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幽门螺杆菌抗原特异性 CD4＋T 细胞体外扩增及其在 Th 表位筛选中的初步应用

中华微生物学和免疫学杂志 2014年第8期34卷 630-634页

作者：李晓阳郭学青李宁一陈立吴超首都医科大学附属北京朝阳医院检验科 100043 北京军区总医院263临床部检验科重庆第三军医大学医学检验系临床微生物学及免疫学教研室

目的：建立幽门螺杆菌（ Helicobacter pylori，***）抗原特异性CD4＋T细胞体外扩增方法，并在Th表位筛选中初步应用。方法从***感染阳性患者中分离外周血单个核细胞（PBMC），以重组黏附素抗原（HpaA）进行体外刺激，分别摸索不同血清... 详细信息

目的：建立幽门螺杆菌（ Helicobacter pylori，***）抗原特异性CD4＋T细胞体外扩增方法，并在Th表位筛选中初步应用。方法从***感染阳性患者中分离外周血单个核细胞（PBMC），以重组黏附素抗原（HpaA）进行体外刺激，分别摸索不同血清培养基、抗原刺激浓度、培养时间等体外扩增条件，并通过细胞内因子染色和流式细胞技术检测HpaA特异性CD4＋T细胞产生IFN-γ应答水平，从而建立***感染者抗原特异性CD4＋T淋巴细胞的体外扩增方法。同时，结合合成重叠肽技术，对抗原HpaA中可能的Th表位进行初步筛查。结果在含人AB血清的1640培养基中培养的抗原特异性CD4＋T细胞的扩增效率优于含胎牛血清的1640培养基； HpaA抗原初刺激浓度为0．2μmol/L时，抗原特异性CD4＋T细胞的比例最高；在抗原刺激浓度0．2μmol/L条件下，细胞培养9 d时出现特异性CD4＋T细胞应答，且在第15天时达到高峰值；以不同肽段对特异性CD4＋T细胞的IFN-γ应答水平检测分析中显示：针对本研究***感染个体，HpaA抗原中可能存在一个优势应答的Th细胞表位（HpaA220-237）。结论在人AB血清的1640培养基，0．2μmol/L为抗原刺激浓度，连续15 d扩增等培养条件下，在体外成功扩增出***抗原特异性CD4＋T淋巴细胞，可用于***抗原中Th表位的筛选和鉴定，为表位疫苗研究奠定实验基础。

关键词：幽门螺杆菌 CD4+T细胞表位

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《临床检验学》多元化教学的成功经验和具体行为

《临床检验学》多元化教学的成功经验和具体行为

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全国高等医学院校医学检验专业第七届临床检验基础暨血液学检验校际教学研讨会

作者：郑峻松黄辉邓均方立超第三军医大学医学检验系临床检验学教研室重庆400038

为进一步深化教学改革,强化教学管理,全面提升我校我室教学水平和本科层次人才培养质量,我室根据学校"一条主线、四项重点"的发展思路,结合校系各项教学管理措施要求,参照第三军医大学教学评估指标体系(并医学检验系具体参照... 详细信息

为进一步深化教学改革,强化教学管理,全面提升我校我室教学水平和本科层次人才培养质量,我室根据学校"一条主线、四项重点"的发展思路,结合校系各项教学管理措施要求,参照第三军医大学教学评估指标体系(并医学检验系具体参照评估指标),从教员人才队伍建设、教学方式改进、教学内容取舍、教学执行管理和教学效果评价等几方面对本教研室前期教学工作所摸索出的具体成功经验、取得的教学成果和存在不足与后期提升手段等方面作一全面系统总结,旨与校系其他教学单位交流并得到兄弟单位的评正.

