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人补体受体1型活性片段SCR15-18在毕赤酵母中的表达、纯化及活性鉴定

第三军医大学学报 2009年第6期31卷 470-473页

作者：刘高科何莉杨永涛汪正清第三军医大学基础医学部微生物学教研室重庆市微生物工程实验室重庆400038

目的实现人补体受体1型(complement receptor type 1,CR1)活性片段SCR15-18在毕赤酵母中的分泌表达。方法用PCR从原核表达质粒pET32a-sCR1-SCR15-18上扩增CR1-SCR15-18的编码基因,并克隆到毕赤酵母分泌表达质粒pPIC9,构建重组质粒pPIC9-CR1-SCR15-18,鉴定后测序;重组质粒电转化整合到毕赤酵母GS115基因组中,菌落PCR技术筛选阳性转化株;经摇瓶发酵和甲醇诱导,SDS-PAGE和Western blot鉴定目的蛋白的表达;Ni2+-NTA agarose亲和层析纯化目的蛋白,并用体外抑制补体溶血反应实验测定目的蛋白的生物活性。结果成功构建重组表达质粒pPIC9-CR1-SCR15-18;SDS-PAGE和Western blot证实目的基因在毕赤酵母中成功分泌表达;表达产物经镍柱快速纯化后,能够明显抑制补体的体外溶血。结论在毕赤酵母中成功实现了CR1-SCR15-18蛋白的分泌表达,该蛋白具有较高的抑制补体溶血的生物活性。

关键词：补体受体1型毕赤酵母分泌表达补体溶血

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CHO细胞中稳定表达人整合素β3对登革2型病毒感染的影响

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第三军医大学学报 2009年第2期31卷 98-100页

作者：张俊磊高娜陈炜陈宗涛徐小峰安静第三军医大学基础医学部微生物学教研室重庆市微生物工程实验室重庆400038 第三军医大学基础医学部组织学与胚胎学教研室重庆市神经科学研究所重庆400038 首都医科大学微生物学教研室北京100069

目的检测CHO细胞中稳定表达人整合素β3对登革2型病毒(Dengue virus serotype 2,DV2)感染的影响。方法将表达人整合素β3的质粒转染CHO细胞,通过G418筛选、流式细胞学检测和间接免疫荧光实验,建立稳定表达整合素β3的CHO细胞株;利用该... 详细信息

目的检测CHO细胞中稳定表达人整合素β3对登革2型病毒(Dengue virus serotype 2,DV2)感染的影响。方法将表达人整合素β3的质粒转染CHO细胞,通过G418筛选、流式细胞学检测和间接免疫荧光实验,建立稳定表达整合素β3的CHO细胞株;利用该细胞株进行感染实验,检测人整合素β3稳定表达对DV2易感性的影响。结果共获得了C9、C10、F8和H6 4个高表达整合素β3的细胞克隆,其中克隆F8中整合素β3的表达水平最高,是对照组的1.89倍。感染实验结果显示,进入整合素β3高表达细胞株的病毒数量均有所增高,增高的比例与整合素β3的表达增高趋势基本一致,进入F8细胞株的病毒量最高,是对照细胞的2.63倍,说明整合素β3有助于DV2进入细胞。结论在CHO细胞中外源性表达整合素β3可以提高DV2的感染率。

关键词：登革病毒整合素β3 CHO细胞

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Id2在三碘甲状腺氨酸调节大鼠室管膜前下区神经干细胞分化中的作用

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第三军医大学学报 2009年第5期31卷 394-397页

