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第三军医大学学报 2014年第8期36卷 735-739页

作者：尚伟龙胡启文胡珍朱军民杨杰袁文常程航袁吉振张霞饶青饶贤才第三军医大学基础医学部微生物学教研室重庆市微生物工程实验室重庆400038

目的探讨重庆地区耐甲氧西林金黄色葡萄球菌菌株ST239-MRSA-Ⅲ-t030替代ST239-MRSA-Ⅲ-t037克隆的机制。方法选择重庆地区分离的ST239-MRSA-Ⅲ-t030和ST239-MRSA-Ⅲ-t037临床株,检测各菌株的生长曲线,观察菌落形态,分析菌株的药物敏感谱... 详细信息

目的探讨重庆地区耐甲氧西林金黄色葡萄球菌菌株ST239-MRSA-Ⅲ-t030替代ST239-MRSA-Ⅲ-t037克隆的机制。方法选择重庆地区分离的ST239-MRSA-Ⅲ-t030和ST239-MRSA-Ⅲ-t037临床株,检测各菌株的生长曲线,观察菌落形态,分析菌株的药物敏感谱;再通过体外、体内竞争实验和交叉抑制实验深入探讨ST239-MRSA-Ⅲ-t030替代ST239-MRSA-Ⅲ-t037的机制。结果 ST239-MRSA-Ⅲ-t030菌株较ST239-MRSA-Ⅲ-t037有更短的生长迟缓期,后者在固体培养基上生长的菌落相对较小,且都对复方新诺明耐药,对利福平敏感,这与ST239-MRSA-Ⅲ-t030菌株不同(大多数对复方新诺明敏感,对利福平都耐药)。ST239-MRSA-Ⅲ-t030菌株在体外和体内都表现出比ST239-MRSA-Ⅲ-t037菌株更强的生存竞争优势,但两克隆的菌株间并不存在明显的交叉抑制现象。结论 ST239-MRSA-Ⅲ-t030克隆的生存竞争优势和独特的耐药表型可能是其成功替代ST239-MRSA-Ⅲ-t037而成为第一流行克隆的原因。

关键词：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌克隆替代生长曲线利福平耐药复方新诺明耐药

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金黄色葡萄球菌agr基因敲除及其对膜泡毒力影响

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第三军医大学学报 2014年第4期36卷 331-335页

作者：袁吉振杨杰袁文常胡珍尚伟龙张霞朱军民胡启文周人杰饶贤才第三军医大学基础医学部微生物学教研室重庆市微生物工程实验室重庆400038 第三军医大学新桥医院急诊科重庆400037

目的利用同源重组技术构建金黄色葡萄球菌RN4220附属基因调节系统(agr)的敲除株,探讨agr基因缺失对金黄色葡萄球菌分泌膜泡毒力的影响。方法分别扩增agr基因的上下游同源臂,利用重叠PCR获得agr基因上下游同源臂的融合片段,经酶切后连接... 详细信息

目的利用同源重组技术构建金黄色葡萄球菌RN4220附属基因调节系统(agr)的敲除株,探讨agr基因缺失对金黄色葡萄球菌分泌膜泡毒力的影响。方法分别扩增agr基因的上下游同源臂,利用重叠PCR获得agr基因上下游同源臂的融合片段,经酶切后连接敲除载体PYT3,构建同源重组质粒pYT3::Δagr,电转化至金黄色葡萄球菌RN4220,利用pYT3质粒对温度敏感的特点筛选agr缺失的突变株。分别制备野生菌RN4220和突变株RN4220::Δagr的膜泡,小鼠毒力实验观察agr基因缺失后对金黄色葡萄球菌膜泡毒力的影响。结果同源重组质粒pYT3::Δagr通过酶切鉴定证明构建成功;经PCR及DNA测序证实获得金黄色葡萄球菌RN4220 agr缺失突变株,重组效率为5.6%;agr突变株与野生株相比,其分泌膜泡的毒力大大降低,72 h内小鼠存活率为100%。结论 agr基因缺失后能够显著降低膜泡的毒力。

关键词：金黄色葡萄球菌膜泡同源重组附属基因调节系统

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金黄色葡萄球菌N315T7噬菌体cDNA展示文库的构建

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第三军医大学学报 2014年第13期36卷 1350-1353页

作者：于俊媛周莹冰张雯庆祁琳李萌姜北张骁鹏汪正清饶贤才黎庶胡晓梅第三军医大学基础医学部微生物学教研室重庆400038 重庆市渝中区疾病预防控制中心重庆400010

目的构建MRSA N315菌株的T7噬菌体cDNA展示文库，以筛选和鉴定影响N315 ccr基因表达的调节因子。方法采用Tripure试剂提取N315总RNA，逆转录合成双链cDNA，经末端修平、接头连接、酶切后柱洗脱等处理后，连接T7Select 10-3载体，体外... 详细信息

