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第三军医大学学报 2006年第3期28卷 205-207页

作者：邓少丽胡福泉蹇锐饶贤才蒋静程小星第三军医大学基础医学部微生物学教研室重庆市微生物工程实验室重庆400038

目的获得B limp-1纯化蛋白,制备多克隆抗体,为研究浆细胞发育的调控奠定基础。方法采用PCR方法从B limp-1质粒中克隆B limp-1编码前350个氨基酸的基因片段,构建B limp-1与6个H is的融合蛋白原核表达质粒,进行原核表达与蛋白纯化后,免疫... 详细信息

目的获得B limp-1纯化蛋白,制备多克隆抗体,为研究浆细胞发育的调控奠定基础。方法采用PCR方法从B limp-1质粒中克隆B limp-1编码前350个氨基酸的基因片段,构建B limp-1与6个H is的融合蛋白原核表达质粒,进行原核表达与蛋白纯化后,免疫动物,制备B limp-1多抗。采用ELISA方法检测其效价,W estern检验抗体特异性及在骨髓瘤细胞株中的表达。结果构建了表达B limp-1前350个氨基酸的原核表达质粒PQE-B limp-1,经过大肠杆菌表达、镍亲和层析柱纯化,得到分子量约46×103的融合蛋白,免疫家兔后得到多抗血清。ELISA显示抗体效价达1/20 000。W esternb lot结果显示此多克隆抗体与B limp-1蛋白特异性结合,并在骨髓瘤细胞中表达。结论本研究获得B limp-1纯化蛋白,制备了B limp-1多克隆抗体,为进一步研究B limp-1的作用机制及与血液疾病间的关系奠定了基础。

关键词： Blimp-1 原核表达抗体制备

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噬菌体PaP3推定基因tls核酸内切酶活性的初步验证

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解放军医学杂志 2006年第3期31卷 196-198页

作者：申晓冬胡福泉李明胡晓梅周莹冰张克斌第三军医大学基础医学部微生物学教研室重庆400038 新桥医院医学实验技术中心

目的对BLAST推定的铜绿假单胞菌噬菌体PaP3的tls基因功能进行实验验证。方法采用PCR方法从噬菌体PaP3基因组扩增出tls基因,克隆至pMD18-T载体中,再经酶切纯化后将目的基因插入表达载体pQE31,转化入大肠杆菌JM109,IPTG诱导表达目的蛋白,... 详细信息

目的对BLAST推定的铜绿假单胞菌噬菌体PaP3的tls基因功能进行实验验证。方法采用PCR方法从噬菌体PaP3基因组扩增出tls基因,克隆至pMD18-T载体中,再经酶切纯化后将目的基因插入表达载体pQE31,转化入大肠杆菌JM109,IPTG诱导表达目的蛋白,超声裂菌后收集包涵体,并用裂解缓冲液溶解包涵体蛋白。然后利用Ni-NTA亲合层析纯化蛋白,通过透析使H6-TLS复性。最后构建含有末端酶大亚基酶切位点的底物质粒pMD-cos,检测复性蛋白活性。结果通过上述方法,成功构建了pQE-tls表达载体,融合蛋白H6-TLS表达量占菌体总量的30%。同时成功构建了目的蛋白的底物质粒pMD-cos。经由亲和层析初步纯化及透析复性后,H6-TLS可检测出核酸内切酶的活性,能将底物质粒部分线性化。结论成功地获得了具有内切酶活性的H6-TLS融合蛋白,为tls基因的认证提供了实验证据,为进一步鉴定和利用该基因奠定了基础。

关键词：末端酶大亚单位细菌噬菌体PaP3 基因表达

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乳腺癌miRNAs表达谱检测及初步分析

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第三军医大学学报 2006年第22期28卷 2209-2212页

作者：廖荣霞孙建国张亮陈敏陈彬娄桂予周度金陈正堂第三军医大学基础医学部生物化学与分子生物学教研室重庆400038 第三军医大学新桥医院肿瘤科北京博奥生物芯片有限责任公司北京102206

目的制作哺乳动物micro RNAs(miRNAs)检测微阵列,筛选乳腺癌miRNAs表达谱并进行初步分析。方法利用已知的人及小鼠的miRNAs序列,设计了496条探针,制作miRNAs微阵列并验证其可靠性;培养乳腺癌细胞株MCF-7和正常乳腺上皮细胞株MCF-10A,分... 详细信息

