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第九届全国免疫学学术大会

作者：陈涛涌俞宙杨明金曹雪涛医学免疫学国家重点实验室暨第二军医大学免疫学研究所浙江大学免疫学研究所

研究背景:机体通过模式识别受体(PRR)识别微生物的多糖、蛋白和核苷酸等成分,产生炎症因子和Ⅰ型干扰素(IFNα/β),发挥抗细菌或抗病毒的免疫防御功能。TBK1(TANK binding kinase 1)及其同源分子IKKε可以活化IRF3、IRF7调节IFNα/β的... 详细信息

研究背景:机体通过模式识别受体(PRR)识别微生物的多糖、蛋白和核苷酸等成分,产生炎症因子和Ⅰ型干扰素(IFNα/β),发挥抗细菌或抗病毒的免疫防御功能。TBK1(TANK binding kinase 1)及其同源分子IKKε可以活化IRF3、IRF7调节IFNα/β的产生,在TLR、RIG-I以及dsDNA受体介导的抗感染天然免疫功能中发挥核心枢纽的作用。但是,TBK1活化的分子机制目前仍不清楚,尤其是蛋白激酶磷酸化修饰这一经典调控机制是否调节TBK1的激酶活性并调节Ⅰ型干扰素产生和抗病毒免疫反应还未有明确的结论。目的:探讨TBK1磷酸化修饰的关键位点并寻找磷酸化TBK1并活化TBK1的关键蛋白激酶。方法:首先采用蛋白质谱(MS)的方法分析TBK1在受到VSV病毒刺激后发生磷酸化修饰的潜在位点,然后借助于MS寻找能够与TBK1发生结合的蛋白激酶。采用点突变的方法突变MS发现的TBK1的磷酸化位点,结合IFNβ报告基因检测,验证TBK1发生功能性磷酸化修饰的位点;制备磷酸化位点特异性的单克隆抗体,验证VSV及HSV-1感染后TBK1发生磷酸化改变的位点。针对MS发现的蛋白激酶,使用siRNA的方法敲低其表达,通过q-PCR、ELISA和Western印迹的方法研究并寻找能够影响TBK1磷酸化并调节Ⅰ型干扰素产生的丝苏氨酸、酪氨酸蛋白激酶。借助于CRISPR-Cas9介导的基因组编辑技术删除相关蛋白激酶,验证其对TBK1磷酸化水平和激酶活性的影响。最后,使用体外激酶分析确认TBK1的上游蛋白激酶。结果:我们发现VSV刺激RAW264.7细胞后,TBK1在20余个丝/苏氨酸位点以及2个酪氨酸位点发生了磷酸化修饰。通过突变这些磷酸化位点结合报告基因分析,我们发现Ser93和Ryr179、Tyr185位点可能是TBK1的功能性磷酸化修饰位点。通过TBK1结合分子的MS分析,我们发现可能有20余种丝苏氨酸蛋白激酶和近10种酪氨酸蛋白激酶与TBK1的功能相关;通过siRNA敲低这些蛋白激酶,我们发现TAO3和c-Src可能是最为重要的促进TBK1磷酸化的上游蛋白激酶。TAO3敲低或者删除后,VSV和HSV-1诱导的TBK1的磷酸化(Ser72)显著下降,同时IFNα/β和水平显著降低,并且伴随TBK1激酶活性和IRF3磷酸化的降低;类似地敲低c-Src或删除c-Src的表达也可以显著抑制细胞抗病毒效应及TBK1的磷酸化和激酶活性。结论:磷酸化修饰是调节TBK1活性的重要调控机制,TAO3和c-Src可能是调节TBK1丝苏氨酸磷酸化以及酪氨酸磷酸化的关键激酶,这种经典的磷酸化调节模式可能在机体抗病毒过程中发挥关键的作用。