关键词：高等院校临床检验学学科建设多元化教学

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低氧诱导因子-1α对骨形态发生蛋白2诱导的干细胞成软骨、成骨分化的影响

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第三军医大学学报 2014年第12期36卷 1243-1248页

作者：周年黄伟廖军义胡宁陈筱蓉梁熙司维柯杨忠易世雄凡廷旭赵辰重庆医科大学附属第一医院骨科重庆400016 重庆医科大学附属第一医院神经外科重庆400016 第三军医大学医学检验系临床血液学教研室重庆400038

目的探讨低氧通路中关键转录调控因子低氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)对骨形态发生蛋白2(bone morpho-genetic protein 2,BMP2)诱导干细胞骨、软骨分化的影响,阐明HIF-1α在干细胞成骨、软骨分化中的作用。方... 详细信息

目的探讨低氧通路中关键转录调控因子低氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)对骨形态发生蛋白2(bone morpho-genetic protein 2,BMP2)诱导干细胞骨、软骨分化的影响,阐明HIF-1α在干细胞成骨、软骨分化中的作用。方法构建相应腺病毒AdBMP2、AdHIF-1α、AdGFP,单独或共同感染干细胞,Western blot法检测成软骨、成骨分化关键转录调控因子Sox9、Runx2的表达,Real-time PCR法检测成软骨、成骨分化标志物COL2A1、aggrecan、COL1A1和ALP mRNA表达,Alcian blue、ALP及Alizarin red S染色检测软骨细胞外基质及骨基质钙盐沉积情况。进行干细胞裸鼠皮下移植,观察不同处理组形成骨块的组织结构情况,探讨HIF-1α对BMP2诱导干细胞成骨、软骨分化的影响。结果诱导分化后第1、3天,BMP2+HIF-1α组Sox9蛋白表达明显高于BMP2单独处理组,而BMP2+HIF-1α组Runx2蛋白表达明显低于BMP2单独处理组。诱导分化后第7、9天,BMP2+HIF-1α组COL2A1、aggrecan mRNA相对表达明显高于BMP2单独处理组(P<0.05),而BMP2+HIF-1α组COL1A1、ALP mRNA相对表达明显低于BMP2单独处理组(P<0.05)。Alcian blue染色发现BMP2+HIF-1α组软骨细胞外基质分泌多于BMP2单独处理组,染色更深;ALP染色发现BMP2+HIF-1α组ALP的活性弱于BMP2单独处理组;茜素红染色发现BMP2+HIF-1α组较BMP2单独处理组骨基质钙盐沉积更少;体内试验组织学观察见BMP2+HIF-1α组软骨成分更多,骨化不明显,BMP2单独处理组软骨成分少,软骨内骨化更明显。结论HIF-1α明显增强了BMP2诱导的干细胞成软骨分化,抑制了成骨分化及软骨内骨化,维持了软骨分化表型。

关键词：低氧诱导因子-1α 骨形态发生蛋白2 干细胞软骨分化成骨分化

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MicroRNAs在胰腺癌研究中的新进展

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国际检验医学杂志 2014年第13期35卷 1755-1758页

作者：杨增俊陈安第三军医大学学员旅学员四营重庆400038 第三军医大学西南医院医学检验系临床生物化学教研室重庆400038

胰腺癌是目前恶性程度最高的肿瘤之一，其所致死亡在世界范围内居肿瘤死因的第4位，是所有消化系统肿瘤中第2位最常见的恶性肿瘤［1］。由于起病隐匿、缺乏可靠的早期诊断标志物，大多数胰腺癌患者发现时已处于晚期，少有手术切除机会... 详细信息

胰腺癌是目前恶性程度最高的肿瘤之一，其所致死亡在世界范围内居肿瘤死因的第4位，是所有消化系统肿瘤中第2位最常见的恶性肿瘤［1］。由于起病隐匿、缺乏可靠的早期诊断标志物，大多数胰腺癌患者发现时已处于晚期，少有手术切除机会，且预后很差，5年生存率小于5％［2］。因此，寻找胰腺癌特异性的早期诊断标志物显得尤为迫切。miRNAs 是一类由17～25个核苷酸组成的、内源性单链非编码 RNA 分子。miR-NAs 不编码蛋白，而是通过与 mRNA 的3′端非编码区（3′UTR）的靶向结合，参与基因功能的调节［3］。大量的研究表明，miRNAs 与肿瘤的进展密切相关，miRNAs 通过基因表达调控影响着细胞增殖、分化、凋亡、炎性反应、应激反应等病理生理过程，是与肿瘤发生、发展密切相关的新的调节分子家族，在肿瘤的诊断和治疗中起着重要的作用。最近的研究发现，胰腺癌组织、细胞株、癌前病变、血浆中均存在 miRNAs 表达谱的异常［4］，提示 miRNAs 可能在胰腺癌的发生、发展机制研究、早期诊断、药物耐药性评估、预后判断等方面具有重要价值。本文就相关的研究进展作一综述。

