检索结果-内蒙古大学图书馆

中华结核和呼吸杂志 2003年第2期26卷 88-92页

作者：刘爱华邓鹏姜勇第一军医大学南方医院呼吸科广州510515 第一军医大学病理生理学教研室和全军休克微循环重点实验室

目的　为了研究肿瘤坏死因子α(TNF α)诱导肺癌细胞凋亡的分子机制 ,寻找肺癌基因治疗的新方法。方法　建立TNF α诱导LA795肺腺癌细胞凋亡的细胞模型 ;使用人胚肾 2 93包装细胞制备丝裂原活化蛋白激酶激酶 6 (mitogen activatedprotei... 详细信息

目的　为了研究肿瘤坏死因子α(TNF α)诱导肺癌细胞凋亡的分子机制 ,寻找肺癌基因治疗的新方法。方法　建立TNF α诱导LA795肺腺癌细胞凋亡的细胞模型 ;使用人胚肾 2 93包装细胞制备丝裂原活化蛋白激酶激酶 6 (mitogen activatedproteinkinasekinase 6 ,MKK6 )及其结构活性和无活性突变体的重组腺病毒 ;使用激酶活性测定法检测细胞内MKK6的激酶活性。结果　TNF α刺激可明显诱导LA795肺腺癌细胞MKK6激活 ;用TNF α刺激肺腺癌细胞可明显诱导细胞凋亡 ;MKK6结构活性突变体也可明显诱导LA795细胞凋亡 ;而MKK6无活性突变体可明显抑制TNF α诱导的LA795细胞凋亡。结论　TNF α诱导LA795肺腺癌细胞凋亡是通过MKK6发挥作用的。

关键词：肿瘤坏死因子α 丝裂原活化蛋白激酶肺腺癌细胞凋亡

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带Tat标记质粒载体的构建及其转导融合蛋白进入细胞的研究

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中国生物化学与分子生物学报 2003年第3期19卷 354-358页

作者：孙学刚宋革刘靖华李红乐邢飞跃张丽华秦清和姜勇第一军医大学病理生理学教研室和全军休克微循环重点实验室广州510515

采用点突变技术构建了带6×His、Tat和Flag多个标记的pET-HTF的质粒载体,利用基因重组技术构建pET-HTF-EGFP融合蛋白载体.酶切和DNA测序证明,所构建的pET-HTF和pET-HTF-EGFP载体正确.BL21(DE3)表达融合蛋白,用Ni2+分离柱纯化His-Tat... 详细信息

采用点突变技术构建了带6×His、Tat和Flag多个标记的pET-HTF的质粒载体,利用基因重组技术构建pET-HTF-EGFP融合蛋白载体.酶切和DNA测序证明,所构建的pET-HTF和pET-HTF-EGFP载体正确.BL21(DE3)表达融合蛋白,用Ni2+分离柱纯化His-Tat-Flag-EGFP蛋白,并加入培养的NIH3T3细胞.荧光显微镜观察显示,His-Tat-Flag-EGFP融合蛋白进入细胞.带His、Tat和Flag标记的质粒载体pET-14b-HTF表达的融合蛋白能够进入细胞,该载体为进行蛋白质功能研究和基因治疗研究提供了一个重要工具.

关键词： Tat 蛋白转导增强型绿色荧光蛋白

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人GST-AWP1融合蛋白的原核表达及其抗体制备

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中国生物化学与分子生物学报 2003年第2期19卷 168-172页

作者：莫永炎刘亚伟王静珍邓鹏秦清和杨志刚姜勇第一军医大学病理生理学教研室和全军休克微循环重点实验室广州510515

为进一步研究人的一新蛋白———蛋白激酶C相关激酶 1相关蛋白 (AWP1)的结构、功能及与其相互作用的蛋白而进行GST AWP融合蛋白表达载体的构建、原核表达、纯化及其抗体的制备 .采用逆转录PCR(RT PCR)法从人ECV30 4内皮细胞中扩增AWP1c... 详细信息