关键词： TBK1 磷酸化修饰蛋白激酶 I型干扰素抗病毒反应

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海藻酸钙海绵的止血作用研究

海藻酸钙海绵的止血作用研究

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全国第二届海洋与陆地多糖多肽及天然创新药物研发学术会议

作者：宗杰李佳媚李娜张俊玲刘琼何颖王庆蓉沈先荣海军医学研究所舰艇特殊环境生物效应与医学防护实验室上海海洋大学食品学院浙江中医药大学中药体外代谢实验室

目的:研究海藻酸钙海绵(CA)的止血作用的研究与体外安全性评价。方法:在体外凝血实验中,通过试管法得到海藻酸钙的最佳止血浓度(0.4 mg/m1),经冷冻干燥成海绵,通过动物体表止血实验来初探海藻酸钙的止血作用研究。在BCI(Blood Clotting ... 详细信息

目的:研究海藻酸钙海绵(CA)的止血作用的研究与体外安全性评价。方法:在体外凝血实验中,通过试管法得到海藻酸钙的最佳止血浓度(0.4 mg/m1),经冷冻干燥成海绵,通过动物体表止血实验来初探海藻酸钙的止血作用研究。在BCI(Blood Clotting Index)实验中,通过吸光值来反映海藻酸钙凝血效果。在动物体表止血实验,通过构建新西兰兔耳动脉、背部全皮层止血模型来探究其止血作用,测定止血时间以及出血量来反应海藻酸钙的止血效果。通过细胞毒性实验,采用MTT法,初步评价海藻酸钙海绵的细胞毒性。结果:海藻酸钙的BCI值为33.08±4.02明显低于阳性明胶海绵(72.05±10.48),具有显著性差异(P<0.05),在耳动脉模型中,海藻酸钙的出血量为2.85±0.14明显少于阴性医用纱布组(3.93±0.18g)与阳性明胶海绵组(2.97±0.17g),具有显著性差异(P<0.05),止血时间(320.00±3.00s)低于明胶海绵(332.30±14.20s)与医用纱布(466.50±19.10s),与纱布(NG)相比具有显著性差异(P<0.05)。在背部全皮层止血实验中,海藻酸钙的止血时间97.83±5.49s与医用纱布组101±14.71 s无明显差异,但在出血量上,海藻酸钙海绵2.66±0.43s明显低于纱布组3.81±0.73s,具备显著性差异(P<0.05),而与明胶海绵相近差异布显著。细胞毒性实验中,随着海藻酸钙海绵浸提液浓度的递减,其细胞毒性整体呈现降低,100%浓度的浸提液细胞毒性为1级,符合生物材料的安全性。结论:海藻酸钙海绵在止血作用上具备一定的优势,其原料丰富,来源广泛,止血作用明显,无细胞毒性,具备一定的市场价值与潜力。

关键词：海藻酸钙止血明胶细胞毒性

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双功能RGD-R8修饰阿霉素脂质体的制备及其体外评价

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第三军医大学学报 2014年第20期36卷 2103-2107页

作者：何笑冬舒小镭李少林重庆医科大学基础医学院放射医学教研室重庆400016

目的制备串联的RGD-R8肽修饰阿霉素(DOX)脂质体(RGD-R8-LP-DOX),对其理化性质进行表征,并研究脂质体与乳腺癌MCF-7细胞的亲和力和增殖抑制作用。方法采用薄膜分散法制备RGD-R8-LP-DOX,研究脂质体的形态、粒径、电位以及包封率;定量细胞... 详细信息

