检索结果-内蒙古大学图书馆

Perilipin 2在小鼠肝脏CGI-58特异性敲除所致肝脏微泡型脂肪变性中的作用

陆军军医大学学报 2024年第15期46卷 1701-1712页

作者：张艺馨李杰万小勤蒋孝清陈江慧邓芳李旻典张倩包鑫余张志辉陆军军医大学(第三军医大学)第一附属医院心血管内科代谢生物钟与心血管疾病中心重庆400038 陆军军医大学(第三军医大学)第一附属医院老年心脑血管疾病教育部重点实验室重庆400038 重庆医科大学基础医学院重庆400016 陆军军医大学(第三军医大学)高原军事医学系病理生理学教研室重庆400038 陆军军医大学(第三军医大学)第一附属医院全科医学科重庆400038

目的探究Perilipin 2(Plin2)在肝脏CGI-58特异性敲除所致脂肪肝的作用,并比较Plin2和Plin3在脂滴生成和脂质蓄积的作用效能。方法将20只7周龄CGI-58^(Flox/Flox)小鼠(雄鼠10只,雌鼠10只)根据性别采用完全随机分组法分为对照组(NC组,n=5... 详细信息

目的探究Perilipin 2(Plin2)在肝脏CGI-58特异性敲除所致脂肪肝的作用,并比较Plin2和Plin3在脂滴生成和脂质蓄积的作用效能。方法将20只7周龄CGI-58^(Flox/Flox)小鼠(雄鼠10只,雌鼠10只)根据性别采用完全随机分组法分为对照组(NC组,n=5,注射靶向肝脏实现过表达Cre蛋白及对照Micro-RNA的腺相关病毒)和实验组(Mi-KD组,n=5,注射靶向肝脏实现过表达Cre蛋白及靶向Plin2的Micro-RNA的腺相关病毒),记录小鼠体质量变化,检测小鼠代谢相关表型和肝脏病理学的差异,RT-qPCR检测小鼠肝脏脂质代谢和胆固醇代谢相关基因的改变;以AML-12小鼠肝细胞作为细胞模型,构建SiRNA实现AML-12细胞Plin2/Plin3敲低,Bodipy染色和酶比色法检测对比正常培养和OA诱导下Plin2/Plin3敲低后AML-12细胞脂滴生成和脂质蓄积。结果Mi-KD小鼠肝脏中的PLIN2蛋白水平降低了99%以上;Mi-KD缓解了CGI-58特异性敲除雌鼠的肝肿大(P=0.0195)和肝细胞损伤(P=0.0004),降低了组织学NAS评分(P=0.0002)和肝脏甘油三酯含量(P=0.0166),显著改善了肝脏CGI-58特异性敲除所致的肝脏微泡型脂肪变性;敲低Plin2使AML-12细胞内甘油三酯含量呈下降趋势,敲低Plin3显著降低AML-12细胞内甘油三酯含量(P=0.0014);在OA诱导下,Plin2/Plin3敲低均显著降低OA诱导的AML-12细胞内甘油三酯的蓄积(P<0.05)。结论肝脏Plin2在CGI-58敲除所致的微泡型脂肪变性的发展过程中至关重要,Plin2和Plin3均参与肝细胞脂滴生成与脂质蓄积,且Plin3的作用强于Plin2。

关键词：肝脏微泡型脂肪变性围脂滴包被蛋白2 比较鉴定基因-58 钱林-多尔夫曼综合征脂滴

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负载锌离子的复合水凝胶对糖尿病小鼠全层皮肤缺损感染创面的作用及机制

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中华烧伤与创面修复杂志 2024年第9期40卷 866-875页

作者：潘泽平石云龙袁志强彭毅志安中莲乐率龚雅利陆军军医大学(第三军医大学)第一附属医院全军烧伤研究所创伤与化学中毒全国重点实验室重庆400038 重庆大学附属江津医院急诊科重庆402260 陆军军医大学(第三军医大学)基础医学院微生物学教研室微生物工程重庆市高校重点实验室重庆400038