目的构建MRSA N315菌株的T7噬菌体cDNA展示文库，以筛选和鉴定影响N315 ccr基因表达的调节因子。方法采用Tripure试剂提取N315总RNA，逆转录合成双链cDNA，经末端修平、接头连接、酶切后柱洗脱等处理后，连接T7Select 10-3载体，体外包装扩增获得N315 T7噬菌体cDNA展示文库；通过双层平板实验鉴定所建原始文库及扩增文库的库容；PCR鉴定文库插入片段质量。结果原始文库重组克隆数为1.335×106 pfu，扩增文库的噬菌体滴度为3.26×1010 pfu/mL。随机PCR扩增显示文库阳性重组率为100%，插入片段在300～1 500 bp之间。结论 MRSA N315的T7噬菌体cDNA展示文库构建成功。

关键词：噬菌体展示 cDNA文库耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 N315

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人CR1-SCR1-3蛋白对急性大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用

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第三军医大学学报 2013年第13期35卷 1323-1326页

作者：杨绍俊张璇路延之汪正清第三军医大学基础医学部微生物学教研室重庆市微生物工程实验室重庆400038

目的探讨补体活化在大鼠急性脑缺血再灌注中的作用及人补体受体1型SCR1-3蛋白(CR1-SCR1-3)的保护作用。方法健康雄性SD大鼠75只,采用完全随机设计分组法分为假手术组(n=15)、CI/R组(n=30)及CI/R+CR1-SCR1-3组(n=30)。线栓法建立大鼠大... 详细信息

目的探讨补体活化在大鼠急性脑缺血再灌注中的作用及人补体受体1型SCR1-3蛋白(CR1-SCR1-3)的保护作用。方法健康雄性SD大鼠75只,采用完全随机设计分组法分为假手术组(n=15)、CI/R组(n=30)及CI/R+CR1-SCR1-3组(n=30)。线栓法建立大鼠大脑中动脉栓塞模型,缺血1 h,再灌注24 h,对大鼠进行行为学检测,记录神经功能缺陷评分;TTC染色法测定脑梗死体积;制作脑匀浆测定大脑皮层髓过氧化物酶(MPO)活性、丙二醇(MDA)含量及超氧化物歧化酶(SOD)活性;制备切片观察大脑皮质区补体C4b沉积及病理改变。结果缺血再灌注24 h后,CR1-SCR1-3蛋白可明显改善CI/R+CR1-SCR1-3组大鼠神经功能(P<0.05);脑梗死体积亦明显减少(P<0.01);与CI/R组比较,CI/R+CR1-SCR1-3组MPO活力、MDA含量显著降低(P<0.01),而SOD活性显著增高(P<0.01);缺血脑组织皮质区原位补体C4b沉积显著减少(P<0.01),病理损伤亦明显减轻。结论补体活化参与了脑缺血再灌注损伤过程,CR1-SCR1-3蛋白对大鼠急性CI/R损伤具有保护作用。

关键词：补体人补体受体1型短同源重复1—3 大脑中动脉栓塞脑缺血再灌注损伤炎症

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广州地区耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的分子分型及耐药性分析

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第三军医大学学报 2013年第8期35卷 696-701页

作者：程航曾方银胡启文袁文常周人杰张霞袁吉振尚伟龙杨杰胡珍朱军民饶贤才第三军医大学基础医学部微生物学教研室、重庆市微生物工程实验室重庆400038 南方医科大学南方医院检验科广州510515 第三军医大学新桥医院急诊科重庆400037

目的了解广州地区耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)分子型别及其对临床常用抗生素的耐药情况,为防控MRSA感染提供依据。方法收集2010年10月至2011年4月广州地区两家教学医院临床分离的MRSA ... 详细信息

目的了解广州地区耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)分子型别及其对临床常用抗生素的耐药情况,为防控MRSA感染提供依据。方法收集2010年10月至2011年4月广州地区两家教学医院临床分离的MRSA 142株,应用SCCmec、spa、多位点序列分型(multilocus sequence typing,MLST)、脉冲场凝胶电泳(pulsed-field gel electrophoresis,PFGE)等方法进行分子分型,检测这些菌株对苯唑西林、克林霉素等17种临床常用抗生素的药物敏感性,分析临床MRSA的耐药情况。结果 142株MRSA中121株为医院获得型金葡菌(HA-MRSA),20株为社区获得型金葡菌(CA-MRSA),1株未定型MRSA。这些MRSA可分为16种spa型,8种ST型及13种PFGE型。HA-MR-SA中的ST239-MRSA-Ⅲ-t030、ST239-MRSA-Ⅲ-t037和ST5-MRSA-Ⅱ-t002为主要流行克隆,也发现CA-MRSA中ST59-MR-SA-Ⅳ-t437克隆的流行,且这些流行克隆有特定的耐药谱。结论广州地区流行的金葡菌仍以HA-MRSA为主,同时也有一定量的CA-MRSA检出和传播,且CA-MRSA的多重药物敏感性已在下降。