目的制备串联的RGD-R8肽修饰阿霉素(DOX)脂质体(RGD-R8-LP-DOX),对其理化性质进行表征,并研究脂质体与乳腺癌MCF-7细胞的亲和力和增殖抑制作用。方法采用薄膜分散法制备RGD-R8-LP-DOX,研究脂质体的形态、粒径、电位以及包封率;定量细胞摄取实验研究乳腺癌MCF-7细胞对RGD-R8-LP的摄取效率以及对脂质体摄取的影响因素。定性共聚焦实验观察肿瘤细胞对脂质体的摄取。MTT实验研究RGD-R8-LP-DOX对乳腺癌MCF-7细胞的细胞毒性。结果 RGD-R8-LP-DOX的粒径为(115.8±11.5)nm,电位为(23.45±4.68)mV,阿霉素的包封率为95.6%。细胞摄取实验结果显示,RGD-R8-LP在4 h摄取效率是2 h的1.75倍,差异有统计学意义(P<0.05);MCF-7细胞在与脂质体共同孵育4 h后对RGD-R8-LP的摄取效率分别是R8-LP、RGD-LP和LP的2.1倍、2.9倍和3.8倍,差异有统计学意义(P<0.01);RGD-R8-LP-DOX与乳腺癌MCF-7细胞孵育24 h后的存活率是48 h的1.8倍,差异有统计学意义(P<0.05);在给药48 h后,R8-LP-DOX、RGD-LP-DOX和LP-DOX的细胞存活率分别是RGD-R8-LP-DOX组的1.6倍、1.8倍和2.4倍,差异有统计学意义(P<0.01)。结论整合素受体特异性配体RGD和细胞穿膜肽R8串联的RGD-R8肽修饰阿霉素脂质体能够有效穿透肿瘤细胞膜进入肿瘤细胞,是一种潜在高效的乳腺癌给药系统。

关键词：整合素受体细胞穿膜肽脂质体乳腺癌

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受DNA甲基化调控的IncRNA-AY927547在原发性肝癌中的作用机制研究

受DNA甲基化调控的IncRNA-AY927547在原发性肝癌中的作用机制研究

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第十二次全国医学遗传学学术会议

作者：赵晨曦郭瀛军黄金凤孙树汉第二军医大学医学遗传学教研室

目的:研究在原发性肝癌发生过程中受DNA甲基化调控的lncRNAs对肿瘤形成的影响及其分子机制。方法:甲基化相关的lncRNAs芯片数据进行分析,筛选潜在受DNA甲基化调控异常表达的lncRNAs。通过实时定量PCR技术检测lncRNAs的表达量改变;亚硫... 详细信息

目的:研究在原发性肝癌发生过程中受DNA甲基化调控的lncRNAs对肿瘤形成的影响及其分子机制。方法:甲基化相关的lncRNAs芯片数据进行分析,筛选潜在受DNA甲基化调控异常表达的lncRNAs。通过实时定量PCR技术检测lncRNAs的表达量改变;亚硫酸氢盐修饰与甲基化测序技术检测甲基化水平改变。通过siRNA干扰及全长载体质粒的构建在细胞水平对lncRNAs进行干扰及过表达后分析肿瘤表型:利用CCK-8法检测细胞的增殖能力;Transwell小室检测细胞的迁移、侵袭能力;Annexin-FITC荧光法检测细胞凋亡。利用RNApull-down及western blot技术筛选与lncRNAs相结合的靶蛋白分子。结果:筛选出lncRNA-AY927547,其在肝癌样本中的表达量呈明显下调,且甲基化程度明显增高。干扰lncRNA-AY927547后,肝癌细胞的迁移及侵袭能力受到明显促进。过表达1ncRNA-AY927547后,肝癌细胞的迁移及侵袭能力受到明显抑制。Western blot显示与1ncRNA-AY927547正义链及反义链相结合的蛋白谱呈明显差异。结论:lncRNA-AY927547能够受到DNA甲基化的调控,在原发性肝癌的发生及转移过程中通过其结合靶蛋白发挥抑癌基因的作用,为发展表观遗传学药物治疗原发性肝癌提供了新的思路和靶向。

关键词：表观遗传学原发性肝癌 DNA甲基化长链非编码RNA

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亦正亦邪——T淋巴细胞在脊髓损伤修复中的作用

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医学争鸣 2013年第1期4卷 42-44页

作者：赵湘辉郑晶晶程鹏王键鞠躬第四军医大学基础医学院神经生物学教研室陕西西安710032

脊髓损伤作为一种高致残率的疾病,一直倍受相关研究者的广泛关注。我们将近年来有关免疫反应,主要是T淋巴细胞在脊髓损伤修复中的作用进行了文献回顾。从两种针锋相对的观点入手,结合我们自己的研究,列举了T淋巴细胞在脊髓损伤修复中的... 详细信息

