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第三军医大学学报 2016年第6期38卷 657-662页

作者：蔡鹏仲伟天彭岩贾敏王燕白云王旭开第三军医大学大坪医院野战外科研究所心血管内科重庆400042 第三军医大学基础医学部分子遗传学教研室重庆400038

目的探索重庆地区汉族人群中成纤维细胞生长因子23（FGF23）基因多态性同冠心病发病的相关性。方法筛选2014年5月至2015年3月在我科接受冠脉造影检查的重庆汉族人群431例,其中冠心病（CHD）组231例与对照组200例。提取血液DNA样本后采用... 详细信息

目的探索重庆地区汉族人群中成纤维细胞生长因子23（FGF23）基因多态性同冠心病发病的相关性。方法筛选2014年5月至2015年3月在我科接受冠脉造影检查的重庆汉族人群431例,其中冠心病（CHD）组231例与对照组200例。提取血液DNA样本后采用Sequenom Massarray系统对于rs7955866、rs13312756、rs3812822这3个FGF23基因Tag SNP位点进行基因分型,对其等位基因、基因型及单体型的组间分布进行统计学分析。结果 CHD组rs7955866 A等位基因和rs3812822 C等位基因频率明显高于对照组（P〈0.001）,两位点组间基因型分布也存在明显差异（P〈0.01）。单因素Logistic回归分析示rs7955866 GA基因型携带者患病风险为GG基因型的2.146倍,具有统计学意义（P=0.01,OR=2.146,95%CI[1.393~3.306]）,rs3812822 CT基因型与TT基因型携带者患病风险亦具有统计学差异（P=0.01,OR=2.010,95%CI[1.327~3.046]）。多因素非条件Logistic回归分析调整性别、年龄、BMI、吸烟饮酒史、高血压病史、高胆固醇血症等混杂因素后,结果显示rs7955866及rs3812822位点均与CHD发病独立相关（P〈0.001,OR=2.478,95%CI[1.613~3.806];P〈0.001,OR=2.123,95%CI[1.439~3.132]）。单体型rs7955866-rs13312756-rs3812822统计学分析结果显示,单体型ACC具有增加冠心病患病风险的作用（P〈0.001;OR=2.074,95%CI[1.391~3.091]）。结论重庆汉族人群FGF23基因多态性及与冠心病患病风险相关。

关键词：成纤维细胞生长因子23 单核苷酸多态性冠心病动脉粥样硬化

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应用于PCR及实时荧光定量PCR的细菌DNA提取方法

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第三军医大学学报 2006年第7期28卷 734-735页

作者：胡晓红刘昕黄正根彭惠民袁科程英高云重庆医科大学细胞生物学及遗传学教研室重庆400016 第三军医大学基础医学部分子遗传学教研室重庆400038

目的建立特异灵敏的适应于PCR及实时荧光定量PCR的细菌DNA提取方法。方法于细菌样本离心所得沉淀中加入提取液(25%Chelex-100,0·5%NP40,TE配制,pH=9·0);56℃孵育30min;100℃水浴10min;离心后所得上清即为DNA。电泳、PCR及Real... 详细信息

目的建立特异灵敏的适应于PCR及实时荧光定量PCR的细菌DNA提取方法。方法于细菌样本离心所得沉淀中加入提取液(25%Chelex-100,0·5%NP40,TE配制,pH=9·0);56℃孵育30min;100℃水浴10min;离心后所得上清即为DNA。电泳、PCR及Real-time PCR扩增评价该方法的特异性及灵敏度。结果本方法所提细菌DNA电泳条带清晰,未见假阳性,D(260)/D(280)=(1·79±0·03);PCR及Real-time PCR扩增未见假阳性及假阴性,灵敏度达101/ml细菌浓度。结论本研究细菌DNA提取方法特异灵敏,适应于PCR及Real-time PCR。

关键词： PCR 实时荧光定量PCR DNA提取

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p65 DNA结合域的克隆、表达及其酵母双杂交自身激活作用检测