为进一步研究人的一新蛋白———蛋白激酶C相关激酶 1相关蛋白 (AWP1)的结构、功能及与其相互作用的蛋白而进行GST AWP融合蛋白表达载体的构建、原核表达、纯化及其抗体的制备 .采用逆转录PCR(RT PCR)法从人ECV30 4内皮细胞中扩增AWP1cDNA编码区 ,并将其重组于谷胱甘肽硫转移酶 (GST)融合蛋白表达质粒pGEX KG中 .经酶切、序列鉴定分析后 ,用该重组质粒转化大肠杆菌BL2 1,并经异丙基 β D 硫代半乳糖苷 (IPTG)诱导产生GST AWP1融合蛋白 ,继而纯化获得了分子量约 5 6kD的融合蛋白 .将此融合蛋白免疫新西兰兔 ,经ELISA和Western印迹检测获得了效价高、免疫活性强的兔抗人多克隆抗体 .结果表明成功构建了GST AWP1融合蛋白表达载体 ,在大肠杆菌高效表达了GST AWP1融合蛋白 ,并获得高效多抗。

关键词：信号传导分子蛋白激酶C相关激酶1相关蛋白原核表达制备 GST-AWP1融合蛋白多克隆抗体

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用T7噬菌体展示筛选系统筛选与p38相结合的蛋白

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第一军医大学学报 2003年第11期23卷 1131-1133页

作者：李志杰刘靖华龚小卫秦清和黄浩邓鹏王静珍孙学刚赵善超刘亚伟赵克森姜勇第一军医大学病理生理学教研室和全军休克微循环重点实验室广东广州510515

目的用T7噬菌体筛选系统筛选与重要信号分子p38 MAPK结合的蛋白。方法以p38 MAPK为靶蛋白,分别用不同的介质(ELISA平板和Ni-NTA亲和树脂)筛选T7人肝和人肺cDNA文库。结果选择86个第4轮筛选后的洗脱噬菌体单个噬斑克隆,经EDTA处理后利用... 详细信息

目的用T7噬菌体筛选系统筛选与重要信号分子p38 MAPK结合的蛋白。方法以p38 MAPK为靶蛋白,分别用不同的介质(ELISA平板和Ni-NTA亲和树脂)筛选T7人肝和人肺cDNA文库。结果选择86个第4轮筛选后的洗脱噬菌体单个噬斑克隆,经EDTA处理后利用特异性PCR引物扩增插入片断,回收PCR产物并进行测序,将所得到的序列用BLAST软件搜索GenBank中的同源序列,得到了46个编码蛋白的序列。结论T7噬菌体展示筛选系统筛选新的结合蛋白简单、快速、有效。

关键词： T7噬菌体筛选 p38 结合蛋白靶蛋白

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iNOS红色荧光蛋白报告基因载体的构建及其在细胞中的表达

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中国病理生理杂志 2003年第12期19卷 1709-1712页

作者：刘志锋阚文宏秦清和邓鹏王静珍姜勇第一军医大学病理生理学教研室和全军休克微循环重点实验室广东广州510515

目的:构建iNOS启动子驱动的红色荧光蛋白报告基因载体,为研究细胞内iNOS的基因表达调控和相关的信号转导机制提供重要工具.方法:采用基因重组技术构建了含iNOS启动子区的红色荧光蛋白报告基因载体pDsRed1-1-iNOSp;用脂质体瞬时转染NIH3T... 详细信息

目的:构建iNOS启动子驱动的红色荧光蛋白报告基因载体,为研究细胞内iNOS的基因表达调控和相关的信号转导机制提供重要工具.方法:采用基因重组技术构建了含iNOS启动子区的红色荧光蛋白报告基因载体pDsRed1-1-iNOSp;用脂质体瞬时转染NIH3T3细胞,观察iNOS启动子对脂多糖(LPS)刺激的反应.结果:酶切和DNA测序证明所构建的红色荧光蛋白报告基因载体是正确的;该表达载体在NIH3T3细胞静息状态下表达水平很低,经LPS刺激后,在荧光显微镜下可看到高亮度的红色荧光.结论:所构建的iNOS启动子驱动的红色荧光蛋白报告基因载体是正确的,对生理相关刺激有很好的反应,可有效地用于iNOS基因表达信号调控机制的研究.

关键词：一氧化氮合酶红色荧光蛋白基因,调节基因,报告

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BDNF重组腺病毒的构建及在大鼠骨髓间质干细胞的表达

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中国病理生理杂志 2003年第4期19卷 438-442,T001页

作者：李红乐李浩威邢飞跃孙学刚邓宇斌张秀明姜勇李树浓中山大学中山医学院病理生理学教研室广东广州510080 第一军医大学病理生理学教研室和全军休克微循环重点实验室广东广州510515

目的 :利用大肠杆菌细菌内同源重组构建带有增强型绿色荧光蛋白 (EGFP)报告基因的脑源性神经营养因子前体 (proBDNF)和脑源性神经营养因子 (BDNF)重组腺病毒并在大鼠骨髓间质干细胞 (rMSC)高效表达。方法 :采用两步亚克隆的方法将proBDN... 详细信息