脊髓损伤作为一种高致残率的疾病,一直倍受相关研究者的广泛关注。我们将近年来有关免疫反应,主要是T淋巴细胞在脊髓损伤修复中的作用进行了文献回顾。从两种针锋相对的观点入手,结合我们自己的研究,列举了T淋巴细胞在脊髓损伤修复中的主要作用,并提出可能存在的新研究方向。

关键词：脊髓损伤 T淋巴细胞治疗

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靶向抗肿瘤药物AnxB1-MLT的基因构建及诱导表达条件优化

靶向抗肿瘤药物AnxB1-MLT的基因构建及诱导表达条件优化

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第十二次全国医学遗传学学术会议

作者：王玉招颜宏利唐冠楠林恒荣章意亮孙树汉第二军医大学医学遗传学教研室

背景与目的:靶向药物治疗(targeted drug therapy)逐渐成为是目前肿瘤治疗的重要手段。近年来的研究发现,磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine,PS)是抗肿瘤治疗的重要靶点之-。膜联蛋白B1(annexin B1)是孙树汉教授克隆的一个新的膜联蛋白(A... 详细信息

背景与目的:靶向药物治疗(targeted drug therapy)逐渐成为是目前肿瘤治疗的重要手段。近年来的研究发现,磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine,PS)是抗肿瘤治疗的重要靶点之-。膜联蛋白B1(annexin B1)是孙树汉教授克隆的一个新的膜联蛋白(Annexins)亚家族成员,对PS的结合具有很高的亲和力和特异性。蜂毒肽(melittin,MLT)是蜂毒的主要成分,具有很强的抗肿瘤作用。以肿瘤内皮细胞暴露的磷脂酰丝氨酸为"靶",以AnxB1为"导向分子",以蜂毒素为"抗肿瘤分子",构建基因工程靶向抗肿瘤药物mAnxB1-MLT。方法:利用PCR重叠区延伸法连接AnxB1-MLT,融合基因克隆至pGEX5T融合表达载体和pET-28a表达载体,转染大肠杆菌,分别就IPTG浓度、利福平、表达温度等条件进行优化。结果:融合蛋白AnxB1-MLT在pET-28a表达载体中无明显表达条带。37℃条件下,pGEX-5T表达质粒中高效表达,表达产物占菌体总蛋白的40%以上;IPTG、利福平对表达影响较小,但表达产物均为包涵体,不利于纯化。在22-25℃条件下诱导表达,虽然大肠杆菌生长较慢,但表达产物均为可溶性表达,且占菌体蛋白30%以上。利用GST亲和层析柱纯化,蛋白纯度大于90%。结论:成功构建了融合表达蛋白AnxB1-MLT的表达质粒,优化了诱导表达条件,获得了重组蛋白,为进一步通过动物模型研究其靶向抗肿瘤活性奠定了基础。

关键词：膜联蛋白B1 蜂毒素靶向抗肿瘤药物

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流体静压力及雌激素共同作用对骨髓间充质干细胞成骨及成软骨分化的影响

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医用生物力学 2013年第2期28卷 201-209页

作者：赵萤张旻王安辉陈永进吴岸祯第四军医大学口腔医学院急诊与综合临床科西安710032 第四军医大学预防医学系流行病学教研室西安710032

目的观察流体静压力联合雌激素对大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)增殖、细胞骨架及成骨、成软骨向分化的影响,检测这两种刺激共同作用是否具有生物叠加效应。方法采用全骨髓贴壁分离法分离培养BMSCs,... 详细信息