作者：罗雪陈兴书蔡其燕钟善传姚忠祥第三军医大学基础医学部组织学与胚胎学教研室重庆市神经科学研究所重庆400038

目的探讨三碘甲状腺氨酸(triiodothyronine,T3)对大鼠室管膜前下区(anterior subventricular zone,SVZa)神经干细胞(neural stem cells,NSCs)分化为少突胶质细胞的影响及转录因子Id2的表达变化。方法离体培养新生大鼠SVZa来源的NSCs,应用免疫细胞化学技术观察加入T3后对NSCs分化细胞种类、比例的影响,以及不同分化时间Id2表达的变化情况。结果在正常自然培养的未分化NSCs中Id2表达较强,分化2h和12h时表达较弱,随后逐渐增强。加入T3后,细胞分化加速,Id2表达较对照组高(P<0.05),但此时少突胶质细胞数量增多,而星形胶质细胞数量减少。结论T3可能通过增加Id2的表达从而促进体外培养的SVZa NSCs向少突胶质细胞分化,而抑制其向星形胶质细胞分化。

关键词：神经干细胞三碘甲状腺氨酸 Id2 分化

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推定铜绿假单胞菌噬菌体PaP3末端酶小亚单位的DNA结合能力检测

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第三军医大学学报 2009年第5期31卷 379-382页

作者：申晓冬张克斌李明胡晓梅周莹冰陈志瑾胡福泉第三军医大学基础医学部微生物学教研室重庆市微生物工程实验室重庆400038 第三军医大学新桥医院医学实验技术中心重庆400037

目的检测理论推定的铜绿假单胞菌噬菌体PaP3末端酶小亚单位(pap3p01基因)编码蛋白对特异性DNA的结合能力。方法通过PCR从噬菌体PaP3基因组扩增出pap3p01基因,克隆至表达载体pQE31,转化入大肠杆菌JM109后,IPTG诱导表达目的蛋白,超声裂菌... 详细信息

目的检测理论推定的铜绿假单胞菌噬菌体PaP3末端酶小亚单位(pap3p01基因)编码蛋白对特异性DNA的结合能力。方法通过PCR从噬菌体PaP3基因组扩增出pap3p01基因,克隆至表达载体pQE31,转化入大肠杆菌JM109后,IPTG诱导表达目的蛋白,超声裂菌后发现目的蛋白质H6-PaP3P01存在于上清中,进而利用Ni-NTA亲合层析纯化蛋白。利用PCR与酶切方法获取可能含有末端酶小亚单位结合位点的DNA片段,并对其3′端进行生物素标记。最后采用凝胶迁移率改变实验检测H6-PaP3P01的DNA结合能力。结果成功构建了pQE-PaP3P01表达载体,获得的融合蛋白H6-PaP3P01表达量较高且全部存在于菌体超声后的上清中。经亲和层析初步纯化及脱盐处理后,H6-PaP3P01可与263 bp特异性DNA片段结合。结论成功构建并表达了推定的PaP3末端酶小亚单位重组蛋白H6-PaP3P01,并且检测到了该蛋白质对特异DNA的结合能力,初步证实了理论推定的正确性,为完善PaP3噬菌体包装机制的研究奠定了基础。

关键词：末端酶小亚单位噬菌体PaP3 EMSA 蛋白表达

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革兰阴性菌基因快速失活载体的构建及其应用

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第三军医大学学报 2009年第22期31卷 2240-2242页

作者：龚明福滕亮张金龙黎庶胡晓梅陈志瑾熊坤丛延广第三军医大学基础医学部微生物学教研室重庆市微生物工程实验室重庆400038

目的构建适用于革兰阴性菌的快速基因失活载体系统并进行初步应用。方法应用分子克隆技术构建快速基因失活载体系统。载体成分主要包括:π蛋白依赖性复制起点ori R6K;编码接合转移的mob片段;多克隆位点序列;含有2个XcmⅠ酶切位点的T载... 详细信息