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第三军医大学学报 2003年第2期25卷 123-126页

作者：徐祥梁华平刘昕代佳平刘琛罗艳王正国第三军医大学附属大坪医院野战外科研究所第一研究室重庆400042 第三军医大学基础医学部分子遗传学教研室重庆400038

目的　获得NF κBp65亚基DNA结合域cDNA及构建酵母双杂交系统中的靶基因 ,并检测靶基因的表达和自身激活活性。方法　利用引物二聚体搭桥技术 ,扩增p65亚基DNA结合域基因片段 ,并将其克隆入酵母双杂交载体pG BKT7DNA BD。应用醋酸锂法... 详细信息

目的　获得NF κBp65亚基DNA结合域cDNA及构建酵母双杂交系统中的靶基因 ,并检测靶基因的表达和自身激活活性。方法　利用引物二聚体搭桥技术 ,扩增p65亚基DNA结合域基因片段 ,并将其克隆入酵母双杂交载体pG BKT7DNA BD。应用醋酸锂法转化酵母细胞AH10 9,在SD Trp选择培养基上培养 ,观察转化株的生长情况。按尿素 SDS法抽提酵母蛋白 ,用SDS PAGE电泳和Western blot鉴定靶蛋白在酵母细胞中的表达。利用液相法和平板法检测阳性转化株 β 半乳糖苷酶的活性。结果　获得p65DNA结合域基因片段 ,并成功构建酵母双杂交系统中的靶基因。靶基因能在酵母细胞中表达 ,对酵母细胞无毒性作用 ,无自身激活活性。结论　NF κBp65亚基DNA结合域可作为酵母双杂合系统中的靶基因 ,用于肽库筛选。

关键词： p65 DNA结合域克隆核因子κB 酵母双杂交自身激活作用酵母表达炎症反应

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革兰阴性杆菌耐药与产AmpC酶的检测及其与耐药的关系分析

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第三军医大学学报 2005年第4期27卷 353-355页

作者：蔡瑜娇刘岚刘昌林刘昕黄正根高玉梅袁科第三军医大学基础医学部分子遗传学教研室重庆400038 重医儿童医院检验科细菌室重庆400014

目的　了解 2 74株革兰阴性杆菌的耐药现状及产AmpC酶与耐药的关系分析。方法　采用microscanwalkaway 4 0鉴定 2 74株革兰阴性杆菌的药敏情况 ,并用酶粗提物头孢西丁三维实验检测AmpC酶。结果　 3 2株细菌产AmpC酶 (占 11 7% ) ,其中... 详细信息

目的　了解 2 74株革兰阴性杆菌的耐药现状及产AmpC酶与耐药的关系分析。方法　采用microscanwalkaway 4 0鉴定 2 74株革兰阴性杆菌的药敏情况 ,并用酶粗提物头孢西丁三维实验检测AmpC酶。结果　 3 2株细菌产AmpC酶 (占 11 7% ) ,其中阴沟肠杆菌 13株 (占 3 0 2 % )、产气肠杆菌 2株 (占 2 2 2 % )、不动杆菌 6株 (占 2 1 4% )。 2 74株菌对IPM、AK、CIP、FEP、CN、SXT、CAZ、ATM、CRO、PIP的药物敏感率从高到低依次为 :89 4%、78 8%、 69 3 %、 5 5 5 %、45 9%、3 9 1%、3 6 9%、3 1 4%、3 0 3 %、18 2 %。结论　革兰阴性杆菌的耐药状况严重 ,检测AmpC酶有助于临床抗菌药物的选用。

关键词：耐药性 AmpC酶革兰阴性杆菌

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缺氧对Egr-1启动子辐射诱导活性的影响及机制的初步探讨

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第三军医大学学报 2004年第19期26卷 1708-1710页