目的观察流体静压力联合雌激素对大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)增殖、细胞骨架及成骨、成软骨向分化的影响,检测这两种刺激共同作用是否具有生物叠加效应。方法采用全骨髓贴壁分离法分离培养BMSCs,流式细胞仪进行BMSCs表面标志物分子鉴定。细胞分为对照组(C组)、1 nmol/L17β-雌二醇作用组(E组)、1 nmol/L雌激素受体拮抗剂TAM作用组(T组)、90 kPa压力加载1 h组(P组)、17β-雌二醇预处理12 h后再加压1 h组(P+E组)以及TAM预处理12 h后再加压1 h组(P+T组)。流式细胞仪检测各组细胞的细胞周期变化;FITC-鬼笔环肽染色后激光共聚焦显微镜下观察F-actin细胞骨架表达与重组情况;各组细胞经成骨诱导7 d和14 d后茜素红染色观察钙结节形成量、Real-time PCR检测成骨细胞标志基因Col I、ON、OPN及BSP的mRNA表达;成软骨诱导14 d和28 d后甲苯胺蓝染色检测蛋白多糖表达、Real-time PCR检测成软骨细胞标志基因Sox9、Aggrecan及ColⅡ的mRNA表达。采用SPSS 16.0对数据进行单因素方差分析,后续Dunnett t检验进行各时间点上实验组与空白对照组数据之间及各实验组之间的组间比较。结果流体静压力(90 kPa,1 h)及1 nmol/L 17β-雌二醇作用下细胞增殖能力以及细胞骨架的活性均增强,但并不具有生物整合效应。成骨诱导14 d后,钙结节形成。Real-time PCR结果显示,17β-雌二醇作用组中成骨标志基因Col I、ON、OPN及BSP的表达水平显著增加。两种刺激在成骨诱导分化7 d时均可提高标志基因的表达,具有生物协同效应,但成骨诱导14 d时两者则表现出相互拮抗的作用。成软骨诱导28 d后,甲苯胺蓝染色阳性。成软骨诱导过程中,单纯压力刺激组成软骨标志基因Sox9、Aggrecan及ColⅡ的表达显著升高,雌激素预调则削弱压力对间充质干细胞的促成软骨分化作用。结论流体静压力及雌激素仅在骨髓间充质干细胞成骨分化早期表现生物整合效应,而在增殖、细胞骨架活性方面则无此效应。在成骨分化晚期及成软骨分化中两种刺激因素表现出拮抗作用,雌激素可促成骨分化,而压力则表现为促成软骨分化的作用。

关键词：流体静压力雌激素骨髓间充质干细胞成骨成软骨细胞分化

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嗜铬细胞瘤的CT诊断与鉴别

嗜铬细胞瘤的CT诊断与鉴别

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全军第十六届放射医学大会

作者：肖健宁南方医科大学第一临床医学院医学影像系

肾上腺是嗜铬细胞瘤最常发生的部位，因此所有临床拟诊嗜铬细胞瘤的患者均应首先行肾上腺区检查。若CT、MRI检查发现单侧或双侧肾上腺较大类圆形肿块，并具有上述表现特征，结合临床症状和实验室检查，通常可作出准确的定位和定性诊断... 详细信息

肾上腺是嗜铬细胞瘤最常发生的部位，因此所有临床拟诊嗜铬细胞瘤的患者均应首先行肾上腺区检查。若CT、MRI检查发现单侧或双侧肾上腺较大类圆形肿块，并具有上述表现特征，结合临床症状和实验室检查，通常可作出准确的定位和定性诊断。当患者症状、体征和实验室检查高度提示为嗜铬细胞瘤时，若影像学检查并未发现肾上腺肿块，而于腹主动脉旁、髂血管附近、膀胱壁或纵膈等处发现肿块并具有上述表现，可提示为副神经节瘤。副神经节瘤的CT和MRI表现均不具有特异性，而与相应部位的其他肿瘤在表现上有相当程度的重叠。