目的构建适用于革兰阴性菌的快速基因失活载体系统并进行初步应用。方法应用分子克隆技术构建快速基因失活载体系统。载体成分主要包括:π蛋白依赖性复制起点ori R6K;编码接合转移的mob片段;多克隆位点序列;含有2个XcmⅠ酶切位点的T载体形成片段以及多种耐药片段,包括Chl(氯霉素抗性)、Tet(四环素抗性)、Km(卡那霉素抗性),获得的载体分别命名为EK3-Chl、EK3-Tet、EK3-Km。采用构建的EK3-Tet载体对弗氏枸橼酸杆菌的yeeZ基因进行插入突变,以验证其有效性。通过XcmⅠ酶切EK3-Tet质粒形成T载体状态,将PCR扩增得到的两端截短的yeeZ基因与该T载体直接连接,获得的质粒采用接合方式转移到弗氏枸橼酸杆菌ATCC8090中以实现整合,双抗培养基筛选整合突变株,对获得的突变株进行鉴定和形态观察。结果成功构建了EK3-Chl、EK3-Tet和EK3-Km,并对yeeZ基因进行插入突变获得突变株,步骤简便,工作周期短。结论上述构建的载体系统能够对革兰阴性菌进行目的基因的快速插入失活,该载体可在细菌基因功能研究中得到一定的应用。

关键词：载体基因失活单交叉同源重组

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组蛋白去乙酰化酶基因RNAi抑制大鼠血管平滑肌细胞的增殖与迁移

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中华高血压杂志 2009年第5期17卷 444-449页

作者：王燕章波傅春江曾春雨张烨王旭开基础医学部医学遗传学教研室重庆400038 第三军医大学大坪医院心血管内科重庆400042

目的探讨组蛋白去乙酰化酶(HDAC)对大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)增殖及迁移的影响。方法采用DNA重组技术构建抑制HDAC基因RNAi载体,将其转染到分离培养的Wistar大鼠VSMC中抑制其表达,并检测其细胞生物学改变。结果测序结果表明所构建的RNA... 详细信息

目的探讨组蛋白去乙酰化酶(HDAC)对大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)增殖及迁移的影响。方法采用DNA重组技术构建抑制HDAC基因RNAi载体,将其转染到分离培养的Wistar大鼠VSMC中抑制其表达,并检测其细胞生物学改变。结果测序结果表明所构建的RNAi载体包含有正确的片段插入。将该载体转染VSMC后,经荧光定量PCR、免疫印迹检测其HDAC1基因表达受到明显抑制,最大抑制效率为55%,且组蛋白H3乙酰化水平明显升高。RNAi抑制HDAC1蛋白表达后,VSMC倍增时间增加、细胞迁移率下降。结论HDAC基因RNAi抑制大鼠VSMC的增殖与迁移,提示组蛋白去乙酰化在VSMC的增殖与迁移中发挥重要的作用。

关键词：组蛋白去乙酰化酶血管平滑肌细胞 RNAi

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青蒿琥酯对人表皮鳞癌A431细胞增殖和凋亡的影响

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第三军医大学学报 2009年第7期31卷 615-618页

作者：江忠勇梅峰于彬韩鹃田衍平李世峰周德山第三军医大学基础医学部组织胚胎学教研室重庆市神经科学研究所重庆400038

目的初步探讨青蒿琥酯(artesunate,ART)对人表皮鳞癌细胞增殖和凋亡的影响及其相关机制。方法以人表皮鳞癌细胞系A431为研究对象,人永生化角质形成细胞系HaCaT为正常对照,顺铂(diamminedichloroplatinum,DDP)为药物阳性对照,通过MTT法... 详细信息