作者：王卫东陈正堂李德志刘昕段玉忠第三军医大学新桥医院肿瘤科全军肿瘤诊治中心重庆市肿瘤生物技术研究所重庆400037 第三军医大学基础医学部分子遗传学教研室重庆400038

目的　探明缺氧对早期生长反应基因 1(earlygrowthresponsegene 1,Egr 1)启动子辐射诱导活性的影响及机制。方法　利用基因重组构建Egr 1启动子调控的荧光素酶报告质粒 ,脂质体介导转染肺癌A5 49细胞 ,在 0 .1%、0 .5 %、1%、2 .5 %、... 详细信息

目的　探明缺氧对早期生长反应基因 1(earlygrowthresponsegene 1,Egr 1)启动子辐射诱导活性的影响及机制。方法　利用基因重组构建Egr 1启动子调控的荧光素酶报告质粒 ,脂质体介导转染肺癌A5 49细胞 ,在 0 .1%、0 .5 %、1%、2 .5 %、5 %等氧浓度下给转染细胞以 2、4、6、8、10Gyγ 线照射 ,观察照射后荧光素酶表达水平及过氧化氢产量变化 ;观察过氧化氢浓度对Egr 1启动子转录活性的影响。结果　成功构建了Egr 1启动子报告载体 ,转染A5 49细胞 ,发现当氧浓度 <2 .5 %时 ,Egr 1启动子活性明显低于常氧对照组 (P <0 .0 1) ,并随氧浓度的下降而降低。照射后的过氧化氢产量呈现类似的变化特征 ,结果还表明Egr 1启动子的活性与过氧化氢浓度密切相关。结论　缺氧 (O2 <2 .5 % )导致Egr 1启动子辐射诱导活性下降 ,可能与氧自由基产量减少有关。

关键词：缺氧 Egr-1 启动子辐射

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胰岛素下调AP-1抑制血管平滑肌α肌动蛋白的表达以及对细胞增殖的影响

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第三军医大学学报 2015年第3期37卷 252-255页

作者：彭岩章波仲伟天许雪清白云王旭开第三军医大学大坪医院野战外科研究所心血管内科重庆市心血管病研究所重庆400042 第三军医大学基础医学部医学遗传学教研室重庆400038

目的研究胰岛素诱导大鼠血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)转录因子激活蛋白-1(activator protein 1,AP-1)表达下调对VSMC表型转换标志蛋白α肌动蛋白(alpha smooth muscle actin,SM-α)表达调控及细胞增殖的影响。方... 详细信息

目的研究胰岛素诱导大鼠血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)转录因子激活蛋白-1(activator protein 1,AP-1)表达下调对VSMC表型转换标志蛋白α肌动蛋白(alpha smooth muscle actin,SM-α)表达调控及细胞增殖的影响。方法流式细胞术检测不同浓度(0、25、50、100、125 nmol/L)的胰岛素刺激VSMC 24 h后的细胞周期。设计AP-1表达质粒载体,转染至血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)。分为4组:空白对照组、胰岛素实验组、AP-1表达载体组、胰岛素+AP-1表达载体组。分别采用Western blot、RT-PCR检测AP-1蛋白及SM-α蛋白的表达及mRNA水平。结果细胞周期分布结果显示,不同浓度的胰岛素刺激VSMC 24 h后,VSMC的S期百分比升高至峰值后开始下降[(23.49±1.17)%、(28.08±0.68)%、(30.44±1.77)%、(47.47±0.88)%、(46.23±1.65)%,P<0.05],100 nmol/L的胰岛素刺激VSMC 24 h后,VSMC的S期百分比达到峰值(47.47±0.88)。RT-PCR及Western blot检测结果显示,胰岛素刺激VSMC可下调AP-1[(0.47±0.09)、(0.46±0.14),P<0.05]及抑制SM-α的表达[(0.41±0.03)、(0.32±0.03),P<0.05]。结论胰岛素能下调转录因子AP-1表达,进而抑制表型转换标志蛋白SM-α的表达,诱导VSMC发生增殖。