关键词：嗜铬细胞瘤肾上腺电子计算机扫描鉴别诊断

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STZ诱导的2型糖尿病大鼠心肌组织TRPC7的表达上调

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心脏杂志 2014年第4期26卷 403-407页

作者：张海军崔龙彪岳原杜成常耀明史娟谢满江第四军医大学航空航天医学教育部重点实验室航空航天医学系陕西西安710032 国营长风机器厂职工医院内科甘肃兰州730070 第四军医大学人体解剖与组织胚胎学教研室陕西西安710032

目的:观察2型糖尿病(T2DM)大鼠心肌组织损伤过程中,TRPC7的表达变化。方法:以高脂饲料喂养并辅以腹腔注射小剂量链脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)来建立T2DM大鼠模型,采用蛋白印迹及免疫组化染色方法检测TRPC7在T2DM大鼠心肌组织的表达... 详细信息

目的:观察2型糖尿病(T2DM)大鼠心肌组织损伤过程中,TRPC7的表达变化。方法:以高脂饲料喂养并辅以腹腔注射小剂量链脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)来建立T2DM大鼠模型,采用蛋白印迹及免疫组化染色方法检测TRPC7在T2DM大鼠心肌组织的表达变化。结果:1T2DM大鼠造模成功且T2DM大鼠心肌组织发生损伤性变化:与正常组大鼠相比,T2DM组大鼠血糖明显升高且体重显著降低(P<0.05);T2DM组大鼠心脏体积与质量显著减小(P<0.05);T2DM组大鼠心脏质量指数(heart weight index,HWI)明显高于正常组(P<0.05);2在T2DM大鼠心肌损伤过程中TRPC7表达上调:TRPC7在正常及T2DM大鼠心肌组织中均有表达,但与正常大鼠相比,T2DM大鼠心肌组织TRPC7蛋白的表达显著增高(P<0.05)。结论:首次证实在损伤的T2DM大鼠心肌组织中,TRPC7的表达显著上调。

关键词：链脲佐菌素糖尿病心肌细胞 TRPC7 大鼠

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五倍子水提取物对人牙髓细胞碱性磷酸酶及矿化的影响

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牙体牙髓牙周病学杂志 2014年第12期24卷 692-695页

作者：卢婧徐星星李鑫贾珍李彦米修奎第四军医大学口腔医院牙体牙髓病科军事口腔医学国家重点实验室解放军第96375部队44卫生队第四军医大学口腔医院修复科军事口腔医学国家重点实验室解放军477医院口腔科

目的:观察不同浓度的五倍子水提取物对人牙髓细胞碱性磷酸酶(ALP)活性及矿化能力的影响。方法:组织块酶消化法体外培养人牙髓细胞,并分别与不同浓度的五倍子水提取物(2.5、5、10、20、40μg/m L)共同培养;于培养48 h后,采用酶组织化学... 详细信息

目的:观察不同浓度的五倍子水提取物对人牙髓细胞碱性磷酸酶(ALP)活性及矿化能力的影响。方法:组织块酶消化法体外培养人牙髓细胞,并分别与不同浓度的五倍子水提取物(2.5、5、10、20、40μg/m L)共同培养;于培养48 h后,采用酶组织化学法检测各组细胞的ALP活性。并根据ALP实验结果筛选出(10、20μg/m L)五倍子水提取物浓度组,与牙髓细胞共同培养30 d后,用Von Kossa染色法观察各组细胞的生长及矿化结节形成情况。结果:与对照组相比,2.5、5μg/m L的五倍子水提取物对人牙髓细胞的ALP活性无显著性影响(P>0.05),而浓度为10、20、40μg/m L的五倍子水提取物均可明显抑制牙髓细胞的ALP活性(P<0.05);Von Kossa染色结果显示,五倍子水提取物与人牙髓细胞共同培养30 d后,可促进其矿化结节的形成。结论:五倍子水提取物可在一定程度上改变人牙髓细胞的碱性磷酸酶活性及矿化程度。

关键词：五倍子水提取物体外培养人牙髓细胞(hDPCs) 碱性磷酸酶(ALP) 矿化

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