检索结果-内蒙古大学图书馆

第三军医大学学报 2006年第3期28卷 205-207页

作者：邓少丽胡福泉蹇锐饶贤才蒋静程小星第三军医大学基础医学部微生物学教研室重庆市微生物工程实验室重庆400038

目的获得B limp-1纯化蛋白,制备多克隆抗体,为研究浆细胞发育的调控奠定基础。方法采用PCR方法从B limp-1质粒中克隆B limp-1编码前350个氨基酸的基因片段,构建B limp-1与6个H is的融合蛋白原核表达质粒,进行原核表达与蛋白纯化后,免疫... 详细信息

目的获得B limp-1纯化蛋白,制备多克隆抗体,为研究浆细胞发育的调控奠定基础。方法采用PCR方法从B limp-1质粒中克隆B limp-1编码前350个氨基酸的基因片段,构建B limp-1与6个H is的融合蛋白原核表达质粒,进行原核表达与蛋白纯化后,免疫动物,制备B limp-1多抗。采用ELISA方法检测其效价,W estern检验抗体特异性及在骨髓瘤细胞株中的表达。结果构建了表达B limp-1前350个氨基酸的原核表达质粒PQE-B limp-1,经过大肠杆菌表达、镍亲和层析柱纯化,得到分子量约46×103的融合蛋白,免疫家兔后得到多抗血清。ELISA显示抗体效价达1/20 000。W esternb lot结果显示此多克隆抗体与B limp-1蛋白特异性结合,并在骨髓瘤细胞中表达。结论本研究获得B limp-1纯化蛋白,制备了B limp-1多克隆抗体,为进一步研究B limp-1的作用机制及与血液疾病间的关系奠定了基础。

关键词： Blimp-1 原核表达抗体制备

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耐甲氧西林金黄色葡萄球菌PBP2a相互作用蛋白的筛选

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第三军医大学学报 2010年第8期32卷 749-753页

作者：原薇薇杨杰王冬梅胡珍朱军民陈志瑾张俊磊王嘉丽刘佳饶贤才第三军医大学基础医学部微生物学教研室重庆市微生物工程实验室重庆400038

目的通过建立细菌双杂交技术,筛选MRSA中与PBP2a相互作用的蛋白。方法利用PCR扩增,获得PBP2a蛋白转肽酶活性区(TPase)的编码基因,插入pRBR构建成诱饵质粒pBR-PBP2a。提取MRSA N315株基因组DNA,经Sau3AⅠ部分酶切后连接到pRAC质粒的BamH... 详细信息

目的通过建立细菌双杂交技术,筛选MRSA中与PBP2a相互作用的蛋白。方法利用PCR扩增,获得PBP2a蛋白转肽酶活性区(TPase)的编码基因,插入pRBR构建成诱饵质粒pBR-PBP2a。提取MRSA N315株基因组DNA,经Sau3AⅠ部分酶切后连接到pRAC质粒的BamHⅠ位点,获得基因组DNA表达文库;将文库质粒转化入含诱饵质粒pBR-PBP2a的报告菌株KS1,利用细菌双杂交技术进行筛选,获得与诱饵质粒编码的融合蛋白相互作用的猎物,对猎物中编码序列进行DNA测序和生物信息学分析,确定与PBP2a发生相互作用的蛋白质或多肽。结果成功构建了pBR-PBP2a诱饵质粒,可表达PBP2a TPase与大肠埃希菌RNA聚合酶α亚单位N端序列的融合蛋白。所构建的MRSA N315株基因组文库覆盖率达9倍,满足文库筛选的需要。将文库转化含诱饵质粒和报告基因的KS1宿主菌,利用细菌双杂交技术经3次筛选,共获得9个猎物克隆,其报告基因的活性均升高2倍以上,对9个猎物质粒进行了测序,信息学分析表明它们均来自于MRSA N315株基因组,插入片段最长者648 bp,最短者334 bp,9个插入片段中含14个编码基因,其中10个功能未知,1个编码二氢吡啶二羧酸合酶、1个编码二氢吡啶二羧酸还原酶,2个编码染色体解离稳定(SMC)蛋白。9个克隆中介导与PBP2a相互作用的多肽由14～46个氨基酸组成。结论利用细菌双杂交技术从MRSA基因组文库中成功筛选到与PBP2a相互作用的多肽。