目的 :利用大肠杆菌细菌内同源重组构建带有增强型绿色荧光蛋白 (EGFP)报告基因的脑源性神经营养因子前体 (proBDNF)和脑源性神经营养因子 (BDNF)重组腺病毒并在大鼠骨髓间质干细胞 (rMSC)高效表达。方法 :采用两步亚克隆的方法将proBDNF和BDNF构建入带有EGFP表达盒的腺病毒穿梭质粒pAdTrack -CMV中 ,形成转移载体pAdTrack -proBDNF和pAdTrack -BDNF ,采用化学转化法在大肠杆菌BJ5 183内与腺病毒骨架质粒pAdEasy- 1同源重组 ,得到重组腺病毒载体pAd -proBDNF和pAd -BDNF ;转染 2 93细胞 ,包装成重组病毒颗粒 ;将重组病毒上清感染rMSC ,用荧光显微镜下观察和Western -blotting鉴定重组病毒在rMSC表达 ;用Ad -proBDNF和Ad -BDNF感染的rMSC在体外诱导向神经样细胞分化 ;用Ad -proBDNF和Ad -BDNF的感染的rMSC接种于裸鼠肌肉内 ,两周后荧光显微镜下直接观察。结果 :成功地构建了proBDNF和BDNF重组腺病毒载体并制备出高滴度重组病毒 ,重组病毒能在体外培养的rMSC高效表达并不影响其分化潜能 ,体内移植实验表明Ad -proBDNF和Ad -BDNF感染的rMSC能在体内表达。结论 :重组腺病毒具有较高的介导proBDNF和BDNF基因表达于rMSC的效率 ,带有报告基因EGFP的Ad -proBDNF和Ad -BDNF感染的rMSC可以用于体内移植实验。

关键词： BDNF 重组腺病毒构建大鼠骨髓间质干细胞表达增强型绿色荧光蛋白基因融合脑源性神经营养因子

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人Toll样受体4胞浆内段融合蛋白表达载体的构建与表达

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中国危重病急救医学 2003年第3期15卷 163-166页

作者：刘靖华孙学刚李志杰秦清和龚小卫邓鹏刘亚伟王静珍赵克森姜勇第一军医大学病理生理学教研室和全军休克微循环重点实验室广东广州510515

目的 :构建人 Toll样受体 4胞浆内段 ( h TL R4C) His融合蛋白表达载体并在原核表达与纯化 ,以研究其功能及鉴定与其相互作用的蛋白。方法 :采用 PCR方法扩增 h TL R4基因编码区的胞浆内段 ,并将其重组于 p ET Dsb A2 .0载体中。重组质... 详细信息

目的 :构建人 Toll样受体 4胞浆内段 ( h TL R4C) His融合蛋白表达载体并在原核表达与纯化 ,以研究其功能及鉴定与其相互作用的蛋白。方法 :采用 PCR方法扩增 h TL R4基因编码区的胞浆内段 ,并将其重组于 p ET Dsb A2 .0载体中。重组质粒经酶切、序列鉴定分析后 ,转化大肠杆菌 BL 2 1( DE3)。结果 :用异丙基β D硫代半乳糖 ( IPTG)诱导产生 h TL R4胞浆内段的 His Dsb A融合蛋白 ,继而纯化获得了分子量约 42 kd的融合蛋白。结论 :本研究成功地构建了 h TL R4胞浆内段融合蛋白表达载体并获得高效表达 ,为进一步研究提供了重要的实验材料。

关键词： Toll样受体融合蛋白蛋白表达

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腺病毒介导的EGFP基因在大鼠骨髓间质干细胞中的高效表达

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中国病理生理杂志 2003年第3期19卷 293-296,T002页

作者：李红乐邢飞跃孙学刚曹永宽宋革张秀明姜勇李树浓中山大学中山医学院病理生理学教研室广东广州510080 第一军医大学病理生理学教研室和全军休克微循环重点实验室广东广州510515

目的 :研究复制缺陷型腺病毒感染骨髓间质干细胞介导外源基因表达的可行性及感染效率。方法 :在体外低密度扩增大鼠骨髓间质干细胞 (rMSC) ,用细菌同源重组法构建巨细胞病毒 (CMV)驱动的增强型绿色荧光蛋白 (EGFP)报告基因腺病毒载体 (p... 详细信息