关键词：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌分子分型脉冲场凝胶电泳多位点序列分型耐药谱

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基于分组重量编码和特征选择技术预测外膜蛋白

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第三军医大学学报 2013年第13期35卷 1366-1370页

作者：南重汉邹凌云解放军第3医院传染结核病防治所陕西宝鸡721006 第三军医大学基础医学部微生物学教研室重庆市微生物工程实验室重庆400038

目的建立新的机器学习模型,从蛋白质数据集或全基因组蛋白质序列中预测外膜蛋白。方法采用分组重量编码和氨基酸组成计算蛋白质序列特征,采用F-score方法反向选择特征,采用支持向量机算法建立分类模型,在1 087条蛋白质序列构成的数据集... 详细信息

目的建立新的机器学习模型,从蛋白质数据集或全基因组蛋白质序列中预测外膜蛋白。方法采用分组重量编码和氨基酸组成计算蛋白质序列特征,采用F-score方法反向选择特征,采用支持向量机算法建立分类模型,在1 087条蛋白质序列构成的数据集上进行测试,评价预测模型的敏感性、特异性和预测精度,在多个细菌的全基因组蛋白质中预测外膜蛋白。结果新的序列组合编码方法与SVM相结合,区分外膜蛋白和α螺旋跨膜蛋白、球状蛋白、非外膜蛋白的准确度分别达到94.7%、96.4%和94.6%,经特征选择之后,分类准确度分别提高到95.7%、96.9%和95.9%,且在基因组数据集中的预测结果与已知事实相符度高。结论该方法预测准确度优于其他基于序列特征的预测方法,可用于在基因组序列中预测和筛选新的外膜蛋白。

关键词：外膜蛋白分组重量编码特征选择支持向量机

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高致病性2型猪链球菌毒素-抗毒素系统SezAT的鉴定与活性研究

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微生物学通报 2012年第2期39卷 191-202页

作者：王敏李明钟秋赵岩饶贤才黎庶谭银玲胡福泉第三军医大学基础医学部微生物学教研室重庆400038

【目的】对我国高致病性2型猪链球菌05Z33基因组的89K毒力岛序列进行生物信息学分析,发现存在一对与化脓链球菌Epsilon-zeta(ε-ζ)同源的Ⅱ型毒素-抗毒素系统(Toxin-antitoxin system,TA)——SezAT,推测该系统具有稳定89K毒力岛使其不... 详细信息

【目的】对我国高致病性2型猪链球菌05Z33基因组的89K毒力岛序列进行生物信息学分析,发现存在一对与化脓链球菌Epsilon-zeta(ε-ζ)同源的Ⅱ型毒素-抗毒素系统(Toxin-antitoxin system,TA)——SezAT,推测该系统具有稳定89K毒力岛使其不易丢失的作用。验证SezAT为有活性的TA系统。【方法】对SezAT进行了生物信息学分析;RT-PCR验证SezAT共转录特性;在大肠杆菌中选择性地诱导表达毒素蛋白SezT和抗毒素蛋白SezA;最后通过同源重组技术敲除SezAT系统。【结果】sezAT由同一操纵子控制,SezT可抑制细菌生长,SezA可中和SezT的毒性作用,同源重组成功获得sezT敲除突变株。【结论】证实SezAT为一对有活性的毒素-抗毒素(TA)系统,为进一步研究SezAT可能发挥稳定89K毒力岛的功能,同时获得89K毒力岛缺失突变株并深入认识89K在我国高致病性SS2中的作用奠定了基础。

关键词：毒素-抗毒素系统 2型猪链球菌高致病性毒力岛敲除

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铜绿假单胞菌噬菌体PaP3全基因组在感染宿主菌PA3过程中的分时期表达研究

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免疫学杂志 2012年第5期28卷 382-388页

作者：陈灿煌赵霞王竞胡福泉谭银玲第三军医大学基础医学部微生物学教研室重庆400038

目的明确铜绿假单胞菌噬菌体PaP3在感染宿主菌PA3后其全基因组的分时期表达模式。方法利用基因芯片检测噬菌体PaP3在感染宿主菌PA3后不同时间(5 min,10 min,20 min,30 min,80 min)其全基因组(含71个预测的ORF)在转录水平的表达谱变化,... 详细信息