关键词：基因组DNA文库 PBP2a蛋白细菌双杂交系统蛋白质间相互作用

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RhoA突变体的构建及稳定表达

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免疫学杂志 2010年第10期26卷 838-841页

作者：宋富强陈炜王嘉丽张俊磊胡晓梅第三军医大学基础医学部微生物学教研室重庆市微生物工程实验室重庆400038

目的构建pCI-V14RhoA、pCI-N19RhoA、pCI-WtRhoA真核表达载体,筛选出稳定表达细胞克隆株,为进一步研究RhoA在登革病毒感染过程的作用奠定工作基础。方法构建活化突变型的pCI-V14RhoA、显性负性突变型pCI-N19RhoA及野生型pCI-WtRhoA真核... 详细信息

目的构建pCI-V14RhoA、pCI-N19RhoA、pCI-WtRhoA真核表达载体,筛选出稳定表达细胞克隆株,为进一步研究RhoA在登革病毒感染过程的作用奠定工作基础。方法构建活化突变型的pCI-V14RhoA、显性负性突变型pCI-N19RhoA及野生型pCI-WtRhoA真核表达载体,稳定转染至ECV304细胞,通过间接免疫荧光染色和免疫印迹实验进行鉴定。结果经PCR扩增、酶切和测序验证,重组质粒pCI-WtRhoA、pCI-V14RhoA、pCI-N19RhoA构建正确;经间接免疫荧光染色和免疫印迹实验验证,稳定表达细胞克隆株命名为ECVWtRhoA、ECVV14RhoA、ECVN19RhoA。结论成功建立了真核表达质粒pCI-WtRhoA、pCI-V14RhoA、pCI-N19RhoA;成功建立了稳定表达细胞克隆株ECVWtRhoA、ECVV14RhoA、ECVN19RhoA,为后续研究积累了有价值的实验资料。

关键词：病毒细胞骨架 RhoA

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登革病毒感染人原代树突状细胞(CD209,-139A/-336A)模型的建立

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第三军医大学学报 2017年第4期39卷 323-327页

作者：杨裔方昕胡珍杨杰袁吉振尚伟龙饶贤才第三军医大学基础医学部微生物学教研室重庆市微生物工程实验室重庆400038

目的建立以人原代树突状细胞(dendritic cells,DCs)为宿主的登革病毒(dengue virus,DENV)感染模型。方法采集基因型为CD209,-139A/-336A的人抗凝血标本,分离获得DCs前体细胞,利用rh GM-CSF及rh IL-4诱导,获得未成熟DCs。瑞氏染色鉴定DC... 详细信息

目的建立以人原代树突状细胞(dendritic cells,DCs)为宿主的登革病毒(dengue virus,DENV)感染模型。方法采集基因型为CD209,-139A/-336A的人抗凝血标本,分离获得DCs前体细胞,利用rh GM-CSF及rh IL-4诱导,获得未成熟DCs。瑞氏染色鉴定DCs的形态,流式细胞术鉴定DCs的分化效率,淋巴细胞增殖实验鉴定DCs的生物学功能。以I型登革病毒GZ2002株为模式病毒进行病毒感染实验,建立并评估以人原代DCs为宿主的登革病毒感染模型。结果分离获得的DCs前体细胞经细胞因子刺激后成功分化为未成熟DCs,分化效率高达90%。获得的DCs具有典型的细胞形态及生物学功能,可有效刺激淋巴细胞增殖。登革病毒GZ2002株能成功感染诱导获得的原代DCs,促进DCs成熟,并复制产生感染性子代病毒,证明细胞感染模型成功建立。结论成功建立以DCs为宿主的登革病毒感染模型。

关键词：登革病毒树突状细胞细胞模型 CD209

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IFN-β基因启动子调控区域的分析及IRF-3报告基因的构建

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第三军医大学学报 2006年第9期28卷 896-899页

作者：蒋静胡福泉蹇锐张伟邓少丽程小星第三军医大学基础医学部微生物学教研室重庆市微生物工程实验室重庆400038

目的对IRF-3的主要靶基因———小鼠IFN-β基因启动子区域进行分析并构建IRF-3报告基因载体。方法将小鼠IFN-β基因启动子全序列以及不同截短片段克隆到无启动子的pGF3basic/enhancer质粒中,以EGFP为报告基因,转染小鼠Raw264.7巨噬细胞... 详细信息

目的对IRF-3的主要靶基因———小鼠IFN-β基因启动子区域进行分析并构建IRF-3报告基因载体。方法将小鼠IFN-β基因启动子全序列以及不同截短片段克隆到无启动子的pGF3basic/enhancer质粒中,以EGFP为报告基因,转染小鼠Raw264.7巨噬细胞系后观察细胞对LPS刺激的反应。结果IFN-β启动子PRD调控区域上游序列、PRD I区,PRD II区和PRD IV区缺失后,LPS同样能诱导EGFP报告基因的表达。只保留PRD区及IFN-β启动子核心区的载体转染Raw264.7细胞后,可以在LPS刺激下诱导EGFP报告基因的高表达。结论构建了能检测IRF-3活性的报告基因载体,为进一步研究LPS激活IRF-3的信号转导通路奠定了基础。