目的初步探讨青蒿琥酯(artesunate,ART)对人表皮鳞癌细胞增殖和凋亡的影响及其相关机制。方法以人表皮鳞癌细胞系A431为研究对象,人永生化角质形成细胞系HaCaT为正常对照,顺铂(diamminedichloroplatinum,DDP)为药物阳性对照,通过MTT法和流式细胞术观察ART对A431细胞增殖和凋亡的影响,以及铁离子抑制剂去铁敏(desferrioxamine,DFOM)部分阻断ART对A431细胞的生长抑制作用。结果ART对A431细胞有较明显的增殖抑制作用,对HaCaT细胞的损害显著低于DDP;药物组ART60μmol/L(IC50)作用A431细胞48h,A431细胞阻滞于S期[(67.60±4.12)%,P<0.05],同时凋亡率上调[(19.87±0.03)%,P<0.01];药物阻断组DFOM60μmol/L预处理A431细胞4h、加入ART60μmol/L作用48h,凋亡率显著下调[(7.37±0.02)%,P<0.01],而周期检测未发生变化。结论ART通过阻滞A431细胞停滞于S期和诱导A431细胞凋亡发挥增殖抑制作用,此作用在一定范围内与药物剂量呈正相关;ART对A431细胞的诱导凋亡作用与Fe2+介导有关;ART毒副作用明显低于DDP。

关键词：青蒿琥酯鳞状细胞癌角质形成细胞细胞凋亡

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登革2型病毒NS1-NS2a基因真核表达载体的构建及鉴定

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第三军医大学学报 2009年第6期31卷 557-559页

作者：陈炜王嘉丽高娜田衍平陈宗涛徐小峰张俊磊刘丽梅江雯安静第三军医大学基础医学部微生物学教研室重庆市微生物工程实验室第三军医大学基础医学部组织胚胎学教研室重庆市神经科学研究所重庆400038 首都医科大学基础医学院微生物学教研室北京100069

目的构建登革2型病毒NS1-NS2a基因真核表达质粒。方法RT-PCR扩增NS1-NS2a基因片段后,将其克隆入真核表达载体pReceiver-M01a;通过PCR、酶切、测序和间接免疫荧光染色鉴定重组质粒。结果经PCR扩增、酶切和测序验证,重组质粒构建正确,命名... 详细信息

目的构建登革2型病毒NS1-NS2a基因真核表达质粒。方法RT-PCR扩增NS1-NS2a基因片段后,将其克隆入真核表达载体pReceiver-M01a;通过PCR、酶切、测序和间接免疫荧光染色鉴定重组质粒。结果经PCR扩增、酶切和测序验证,重组质粒构建正确,命名为pRe-NS1-NS2a;重组质粒转染Vero细胞后,间接免疫荧光染色显示细胞质中有登革2型病毒特异性蛋白的表达。结论成功构建了真核表达质粒pRe-NS1-NS2a。

关键词：登革2型病毒 NS1-NS2a基因真核表达

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基于中国可视人体数据集构建髋关节应力分析三维有限元模型

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第三军医大学学报 2009年第12期31卷 1193-1197页

作者：陈光兴杨柳李恺王文斌杨滨张焱何锐王志军余宾宁姜哲张肖莎第三军医大学西南医院关节外科中心重庆400038 第三军医大学基础医学部人体解剖学教研室重庆市数字医学研究所重庆400038 重庆大学土木工程学院重庆400030 第三军医大学学员旅二队重庆400038

目的基于中国可视化人体数据集准确构建包括髋关节骨、软骨及盂唇完整结构的三维有限元应力分析模型。方法利用中国可视化人体数据库高分辨率磨片图像,采用轮廓提取法,在AutoCAD工作平台及Solidworks软件辅助下,通过实体加减法建立髋臼... 详细信息