目的 :研究复制缺陷型腺病毒感染骨髓间质干细胞介导外源基因表达的可行性及感染效率。方法 :在体外低密度扩增大鼠骨髓间质干细胞 (rMSC) ,用细菌同源重组法构建巨细胞病毒 (CMV)驱动的增强型绿色荧光蛋白 (EGFP)报告基因腺病毒载体 (pAd -EGFP) ,用 2 93包装细胞制备腺病毒 ,用EGFP重组腺病毒感染rMSC ,观察重组腺病毒携带基因在MSC中的感染和表达情况 ,用细胞计数法和流式细胞仪分析感染效率。用血清撤离加入 β -巯基乙醇诱导Ad -EGFP感染的rMSC向神经样细胞定向分化。结果 :Ad -EGFP可高效感染rMSC ,感染率为 (3 6±2 ) % ,而脂质体法转染质粒pTrack -GFP在rMSC转染效率非常低且不易成功 ;Ad -EGFP感染后的不同扩增代数的rMSC在受到 β -巯基乙醇的诱导分化后在荧光显微镜下呈典型的突触形式。免疫组化鉴定发现这些诱导细胞表达神经元特异烯醇化酶 (NSE) ,表明腺病毒介导外源基因转染后rMSC仍具有分化为神经样细胞的潜能。结论 :腺病毒载体具有较高的介导外源基因表达于rMSC的效率。

关键词： EGFP基因大鼠骨髓间质干细胞腺病毒感染

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晚期糖基化终产物受体的结构和功能

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生理科学进展 2003年第1期34卷 71-73页

作者：赵善超侯凡凡姜勇第一军医大学南方医院肾内科和中国人民解放军肾脏病研究所第一军医大学病理生理学教研室和全军休克微循环重点实验室广州510515

晚期糖基化终产物受体 (RAGE)是一种膜蛋白 ,属于免疫球蛋白家族 ,由 4 0 0多个氨基酸组成 ,分子量为 35kD ,分胞外段、跨膜段和胞内段 ,在单核巨噬细胞、血管内皮细胞、肾系膜细胞、神经细胞及平滑肌细胞等细胞中普遍表达。RAGE作为信... 详细信息

晚期糖基化终产物受体 (RAGE)是一种膜蛋白 ,属于免疫球蛋白家族 ,由 4 0 0多个氨基酸组成 ,分子量为 35kD ,分胞外段、跨膜段和胞内段 ,在单核巨噬细胞、血管内皮细胞、肾系膜细胞、神经细胞及平滑肌细胞等细胞中普遍表达。RAGE作为信号转导受体介导晚期糖基化终产物 (AGE)和其配体在细胞表面结合 ,激活细胞内多种信号转导机制 ,在糖尿病慢性并发症、透析相关性淀粉样变 (DRA)、阿尔采末病 (AD)、动脉粥样硬化等疾病发生中起重要作用。对RAGE结构和功能的认识可能为这些疾病的防治提供新的靶位。

关键词：晚期糖基化终产物受体结构-功能研究信号转导

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人His-AWP1融合蛋白表达载体的构建及其在原核生物的表达

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中华神经医学杂志 2003年第2期2卷 123-125,144页

作者：莫永炎曹永宽刘亚伟龚小卫姜勇第一军医大学病理生理学教研室全军休克微循环重点实验室广东广州510515

目的获取人His-AWP1融合蛋白,为下阶段深入研究AWP1的结构、功能及筛取与其相互作用的蛋白打下基础方法应用逆转录聚合酶链反府(RT-PCR)法从人ECV304内皮细胞系中克隆AWP1 cDNA,并将其重组于能表达6个组氨酸残基的原核表达质粒DET-14... 详细信息

目的获取人His-AWP1融合蛋白,为下阶段深入研究AWP1的结构、功能及筛取与其相互作用的蛋白打下基础方法应用逆转录聚合酶链反府(RT-PCR)法从人ECV304内皮细胞系中克隆AWP1 cDNA,并将其重组于能表达6个组氨酸残基的原核表达质粒DET-14b中。经酶节、序列鉴定,选择正确重组克隆,将其质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,用Ni2+-NTA His柱纯化和SDS-PAGE分离蛋门。结果克隆到一个627 bp的AWP1 cDNA片段.重组质粒目的DNA测序正确.纯化出了一个分子量约为38 kD的融合蛋白。结论用基因工程方法在原核细胞表达并成功纯化出His-AWP融合蛋白。

关键词： ECV304细胞 AWP1 His-融合蛋白原核生物表达

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