耐药菌株中,sul1、sul2和sul3基因检出率分别为100%(33/33)、97.0%(32/33)和21.2%(7/33),其中sul1和sul2基因同时检出率为97.0%(32/33),sul1、sul2和sul3基因同时检出率为21.2%(7/33);所有耐药菌株均属于ST129型。以上结果表明,鸭源多杀性巴氏杆菌对磺胺类药物具有一定的耐药性,其中的耐药菌株都属于同一序列型ST129,均携带有sul1耐药基因,且绝大多数耐药菌株同时携带sul1与sul2两种耐药基因,提示在福建、广东和江西等地需慎用磺胺类药物来防治该细菌的感染。

关键词：多杀性巴氏杆菌磺胺类药物多位点序列分型 sul1基因 sul2基因 sul3基因

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樱桃谷鸭源鹅出血性多瘤病毒(GHPV)全基因组克隆与分析

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农业生物技术学报 2018年第8期26卷 1410-1418页

作者：万春和陈翠腾刘荣昌程龙飞施少华傅光华陈红梅傅秋玲黄瑜福建省农业科学院畜牧兽医研究所/福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心/福建省禽病防治重点实验室

鹅出血性多瘤病毒(Goose hemorrhagic polyomavirus,GHPV)为近年来我国鸭群新发病原。为明确我国鸭源GHPV基因组特征,本研究利用分段PCR扩增技术克隆获得樱桃谷鸭(Anas platyrhynchos domestica)源GHPV(FJ201601株)全基因组序列,并对其... 详细信息

鹅出血性多瘤病毒(Goose hemorrhagic polyomavirus,GHPV)为近年来我国鸭群新发病原。为明确我国鸭源GHPV基因组特征,本研究利用分段PCR扩增技术克隆获得樱桃谷鸭(Anas platyrhynchos domestica)源GHPV(FJ201601株)全基因组序列,并对其进行核苷酸同源性比较和遗传进化分析。结果表明,克隆的GHPV(FJ201601株)全基因组序列长为5 254 bp(Gen Bank登录号MG544856),(G+C)%含量为48.01%,编码的6个主要功能基因(ORF-X,VP2,VP3,VP1,Large T和Small T)长度分别为510、981、654、1062、1 911和483 bp。核苷酸同源性分析表明,FJ201601株和其他不同地区、不同宿主来源GHPV相互之间基因组核苷酸同源性较高(99.7%以上);其6个主要功能基因和其他不同地区、不同宿主来源GHPV相应基因的核苷酸(99.4%以上)和氨基酸同源性(98.2%以上)均极高。从全基因组及其编码的6个主要功能基因遗传进化关系可见,GHPV各分离株在基因组上亲缘关系较近,6个主要功能基因在遗传进化上差异不大,但北京鸭源GHPV和樱桃谷鸭源GHPV在遗传进化上仍存在细微差别,且不同宿主(多品种鸭和鹅)源GHPV在遗传进化上不存在宿主特异性。本研究丰富了GHPV分子流行病学数据,明确了GHPV基因组分子特征,为后续开展GHPV相关研究提供参考。

关键词：鹅出血性多瘤病毒(GHPV) 樱桃谷鸭源基因组序列分析遗传进化

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