目的基于中国可视化人体数据集准确构建包括髋关节骨、软骨及盂唇完整结构的三维有限元应力分析模型。方法利用中国可视化人体数据库高分辨率磨片图像,采用轮廓提取法,在AutoCAD工作平台及Solidworks软件辅助下,通过实体加减法建立髋臼骨、软骨、盂唇和股骨头骨、软骨的三维实体模型,并导入ABAQUS分析系统中作为装配的模型部件,设定材料属性后进行网格化,获得三维有限元模型组件。将髋臼骨、软骨、盂唇和股骨头骨、软骨部件分别组装,定义股骨近端相对髋臼屈髋5°、外旋20°,以股骨头中心施加垂直向上应力400N,分析验证其软骨部位的应力分布。结果采用实体加减法获得的组件在ABAQUS分析系统中装配准确,骨、软骨和盂唇连接界面未出现影响应力分析的间隙或实体重叠,网格化过程顺利。获得的软骨及盂唇接触区域的应力分布、软骨应力集中区域与传统研究方法结果相近。结论利用中国可视化人体数据库磨片能准确构建包括髋关节完整结构的三维有限元应力分析模型,并可避免其他构建方法无盂唇结构的缺陷。

关键词：髋三维有限元可视化人体生物力学

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含核受体真核表达载体的构建及其转染真皮多能干细胞(英文)

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中国组织工程研究与临床康复 2009年第40期13卷 7919-7924页

作者：王涛邱安春李露斯刘雁平屈纪富徐文岳解放军第三军医大学西南医院急救部重庆市400038 四川省隆昌县中医院骨二科四川省内江市642100 解放军第三军医大学西南医院神经内科重庆市400038 解放军第三军医大学基础医学部病原生物学教研室重庆市400038

背景:研究表明含核受体基因在神经系统发育过程中具有重要意义,是维持成体干细胞增殖和成神经分化的关键基因。目的:拟构建含核受体真核重组表达质粒pEGFPN1-TLX,并筛选出能稳定表达含核受体的真皮多能干细胞。设计、时间及地点:细胞基... 详细信息

背景:研究表明含核受体基因在神经系统发育过程中具有重要意义,是维持成体干细胞增殖和成神经分化的关键基因。目的:拟构建含核受体真核重组表达质粒pEGFPN1-TLX,并筛选出能稳定表达含核受体的真皮多能干细胞。设计、时间及地点:细胞基因学实验,于2007-03/12在解放军第三军医大学基础医学部病原生物学教研室完成。材料:成年SD大鼠1只,由解放军第三军医大学实验动物研究所提供;真皮多能干细胞由解放军第三军医大学全军复合伤研究所分离培养;质粒载体pEGFPN1及细菌DH5α由徐文岳教授惠赠。方法:首先以大鼠的大脑组织总RNA为模板,RT-PCR扩增出含核受体的编码cDNA序列,T/A克隆至pMDl8-T载体上,然后用BamHI、HindⅢ双酶切释放出经测序鉴定为阳性的重组质粒pMDl8-T-TLX中的含核受体片段,亚克隆到真核载体pEGFPN1中,从而构建真核重组表达质粒pEGFPN1-TLX,最后采用阳性脂质体将pEGFPN1-TLX转染到真皮多能干细胞中。主要观察指标:转染后24h荧光显微镜下观察绿色荧光,RT-PCR检测含核受体mRNA的表达,免疫组化染色观察向神经细胞的分化情况。结果:PCR、酶切和测序结果证明,成功地将含核受体全长cDNA克隆到pEGFPN1质粒中,并成功构建pEGFPN1-TLX重组质粒。与未转染真皮多能干细胞相比,10d后可见pEGFPN1-TLX转染的真皮多能干细胞继续生长,并于15d时形成抗性克隆,荧光显微镜下有绿色荧光蛋白表达;而未转染的真皮多能干细胞10d时已全部死亡。RT-PCR结果显示,pEGFPN1-TLX转染真皮多能干细胞表达TLXmRNA。诱导后3d与单纯真皮多能干细胞比较,pEGFPN1-TLX转染的真皮多能干细胞诱导成NF200阳性细胞数明显增加,诱导成GFAP阳性细胞数明显减少。结论:实验成功构建含核受体真核表达载体,并成功转染了真皮多能干细胞。转染后能明显提高真皮多能干细胞向神经元分化的效率,而向胶质细胞分化受到抑制。

关键词：核受体含核受体克隆真皮多能干细胞

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