关键词： IRF-3 IFN-β 启动子调控元件报告基因

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通过生物信息学技术预测铜绿假单胞菌噬菌体内溶素的作用机制

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第三军医大学学报 2008年第9期30卷 787-790页

作者：孙卫忠胡晓梅饶贤才谭银玲陈志谨丛延广胡福泉第三军医大学基础医学部微生物学教研室重庆市微生物工程实验室重庆400038

目的对20种铜绿假单胞菌噬菌体基因组中可能的内溶素基因进行生物信息学分析,探讨其可能的作用机制。方法采用开放阅读框预测、同源检索、多重序列比对、蛋白质模型自动匹配等方法预测可能的内溶素及其内溶素相关基因。结果通过铜绿假... 详细信息

目的对20种铜绿假单胞菌噬菌体基因组中可能的内溶素基因进行生物信息学分析,探讨其可能的作用机制。方法采用开放阅读框预测、同源检索、多重序列比对、蛋白质模型自动匹配等方法预测可能的内溶素及其内溶素相关基因。结果通过铜绿假单胞菌噬菌体基因组进行分析,新发现8种内溶素基因和2种穴蛋白基因,对新发现基因的类型做了相关推定。结论利用生物信息学手段分析已知序列,可以迅速、方便、有效地确定未知基因的功能及作用方式。

关键词：噬菌体内溶素穴蛋白生物信息分析

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铜绿假单胞菌噬菌体PaP1内溶素基因克隆、表达及活性分析

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第三军医大学学报 2008年第13期30卷 1268-1271页

作者：孙卫忠胡晓梅饶贤才谭银玲陈志谨丛延广胡福泉第三军医大学基础医学部微生物学教研室重庆市微生物工程实验室重庆400038

目的构建铜绿假单胞菌噬菌体内溶素重组原核表达载体,检测重组蛋白的酶学活性及抑菌活性。方法利用重组技术将铜绿假单胞菌裂解性噬菌体PaP1内溶素基因构建到表达载体pQE31中,并在大肠杆菌M15(pREP4)中诱导表达,通过非变性方法纯化重组... 详细信息

目的构建铜绿假单胞菌噬菌体内溶素重组原核表达载体,检测重组蛋白的酶学活性及抑菌活性。方法利用重组技术将铜绿假单胞菌裂解性噬菌体PaP1内溶素基因构建到表达载体pQE31中,并在大肠杆菌M15(pREP4)中诱导表达,通过非变性方法纯化重组融合蛋白,利用酶谱电泳、抑菌实验等技术检测酶学活性及抑菌活性。结果酶谱电泳方法结果显示重组融合蛋白对铜绿假单胞菌细胞壁肽聚糖有降解作用,抑菌活性检测结果显示重组融合蛋白对金黄色葡萄球菌有一定的抑菌效果。结论该研究从实验方面证实了噬菌体PaP1内溶素基因的生物学功能。

关键词：噬菌体内溶素基因表达活性鉴定

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人sCR1结合C3b结构域基因的克隆及在大肠杆菌中高效表达

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第三军医大学学报 2005年第15期27卷 1551-1554页

作者：罗雪汪正清第三军医大学基础医学部微生物学教研室重庆市微生物工程实验室重庆400038

目的克隆表达人可溶性补体受体1型(sCR1)结合C3b结构域基因。方法从外周血单核细胞中提取总RNA,RT-PCR克隆编码sCR1-SCR15-18的cDNA,连接pMD-18T载体进行DNA序列分析,再亚克隆pET32原核表达载体,构建pET32-sCR1-SCR15-18重组表达载体,转... 详细信息

目的克隆表达人可溶性补体受体1型(sCR1)结合C3b结构域基因。方法从外周血单核细胞中提取总RNA,RT-PCR克隆编码sCR1-SCR15-18的cDNA,连接pMD-18T载体进行DNA序列分析,再亚克隆pET32原核表达载体,构建pET32-sCR1-SCR15-18重组表达载体,转化BL21菌,用IPTG诱导表达,表达产物通过免疫印迹实验鉴定。结果获得了预期的扩增目的片段,成功构建了pMD-18T重组克隆载体,核苷酸测序结果与GenBank登录的人sCR1-SCR15-18 cD-NA序列一致。成功的构建了原核表达载体pET32-sCR1-SCR15-18,目的蛋白的表达量占菌体总蛋白的40%,并在菌体内形成包涵体。免疫印迹实验显示,在分子量约43×103处出现单一条带的阳性结果。结论从单核细胞中克隆出sCR1-SCR15-18片段基因,人sCR1-SCR15-18在大肠杆菌中得到高效表达。