目的制作哺乳动物micro RNAs(miRNAs)检测微阵列,筛选乳腺癌miRNAs表达谱并进行初步分析。方法利用已知的人及小鼠的miRNAs序列,设计了496条探针,制作miRNAs微阵列并验证其可靠性;培养乳腺癌细胞株MCF-7和正常乳腺上皮细胞株MCF-10A,分别抽提细胞总RNA,分离小分子RNA,经T4RNA连接酶荧光标记后与微阵列杂交,通过芯片扫描和数据分析,获得乳腺癌miRNAs表达谱。结果成功制作哺乳动物miRNAs微阵列,筛选获得57个乳腺癌相关miRNAs,其中,29个为低表达,28个为高表达。结论建立了哺乳动物miRNAs检测微阵列的技术平台,并筛选到乳腺癌miRNAs表达谱,为进一步研究其在乳腺癌发病机制中的作用打下基础。

关键词： miRNAs 微阵列乳腺癌

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难测序噬菌体基因组PaP1的大片段克隆及测序

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第三军医大学学报 2006年第6期28卷 539-542页

作者：李明申晓冬丛延广谭银玲饶贤才胡福泉第三军医大学基础医学部微生物学教研室重庆市微生物工程重点实验室重庆400038

目的采用大片段克隆策略对难测序铜绿假单胞菌噬菌体PaP1基因组进行克隆及测序。方法用限制性内切酶AatⅡ将噬菌体PaP1基因组DNA切成几个大片段,分别进行末端修饰后与线性化的大片段克隆载体pYLTAC7连接,将连接产物电转化感受态细胞,筛... 详细信息

目的采用大片段克隆策略对难测序铜绿假单胞菌噬菌体PaP1基因组进行克隆及测序。方法用限制性内切酶AatⅡ将噬菌体PaP1基因组DNA切成几个大片段,分别进行末端修饰后与线性化的大片段克隆载体pYLTAC7连接,将连接产物电转化感受态细胞,筛选阳性克隆进行测序。结果AatⅡ将PaP1基因组切成8个片段,通过大片段克隆共获得3个阳性克隆,测出插入片段大小分别为9 805、8 335 bp和3 465 bp,使该难测序基因组的测出量达到47 757 bp。结论大片段克隆策略能够克服鸟枪法测序的不足,将有望获得噬菌体PaP1的全基因组序列。

关键词：大片段克隆噬菌体基因组测序 PaP1

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中药地黄饮子对老龄大鼠海马SYP、ERK蛋白表达的影响

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第三军医大学学报 2006年第21期28卷 2146-2148页

作者：吴喜贵胡荣第三军医大学基础医学部神经生物学教研室重庆市神经科学研究所重庆400038

目的观察中药地黄饮子对老龄大鼠海马突触泡膜素(synaptophysin,SYP)、细胞外信号调节激酶(extracel-lular regulated protein,ERK)表达的影响,探讨其对提高学习记忆、延缓脑老化的功效及机制。方法将老龄大鼠分为对照组、低、中和高剂... 详细信息

目的观察中药地黄饮子对老龄大鼠海马突触泡膜素(synaptophysin,SYP)、细胞外信号调节激酶(extracel-lular regulated protein,ERK)表达的影响,探讨其对提高学习记忆、延缓脑老化的功效及机制。方法将老龄大鼠分为对照组、低、中和高剂量组每天灌服地黄饮子(对照组灌服生理盐水)连续30d。在此基础上进行Morris水迷宫实验,免疫组化和Western blot方法检测海马SYP、ERK的表达。结果给药各组与对照组比较,Morris水迷宫中寻找到平台的逃避潜伏期显著降低(P<0.01),平台所在象限区域游泳的时间及距离百分比均明显高于对照组(低剂量组P<0.05,中、高剂量组P<0.01)。免疫组化、Western blot检测海马SYP、ERK蛋白表达较对照组均有明显增加。结论中药地黄饮子能够提高老龄大鼠的学习记忆、延缓脑老化,其作用机制可能与SYP、ERK蛋白表达增加有关。

关键词：地黄饮子学习记忆脑老化 SYP ERK

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低压缺氧对大鼠海马CA1区神经元P2X受体表达的影响

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第三军医大学学报 2006年第23期28卷 2302-2305页

作者：赵延东程赛宇张金海吴喜贵杨忠阮怀珍第三军医大学基础医学部神经生物学教研室重庆市神经科学研究所重庆400038

目的研究P2X受体各亚型在不同年龄大鼠海马CA1区的表达及低压缺氧的影响。方法应用低压缺氧动物模型,结合免疫组化技术,对大鼠海马CA1区P2X受体进行染色和细胞记数,观测P2X2、4、6受体亚型的表达及缺氧的影响。结果P2X2、4、6受体亚型... 详细信息