目的明确铜绿假单胞菌噬菌体PaP3在感染宿主菌PA3后其全基因组的分时期表达模式。方法利用基因芯片检测噬菌体PaP3在感染宿主菌PA3后不同时间(5 min,10 min,20 min,30 min,80 min)其全基因组(含71个预测的ORF)在转录水平的表达谱变化,并进行非监督层次聚类(hierarchical clustering)分析。利用蛋白质合成抑制剂氯霉素(Cm)和DNA复制抑制剂磷酸乙酸(PAA)实验确定PaP3全基因组的分时期表达情况。结果根据时间表达模式的不同,PaP3全基因组可分为3大类:15个早期基因(ORF 71-57)、35个中期基因(ORF 56-22)及21个晚期基因(ORF 21-1)。在PaP3基因组结构中,这3类基因各自串联分布且可能受不同的操纵子调控。结论 PaP3感染过程中其早期、中期及晚期基因随时间有序表达,为深入了解噬菌体基因表达模式及生命复制周期奠定基础,并为了解噬菌体与宿主及机体免疫系统的的相互作用提供了基础。

关键词：噬菌体基因芯片早期基因中期基因晚期基因

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2型猪链球菌89K致病岛进化途径分析

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第三军医大学学报 2012年第6期34卷 467-472页

作者：胡力文邹凌云倪青山姚新月朱军民李明胡福泉第三军医大学基础医学部微生物学教研室重庆市微生物工程实验室重庆400038

目的分析2型猪链球菌89K致病岛的结构特征,探索其进化历程。方法通过BLAST比对,获取89K致病岛的同源序列,构建其同源序列数据库;分析89K致病岛的碱基组成特征,寻找重组热点区域,并对89K进行分区;对各ORF进行功能预测,划分功能模块;对89... 详细信息

目的分析2型猪链球菌89K致病岛的结构特征,探索其进化历程。方法通过BLAST比对,获取89K致病岛的同源序列,构建其同源序列数据库;分析89K致病岛的碱基组成特征,寻找重组热点区域,并对89K进行分区;对各ORF进行功能预测,划分功能模块;对89K致病岛与其同源序列进行系统发育分析及共线性分析,推测其可能的进化历程。结果 89K致病岛可分为4个保守区,4个主要的非保守区及一段Tn916转座子,呈现多个异源序列相嵌合的结构特征。功能分析发现保守区基因主要参与致病岛的横向转移及其在宿主菌基因组中的稳定,保守区的基因呈现出进化上的一致性,且在某些菌株中保守区以连续状态存在。结论保守区在祖先状态时是一个连续整体,不同来源的非保守区经过多次水平转移和重组事件插入到保守区之间,形成了89K致病岛的嵌合结构。

关键词：致病岛生物信息学系统发育分析进化途径

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基于VEGFR靶点的小分子肿瘤靶向抑制肽的99Tcm标记及鉴定

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第三军医大学学报 2012年第1期34卷 24-28页

作者：冯世斌李前伟郑磊邹凌云查林任浩黄定德第三军医大学西南医院核医学科重庆400038 第三军医大学基础医学部微生物学教研室重庆市微生物工程实验室

目的探讨基于血管内皮生长因子受体(vascular endothelial growth factor receptor,VEGFR)靶点的小分子肿瘤靶向抑制肽理想的放射性核素99Tcm标记方法。方法多肽QKRKRKKSRKKH、RKRKRKKSRYIVLS分别经双功能螯合剂S-acetyl-MAG3、GA(D)GG、HYNIC修饰后进行放射性核素99 Tcm标记,HPLC及纸层析法鉴定其标记率及放化纯度,3 H-TdR参入实验鉴定其抑制细胞增殖的能力,体外受体竞争结合实验鉴定其受体结合活性。结果以HYNIC为双功能螯合剂,这2条多肽的99Tcm标记率分别为(94.13±1.77)%、(93.79±3.53)%,明显高于S-acetyl-MAG3、GA(D)GG修饰多肽的标记率。经HYNIC修饰后的多肽对肿瘤细胞A549增殖的抑制率约为(32.86±3.36)%、(61.50±4.50)%,与修饰前无明显变化(P>0.05);多肽标记后仍保持了良好的VEGFR结合活性,室温下放置24 h后,放化纯度仍高达90%左右。结论以HYNIC为双功能螯合剂,以TPPTS为协同配体及还原剂,多肽QKRKRKKSRKKH、RKRKRKKSRYIVLS的99 Tcm标记率高,且仍具有良好的抑制肿瘤细胞增殖的能力和VEGFR结合活性。

关键词：血管内皮生长因子双功能螯合剂核素标记肿瘤显像

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