关键词：胰腺癌 miRNAs 肿瘤标志物诊断与治疗

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抗人心脏型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体的制备、表位鉴定及其应用

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细胞与分子免疫学杂志 2013年第6期29卷 620-624页

作者：韩起丛珊易维京陈莎梁文斌陈安胡川闽李淑慧第三军医大学医学检验系临床生物化学教研室重庆400038

目的制备抗人心脏型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)单克隆抗体(mAb),鉴定其基本特性并通过配对检测临床样本血清,对已配对的mAb进行表位鉴定。方法通过已制备的H-FABP抗原和合成肽免疫BALB/c小鼠,常规融合筛选后进行抗体亚型鉴定、效价和亲和... 详细信息

目的制备抗人心脏型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)单克隆抗体(mAb),鉴定其基本特性并通过配对检测临床样本血清,对已配对的mAb进行表位鉴定。方法通过已制备的H-FABP抗原和合成肽免疫BALB/c小鼠,常规融合筛选后进行抗体亚型鉴定、效价和亲和力检测,纯化mAb后通过间接ELISA、Western blot法对mAb进行特异性检测;将获得的mAb分别作为捕获和检测抗体,经过配对建立检测重组H-FABP的ELISA体系,并初步用于临床血清检测;采用生物信息学分析设计2段H-FABP表位,通过原核表达获得其短肽并纯化,通过Western blot法对配对的mAb进行表位鉴定。结果成功获得4株抗H-FABP特异性mAb,亚类分别为IgG2a和IgG2b,抗体效价为1∶51 200～1∶1024 000,亲和力最高可达到9.02×109mol/L;经Western blot法和间接ELISA鉴定均能够特异检测重组H-FABP蛋白,经过配对发现mAb 3-H5和1-F10能够检测重组H-FABP,并在其临床血清样本检测中发现正常组和急性心梗组之间H-FABP水平具有显著性统计学差异;通过表位鉴定发现未知表位的mAb 1-F10能够特异识别位点为H-FABP的第86到第133位氨基酸。结论制备了4株高特异性和高亲和力的抗H-FABPmAb,成功建立了检测临床样本血清中的ELISA体系,并对其表位进行了分析鉴定。

关键词： H-FABP 单克隆抗体 ELSIA体系检测表位鉴定

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类鼻疽伯克霍尔德氏菌感染RAW264.7细胞模型的建立

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中国人兽共患病学报 2013年第3期29卷 282-285页

作者：方瑶潘静李倩顾江唐彬张卫军毛旭虎第三军医大学医学检验系临床微生物教研室重庆400038 第三军医大学医学检验系临床血液教研室重庆400038

目的建立类鼻疽伯克霍尔德氏菌感染小鼠巨噬细胞RAW264.7的细胞模型,为进一步研究其致病机制奠定基础。方法摸索类鼻疽伯克霍尔德氏菌培养条件、构建模型的感染条件(e.g.感染复数,感染时间),通过吉姆萨染色、透射电镜、活细胞工作站动... 详细信息

目的建立类鼻疽伯克霍尔德氏菌感染小鼠巨噬细胞RAW264.7的细胞模型,为进一步研究其致病机制奠定基础。方法摸索类鼻疽伯克霍尔德氏菌培养条件、构建模型的感染条件(e.g.感染复数,感染时间),通过吉姆萨染色、透射电镜、活细胞工作站动态观察等确证胞内感染和宿主细胞的形态变化,分析病原菌侵袭率、胞内复制率和宿主反应性来评价该模型中病原菌侵入RAW264.7特点和病理损伤类型。结果确定了类鼻疽伯克霍尔德氏菌的一般培养条件,感染复数MOI=100感染宿主细胞,170g离心5min后37℃共孵1h以利于细菌侵入胞内,含250μg/ml卡那霉素的DMEM-10培养以杀死胞外病原菌。形态观察,类鼻疽伯克霍尔德氏菌感染后最早8h可观察到异物多核巨细胞(MNGC),RAW264.7细胞伸出伪足,相互融合。感染初期(<3h)TNF-α升高较快,9h后则下降至低值,直至感染后期(15～24h)再次升高。结论成功构建类鼻疽伯克霍尔德氏菌胞内感染模型,拟为进一步研究其致病机制提供了条件。