目的研究P2X受体各亚型在不同年龄大鼠海马CA1区的表达及低压缺氧的影响。方法应用低压缺氧动物模型,结合免疫组化技术,对大鼠海马CA1区P2X受体进行染色和细胞记数,观测P2X2、4、6受体亚型的表达及缺氧的影响。结果P2X2、4、6受体亚型在大鼠海马CA1区有大量的表达,且受体表达量与中枢神经系统的发育有关;低压缺氧使各个受体亚型的表达上调。结论大鼠海马有P2X受体多个亚型的广泛表达,而低压缺氧使大鼠海马CA1区P2X受体的表达增加。

关键词：缺氧 P2X受体海马免疫组化

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不同组织膜蛋白及二甲基亚砜对小脑颗粒细胞突起生长的影响

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第三军医大学学报 2006年第3期28卷 189-191页

作者：邓其跃李淑蓉蔡文琴苏炳银第三军医大学基础医学部神经生物学教研室重庆市神经科学研究所重庆400038

目的探讨不同组织膜蛋白提取物和二甲基亚砜对大鼠小脑颗粒细胞(CGC)突起生长的影响。方法提取成年大鼠肝、坐骨神经和脑白质的组织膜蛋白包被盖片,接种CGC于盖片上,同时将二甲基亚砜(DMSO)作为添加剂加入培养液,观察CGC突起的生长。结... 详细信息

目的探讨不同组织膜蛋白提取物和二甲基亚砜对大鼠小脑颗粒细胞(CGC)突起生长的影响。方法提取成年大鼠肝、坐骨神经和脑白质的组织膜蛋白包被盖片,接种CGC于盖片上,同时将二甲基亚砜(DMSO)作为添加剂加入培养液,观察CGC突起的生长。结果①脑白质膜蛋白能明显抑制CGC突起的生长,随浓度增加抑制效应更加明显;坐骨神经膜蛋白对CGC突起生长抑制不明显,肝组织膜蛋白则能促进突起生长;②随DMSO浓度升高CGC突起生长逐渐受到抑制,当DMSO浓度小于1%时,CGC突起长度与对照对照差别不大。结论脑白质膜蛋白对CGC突起生长有明显抑制作用,而DMSO添加到培养液中在低浓度时不会显著影响神经元突起生长,可用于检测药物及疏水性分子对体外培养的神经细胞突起生长的作用。

关键词：小脑颗粒细胞(CGC) 膜蛋白二甲基亚砜(DMSO) 突起生长

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大鼠星形胶质细胞源性的雌激素对突触传递功能调节的实验研究

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第三军医大学学报 2006年第4期28卷 279-283页

作者：胡荣吴喜贵杨忠蔡文琴第三军医大学基础医学部神经生物学教研室重庆市神经科学研究所重庆400038

目的观察星形胶质细胞(ASTROCYTE,AST)源性的雌激素对纯培养大脑皮层神经元突触传递的用及可能的机制。方法以新生大鼠皮层神经元纯培养为模型,将实验分成6组神经元纯培养组(P);ACM培养组(A);AST和神经元混合培养组(M);雌激素培养组(E);... 详细信息

目的观察星形胶质细胞(ASTROCYTE,AST)源性的雌激素对纯培养大脑皮层神经元突触传递的用及可能的机制。方法以新生大鼠皮层神经元纯培养为模型,将实验分成6组神经元纯培养组(P);ACM培养组(A);AST和神经元混合培养组(M);雌激素培养组(E);ACM+TAMOXIFEN(雌激素受体阻断剂)培养组(A+T);TAMOXIFEN培养组(T),应用膜片钳技术和FM4-64标记的突触囊泡释放试验等方法观测各组突触传递功能和囊泡释放动力学的差别。结果各实验组微小性突触后电流(MPSCS)的平均幅度和频率分别为(20·5±2)PA,(13±4)MIN-1;(29·1±3)PA,(73±16)MIN-1;(31·3±3)PA,(78±20)MIN-1;(30·2±3)PA,(76±18)MIN-1;(24·5±2)PA,(35±10)MIN-1;(22·1±2)PA,(37±10)MIN-1。显示ACM能增加培养神经元的突触传递功能,外源性雌激素可基本模拟ACM的效应。TAMOX-IFEN能大部阻断ACM促突触传递的效应。FM4-64标记的突触囊泡释放试验表明ACM源性的雌激素促进突触传导的效应,至少可以通过突触前机制-增强囊泡的释放起作用。结论体外培养新生大鼠大脑皮层AST分泌的雌激素可能主要通过雌激素受体介导其调节神经元突触传递的作用。

关键词：星形胶质细胞突触传递雌激素雌激素受体膜片钳技术

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雌激素对癫痫大鼠海马区胶质细胞增生和突触可塑性变化的影响