关键词：可溶性补体Ⅰ型受体反转录多聚酶链式反应互补DNA克隆蛋白质表达

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埃博拉病毒病之病原学

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第三军医大学学报 2015年第4期37卷 282-286页

作者：饶贤才第三军医大学基础医学部微生物学教研室重庆市微生物工程实验室重庆400038

埃博拉病毒病(Ebola virus disease,EVD),以往称埃博拉出血热(Ebola haemorrhagic fever,EHF),是迄今发现的凶猛烈性传染病之一。自1976年发现于非洲的扎伊尔和苏丹后,至今已有8次较大规模的人群流行,均发生在非洲,平均病死率高达67.98%... 详细信息

埃博拉病毒病(Ebola virus disease,EVD),以往称埃博拉出血热(Ebola haemorrhagic fever,EHF),是迄今发现的凶猛烈性传染病之一。自1976年发现于非洲的扎伊尔和苏丹后,至今已有8次较大规模的人群流行,均发生在非洲,平均病死率高达67.98%。EVD的病原体埃博拉病毒(Ebola virus,EBOV)是一种人兽共患病原体,虽然其自然储存宿主尚不完全清楚,但EBOV能造成非人灵长类动物(如黑猩猩、猴等)感染,并具有致死性。EBOV在分类上属于丝状病毒科(Filoviridae)的埃博拉病毒属(Ebolavirus),属内有5个种。各种间的毒力存在差异,以扎伊尔埃博拉病毒(Zaire-EBOV)致病性最强,也是引起2014年西非大规模流行的元凶。EBOV呈丝状,形态多样,以长丝分枝状为常见;病毒体由核心、核衣壳和包膜3部分构成,病毒基因组为单股负链RNA,可编码7种结构蛋白,在病毒复制、感染和致病中发挥重要作用。EBOV主要通过接触传播,目前对其致病机制尚不完全清楚。EBOV为生物危害度最高的4级病原体,与活病毒相关的检验和实验必须在生物安全4级(BSL-4)实验室中进行,其感染的临床诊断以检测血清中抗体、抗原和核酸为主,实时荧光定量反转录PCR检测阳性可作出诊断。EVD尚无特效治疗方法,疫苗尚在研制之中,临床上以辅助性支持疗法为主。

关键词：埃博拉病毒病埃博拉病毒生物学特性致病性检验

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革兰阴性菌基因快速失活载体的构建及其应用

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第三军医大学学报 2009年第22期31卷 2240-2242页

作者：龚明福滕亮张金龙黎庶胡晓梅陈志瑾熊坤丛延广第三军医大学基础医学部微生物学教研室重庆市微生物工程实验室重庆400038

目的构建适用于革兰阴性菌的快速基因失活载体系统并进行初步应用。方法应用分子克隆技术构建快速基因失活载体系统。载体成分主要包括:π蛋白依赖性复制起点ori R6K;编码接合转移的mob片段;多克隆位点序列;含有2个XcmⅠ酶切位点的T载... 详细信息

目的构建适用于革兰阴性菌的快速基因失活载体系统并进行初步应用。方法应用分子克隆技术构建快速基因失活载体系统。载体成分主要包括:π蛋白依赖性复制起点ori R6K;编码接合转移的mob片段;多克隆位点序列;含有2个XcmⅠ酶切位点的T载体形成片段以及多种耐药片段,包括Chl(氯霉素抗性)、Tet(四环素抗性)、Km(卡那霉素抗性),获得的载体分别命名为EK3-Chl、EK3-Tet、EK3-Km。采用构建的EK3-Tet载体对弗氏枸橼酸杆菌的yeeZ基因进行插入突变,以验证其有效性。通过XcmⅠ酶切EK3-Tet质粒形成T载体状态,将PCR扩增得到的两端截短的yeeZ基因与该T载体直接连接,获得的质粒采用接合方式转移到弗氏枸橼酸杆菌ATCC8090中以实现整合,双抗培养基筛选整合突变株,对获得的突变株进行鉴定和形态观察。结果成功构建了EK3-Chl、EK3-Tet和EK3-Km,并对yeeZ基因进行插入突变获得突变株,步骤简便,工作周期短。结论上述构建的载体系统能够对革兰阴性菌进行目的基因的快速插入失活,该载体可在细菌基因功能研究中得到一定的应用。

关键词：载体基因失活单交叉同源重组

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