关键词：胰岛素血管平滑肌细胞平滑肌肌动蛋白-α 激活蛋白-1

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胰岛素对大鼠血管平滑肌细胞增殖及胶原蛋白合成的影响

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第三军医大学学报 2006年第24期28卷 2416-2418页

作者：王旭开王燕杨成明付春江张晔何作云第三军医大学大坪医院野战外科研究所心血管内科重庆400042 第三军医大学基础医学部医学遗传学教研室重庆400038 第三军医大学新桥医院心血管内科全军心血管内科中心重庆400037

目的观察胰岛素对分离培养的大鼠血管平滑肌细胞(vascularsmoothmusclecells,VSMCs)增殖及胶原蛋白合成的影响。方法采用大鼠的腹主动脉血管平滑肌细胞分离培养,应用3H-TdR和3H-脯氨酸掺入方法检测胰岛素对大鼠VSMCs干预后,VSMCs内DNA... 详细信息

目的观察胰岛素对分离培养的大鼠血管平滑肌细胞(vascularsmoothmusclecells,VSMCs)增殖及胶原蛋白合成的影响。方法采用大鼠的腹主动脉血管平滑肌细胞分离培养,应用3H-TdR和3H-脯氨酸掺入方法检测胰岛素对大鼠VSMCs干预后,VSMCs内DNA合成以及胶原蛋白合成。结果胰岛素可促进处于静止状态的大鼠VSMCsDNA及胶原蛋白的合成,并呈现明显的浓度依赖关系,在40nmol/L的浓度时DNA及胶原蛋白的合成达到高峰,DNA及胶原蛋白分别处于36h和48h时合成最为显著。结论胰岛素可明显促进培养的VSMCs增殖及胶原蛋白的合成。

关键词：胰岛素血管平滑肌细胞胶原蛋白合成

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NF-κB p65亚基DNA结合域相互作用多肽的筛选及功能鉴定

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免疫学杂志 2006年第2期22卷 132-136页

作者：徐祥梁华平刘昕李生茂史海水刘东擘吴强王正国第三军医大学大坪医院野战外科研究所第一研究室创伤烧伤与复合伤国家重点实验室重庆400042 第三军医大学基础医学部分子遗传学教研室重庆400038

目的以NF-κB p65亚基DNA结合域为诱饵蛋白,筛选能够与其发生相互作用的多肽,并鉴定这些多肽对NF-κB DNA结合活性的抑制效应。方法首先利用PCR搭桥扩增方法获取NF-κB p65亚基DNA结合域的基因片段,后将其克隆到酵母双杂交pGBKT7DNA-BD... 详细信息

目的以NF-κB p65亚基DNA结合域为诱饵蛋白,筛选能够与其发生相互作用的多肽,并鉴定这些多肽对NF-κB DNA结合活性的抑制效应。方法首先利用PCR搭桥扩增方法获取NF-κB p65亚基DNA结合域的基因片段,后将其克隆到酵母双杂交pGBKT7DNA-BD载体上,与GAL4DNA-BD融合,形成GAL4DNA-BD/p65BD融合蛋白;再以GAL4DNA-BD/p65BD融合蛋白为诱饵蛋白行酵母双杂交实验,自16肽随机肽库中筛选与NF-κB p65亚基DNA结合域相互作用的多肽;最后选择性人工合成筛选获得的多肽,并进行EMSA实验检测相互作用多肽对NF-κB DNA结合活性的抑制效应。结果扩增获得了NF-κB p65亚基DNA结合域的基因片段,并成功构建pGBKT7DNA-BD/p65BD载体。自1.28×107个酵母转化子中最终筛选获得5个阳性克隆,测序结果和同源氨基酸序列比对表明5个阳性多肽为p65BD新型相互作用多肽,其中4条多肽拥有一个共同的基序。EMSA实验结果表明合成的两条多肽对NF-κB的DNA结合活性均具有一定的抑制效应。结论经初筛、复选和假阳性鉴定,自16肽库中获得5个能与NF-κB p65亚基发生相互作用的新型多肽,并已证实其中两条多肽对NF-κB的DNA结合活性具有抑制效应。