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第三军医大学学报 2006年第4期28卷 327-330页

作者：魏璐蔡文琴杨忠第三军医大学基础医学部神经生物学教研室重庆市神经科学研究所重庆400038

目的观察雌激素(ESTROGEN,E2)对戊四氮(PENTYLENETETRAZOL,PTZ)致痫大鼠海马区胶质细胞增生和突触可塑性变化的影响。方法实验动物分成正常对照组、PTZ致痫组、E2+PTZ致痫组和E2+TAMOXIFEN致痫组,采用PTZ慢性癫痫点燃模型,观察各实验分... 详细信息

目的观察雌激素(ESTROGEN,E2)对戊四氮(PENTYLENETETRAZOL,PTZ)致痫大鼠海马区胶质细胞增生和突触可塑性变化的影响。方法实验动物分成正常对照组、PTZ致痫组、E2+PTZ致痫组和E2+TAMOXIFEN致痫组,采用PTZ慢性癫痫点燃模型,观察各实验分组大鼠行为学表现,并用免疫组化染色和计算机图像分析技术观察胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)和突触素(SYNAPTOPHYSIN,P38)表达水平的改变。结果E2+PTZ致痫组大鼠癫痫发作时间较PTZ致痫组早,发作程度普遍较高;致痫各组均观察到突触素阳性染色数目增多和胶质细胞增生,以海马CA2、CA3区和齿状回门区较为明显,与正常对照组比较,有显著差异(P<0.01);E2+PTZ致痫组较PTZ致痫组和TAMOXIFEN干预致痫组亦有显著差异(P<0.01)。结论PTZ点燃的癫痫大鼠海马区发生突触可塑性改变和反应性星形胶质细胞增生,可能与异常放电回路形成,大脑兴奋性放电增加,最终诱发癫痫发作有关;星形胶质细胞衍生性雌激素可能在促进癫痫的发作并使这一改变更加明显中起到一定作用,而雌激素受体拮抗剂能部分抑制这种作用;提示雌激素与癫痫发作时突触形成及胶质细胞的增生间存在着一定的联系。

关键词：癫痫雌激素星型胶质细胞突触素海马

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P物质刺激下脊髓星形胶质细胞活化中磷酸化P38丝裂素活化蛋白激酶和c-fos的表达及作用

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第三军医大学学报 2006年第21期28卷 2163-2166页

作者：张恒周占松刘丽梅杨忠宋波第三军医大学西南医院全军泌尿外科中心重庆400038 第三军医大学病理学研究所重庆400038 第三军医大学基础医学部神经生物学教研室重庆市神经科学研究所重庆400038

目的观察P物质(substance P,SP)作用下,脊髓星形胶质细胞中P38丝裂素活化蛋白激酶的磷酸化(P-P38MAPK)和c-fos的表达,及P38MAPK磷酸化对炎性因子分泌的影响。方法采用体外培养脊髓星形胶质细胞,施加SP刺激,分别采用Western blot和RT-PC... 详细信息

目的观察P物质(substance P,SP)作用下,脊髓星形胶质细胞中P38丝裂素活化蛋白激酶的磷酸化(P-P38MAPK)和c-fos的表达,及P38MAPK磷酸化对炎性因子分泌的影响。方法采用体外培养脊髓星形胶质细胞,施加SP刺激,分别采用Western blot和RT-PCR检测P38MAPK磷酸化和c-fos表达的变化,ELISA法检测SB203580阻断P38MAPK磷酸化对炎性因子TNF-α、IL-1β、NO分泌的影响。结果在SP(10-7mol/L)刺激下,P38MAKP在15、30、45、60min时均明显磷酸化,与对照组相比有显著性差异(P<0.05,P<0.01),磷酸化高峰在45min;SP(10-7mol/L)作用下c-fos表达明显,30min、1、3、6h均显著高于对照组(P<0.05,P<0.01),3h达到高峰;SP(10-7mol/L)刺激脊髓星形胶质细胞明显分泌炎性因子IL-1β、TNF-α和NO(P<0.01),SB203580阻断P38MAKP信号通路后TNF-α和NO的分泌下降(P<0.01),IL-1β的分泌在阻断前后无显著性差异(P>0.05)。结论SP作用下脊髓星形胶质细胞中P38MAPK和c-fos信号通路激活,P38MAPK磷酸化参与了SP作用下脊髓星形胶质细胞的活化及炎性因子的分泌,与星形胶质细胞在脊髓中枢对痛觉的调控有关。

关键词：星形胶质细胞慢性疼痛 SP IL-1β NO TNF—α P38MAPK c-fns

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