关键词：类鼻疽伯克霍尔德氏菌小鼠巨噬细胞(RAW264 7) 细胞模型

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MLL在HOXA10表达调控中作用的实验研究

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第三军医大学学报 2013年第17期35卷 1797-1800页

作者：姚婕方立超郑峻松第三军医大学医学检验系临床检验学教研室重庆400038

目的通过研究在急性髓性白血病细胞中HOXA10表达调控机制,探讨HOXA10调控作为AML防治新靶点的可能性。方法以不同剂量雌二醇(E2)在不同时间点刺激急性粒细胞白血病细胞株(HL-60),以不刺激的HL-60细胞作参照应用RT-PCR检测HOXA10基因表... 详细信息

目的通过研究在急性髓性白血病细胞中HOXA10表达调控机制,探讨HOXA10调控作为AML防治新靶点的可能性。方法以不同剂量雌二醇(E2)在不同时间点刺激急性粒细胞白血病细胞株(HL-60),以不刺激的HL-60细胞作参照应用RT-PCR检测HOXA10基因表达活性的差异明确E2对HOXA10表达的活化作用,并在E2刺激下以反义寡核苷酸转染技术分别敲除ERα、ERβ和MLLs(MLL1-4)后再检测HOXA10 mRNA和蛋白表达的变化确定哪一种雌激素受体的活化与HOXA10的表达相关,哪一种MLL对HOXA10表达有调控作用。以ChIP实验检测MLL和HOXA10的相互作用,再以Western blot检测E2刺激前后组蛋白H3K4甲基化状态以明确MLL是否通过表观遗传学途径调控HOXA10的表达。结果在E250 nmol/L 6 h刺激下HOXA10表达明显升高,ERα和ERβ反义寡核苷酸转染后HOXA10表达均有下降,MLL1表达沉默时HOXA10表达明显降低(P<0.05),MLL1可以结合到HOXA10启动子上的ERE区域而组蛋白H3K4甲基化状态在E2刺激后明显高于刺激前(P<0.05)。结论急性髓性白血病细胞的HOXA10基因表达受MLL1蛋白调控,可能为急性髓性白血病的致病机制分析提供了一个新的方向,MLL1介导的HOXA10表达的改变有可能成为急性髓性白血病的防治新靶点。

关键词： HOXA10 混合系白血病基因雌激素受体急性髓性白血病

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抗人降钙素原特异性单克隆抗体的制备鉴定及初步应用

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第三军医大学学报 2013年第6期35卷 523-526页

作者：郑怡麟何莹陈安易维京胡川闽第三军医大学医学检验系临床生物化学教研室重庆400038

目的获得抗人降钙素原(procalcitonin,PCT)单克隆抗体,并鉴定其基本特性。方法从NCBI数据库中获得PCT编码序列,以原核表达系统表达PCT重组蛋白,经镍亲和层析柱纯化,获得筛选单克隆抗体的筛选原;综合应用多种生物信息学分析软件预测PCT... 详细信息

目的获得抗人降钙素原(procalcitonin,PCT)单克隆抗体,并鉴定其基本特性。方法从NCBI数据库中获得PCT编码序列,以原核表达系统表达PCT重组蛋白,经镍亲和层析柱纯化,获得筛选单克隆抗体的筛选原;综合应用多种生物信息学分析软件预测PCT中潜在的B细胞表位肽,用合成肽对BALB/c小鼠进行免疫,纯化单克隆抗体,通过间接ELISA、Western blot和免疫组化鉴定获得的单克隆抗体。将获得的单克隆抗体作为捕获抗体,经过配对建立检测重组PCT的ELISA体系,并初步对临床血清进行了检测。结果成功获得3株PCT特异性单克隆抗体,分别为2-D7、2-H12和4-H12,亚类分别为IgG1和IgG2a,最高效价为1∶1 024 000,亲和力最高可达到1.3×109L/mol;选取2-D7经Western blot鉴定能够检测重组PCT蛋白,经免疫组化证实能特异性识别甲状腺组织中PCT蛋白,经过配对成功建立了检测重组PCT的ELISA体系,运用建立体系检测临床血清PCT含量时发现正常组与细菌培养阳性组之间具有显著差异。结论成功表达了人PCT重组蛋白,获得了3株高特异性和高亲和力的PCT单克隆抗体,成功建立了检测重组PCT的ELISA体系,并初步用于临床样本检测。