关键词： NF-κB p65 酵母双杂交系统随机多肽库

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A549细胞转染esp1基因后生物学行为的变化

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郑州大学学报（医学版） 2006年第5期41卷 884-886页

作者：刘丽莎刘昕刘永康第三军医大学基础医学部分子遗传学教研室重庆400038 西南医院全军肝胆外科研究所重庆400038

目的:观察A549细胞转染esp1基因后细胞生物学行为的改变。方法:将IRE-EGFP-esp1质粒用Fu-GENE6脂质体转染到肺腺癌细胞A549,经G418筛选获得转染阳性的细胞系(esp1-A549)。采用DNA荧光染色流式细胞仪分析转染后细胞DNA含量、倍性及细胞周... 详细信息

目的:观察A549细胞转染esp1基因后细胞生物学行为的改变。方法:将IRE-EGFP-esp1质粒用Fu-GENE6脂质体转染到肺腺癌细胞A549,经G418筛选获得转染阳性的细胞系(esp1-A549)。采用DNA荧光染色流式细胞仪分析转染后细胞DNA含量、倍性及细胞周期,计算S期细胞比率(SPF)和DNA指数(DI);采用细胞表面磷脂酰丝氨酸检测法和闪烁计数法分别检测细胞凋亡和增殖情况,同时检测软琼脂集落形成能力。以未转染(A549)、转染空载体(neo-A549)的细胞作对照。结果:与其他2组比较,esp1-A549细胞的DI、SPF及细胞增殖率降低,细胞凋亡率升高。esp1-A549细胞软琼脂集落形成数为3.5±0.6,克隆形成率为12.5%,低于A549细胞的23.3±0.2(t=4.93,P=0.004)和46%。结论:esp1基因的上调表达对A549细胞部分恶性生物学表型具有一定的抑制作用。

关键词： esp1基因 A549细胞肿瘤凋亡增殖克隆形成细胞周期 DNA倍性

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压电C肽免疫传感器的实验研究

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第三军医大学学报 2002年第12期24卷 1439-1442页

作者：张波府伟灵毛琼国汤万里俞凡第三军医大学附属西南医院检验科第三军医大学基础医学部分子遗传学教研室重庆400038 中国嘉陵集团生物工程办公室重庆400032 信息产业部第26研究所重庆400060

目的　构建一种新型压电C肽免疫传感器。方法　AT切向、基频 10MHz的石英晶体用金属夹具和乳胶套圈固定形成检测池 ,抗人C肽单克隆抗体采用巯基化方法固定在金膜电极表面制成抗体敏感膜 ,构成压电C肽免疫传感器。结果　构建的压电C肽免... 详细信息

目的　构建一种新型压电C肽免疫传感器。方法　AT切向、基频 10MHz的石英晶体用金属夹具和乳胶套圈固定形成检测池 ,抗人C肽单克隆抗体采用巯基化方法固定在金膜电极表面制成抗体敏感膜 ,构成压电C肽免疫传感器。结果　构建的压电C肽免疫传感器对C肽的响应特性良好 ,其线性检测范围为 0 3 75～ 12 0ng ml ,胰岛素、胰岛素原对C肽的检测基本无干扰 ,传感器可再生后重复使用 5次 ;5 8例临床标本检测结果与放射免疫检测法符合 (P >0 0 5 ) ,两种方法的相关系数为 0 94。结论　研制的压电C肽免疫传感器具有灵敏度高、特异性好、不需标记、操作简单、省时、能实时在线检测和重复使用等优点 ,对比实验表明其检测结果准确 ,能用于临床实验诊断 ,具有临床推广价值。

关键词：实验研究传感器免疫 C肽压电

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