关键词：降钙素原原核表达单克隆抗体特性鉴定 ELSIA检测

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IBP表达抑制后活化T淋巴细胞基因表达谱变化分析

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第三军医大学学报 2013年第2期35卷 109-113页

作者：向莉李鹏张竹君杨明珍陈安胡川闽第三军医大学医学检验系临床生物化学教研室重庆400038

目的利用全基因组寡核苷酸芯片检测干扰素调节因子-4结合蛋白(IRF-4 binding protein,IBP)表达抑制后活化T淋巴细胞基因表达谱的差异。方法采用本室构建的IBP表达抑制的Jurkat T细胞及相应对照细胞为实验对象,Anti-CD3、CD28 mAb处理细... 详细信息

目的利用全基因组寡核苷酸芯片检测干扰素调节因子-4结合蛋白(IRF-4 binding protein,IBP)表达抑制后活化T淋巴细胞基因表达谱的差异。方法采用本室构建的IBP表达抑制的Jurkat T细胞及相应对照细胞为实验对象,Anti-CD3、CD28 mAb处理细胞后提取刺激24、48 h的细胞总RNA,利用北京博奥生物有限公司22K Human GenomeArray芯片检测基因表达的差异,以***.V1软件,结合KEGG、NCBI等生物信息学数据库检索分析差异表达基因功能和网络关系。结果 IBP基因表达抑制的Jurkat T细胞在TCR信号刺激24、48 h后,细胞能量代谢、周期生长、转录调控及凋亡等多种类型的基因发生差异表达改变,2个时相组共有56个差异表达趋势一致基因,其中17个基因共同上调,39个基因共同下调。结论在活化的Jurkat T细胞中IBP表达抑制所致多个基因差异表达。

关键词：干扰素调节因子4结合蛋白 T淋巴细胞基因芯片

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RNAi介导的IBP表达抑制对人乳腺癌MDA-MB-231细胞细胞骨架的影响

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重庆医学 2013年第1期42卷 1-5页

作者：陈忠蛟李鹏杨明珍陈安胡川闽第三军医大学医学检验系临床生物化学教研室重庆400038

目的研究干扰素调节因子4结合蛋白(IBP)的表达抑制对人乳腺癌MDA-MB-231细胞中微丝、微管的影响。方法设计并合成针对人IBP mRNA的RNA干扰(RNAi)序列,构建RNAi慢病毒表达载体,与包装质粒共转染人胚肾293FT细胞获得病毒颗粒,以病毒感染MD... 详细信息

目的研究干扰素调节因子4结合蛋白(IBP)的表达抑制对人乳腺癌MDA-MB-231细胞中微丝、微管的影响。方法设计并合成针对人IBP mRNA的RNA干扰(RNAi)序列,构建RNAi慢病毒表达载体,与包装质粒共转染人胚肾293FT细胞获得病毒颗粒,以病毒感染MDA-MB-231细胞。采用免疫印迹及实时聚合酶链反应(RT-PCR)确定能有效抑制IBP的RNAi序列,筛选出获得稳定感染的细胞株并进行微丝、微管染色。结果成功构建了IBP特异性的RNAi慢病毒表达载体和对照载体,对MDA-MB-231细胞IBP的沉默效率为69.9%;通过微丝、微管染色证实IBP表达下调后,细胞形态出现明显变化,细胞体增大,丝状伪足减少,片状伪足增多,微管排列紊乱。结论 IBP蛋白通过影响微管、微丝的排列而改变MDA-MB-231细胞生物学行为。

关键词：转染 RNA干扰慢病毒感染细胞骨架基因 IBP

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