目的探讨负载锌离子的复合水凝胶(以下简称含锌水凝胶)对糖尿病小鼠全层皮肤缺损感染创面的作用及其机制。方法该研究为实验研究。制备聚(甘油癸二酸酯)-共-聚乙二醇-共聚-邻苯二酚/季铵化壳聚糖水凝胶(以下简称单纯水凝胶)和在单纯水... 详细信息

目的探讨负载锌离子的复合水凝胶(以下简称含锌水凝胶)对糖尿病小鼠全层皮肤缺损感染创面的作用及其机制。方法该研究为实验研究。制备聚(甘油癸二酸酯)-共-聚乙二醇-共聚-邻苯二酚/季铵化壳聚糖水凝胶(以下简称单纯水凝胶)和在单纯水凝胶的基础上添加锌离子的疏松多孔且具有良好黏附性的固态含锌水凝胶。计算用磷酸盐缓冲液(PBS)浸泡14 d后含锌水凝胶中锌离子的释放率。检测用单纯水凝胶、含锌水凝胶、PBS培养2 h后耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)浓度。利用酶标仪检测单纯水凝胶、含锌水凝胶、PBS对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)的清除率,反映清除氧自由基能力。测量用单纯水凝胶、含锌水凝胶、PBS培养24 h后人脐静脉内皮细胞(HUVEC)形成的血管长度。采用细胞计数试剂盒8检测用单纯水凝胶、含锌水凝胶、PBS培养24 h后L929细胞的活力。将小鼠红细胞悬液分为用PBS处理的空白对照组和用相应溶液处理的单纯水凝胶组、含锌水凝胶组和Triton X-100组,利用酶标仪检测孵育2 h后红细胞的溶血情况并计算溶血率。以上实验样本数均为3。取21只6~8周龄雄性C57BL/6J小鼠,在背部脊柱对称位置各制备1个用MRSA感染的全层皮肤缺损创面。将小鼠分为滴加PBS的空白对照组和用相应水凝胶处理的单纯水凝胶组和含锌水凝胶组。伤后3 d,检测空白对照组、单纯水凝胶组、含锌水凝胶组小鼠创面中的细菌浓度,样本数为4。于伤后0(即刻)、3、7、14 d,大体观察小鼠创面感染情况并计算伤后3、7、14 d创面愈合率,样本数为5。伤后14 d,行苏木精-伊红染色和Masson染色分别检测小鼠创面中的新生上皮和胶原生成情况,行免疫荧光染色检测小鼠创面中血管新生及M2型巨噬细胞分布情况。结果浸泡14 d后,含锌水凝胶中锌离子的释放率为(70.5±4.6)%。与用含锌水凝胶比较,用PBS和单纯水凝胶培养2 h后细菌浓度均明显升高(P<0.05)。含锌水凝胶对DPPH的清除率明显高于PBS、单纯水凝胶(P值均<0.05)。与用PBS比较,用含锌水凝胶培养24 h后HUVEC形成的血管长度明显增长(P<0.05)。与用含锌水凝胶比较,用PBS和单纯水凝胶培养24 h后L929细胞的活力均明显降低(P<0.05)。孵育2 h后,与Triton X-100组相比,空白对照组、单纯水凝胶组、含锌水凝胶组红细胞的溶血率均显著降低(P<0.05);而后3组的红细胞溶血率相近(P>0.05)。伤后3 d,含锌水凝胶组小鼠创面中的细菌浓度明显低于空白对照组和单纯水凝胶组(P值均<0.05)。伤后3~14 d,3组小鼠创面均逐渐愈合,含锌水凝胶组小鼠伤后14 d创面基本愈合。伤后7 d,含锌水凝胶组小鼠创面愈合率为(72.4±8.4)%,明显高于空白对照组和单纯水凝胶组的(31.6±6.7)%、(44.7±5.4)%(P值均<0.05)。伤后14 d,含锌水凝胶组小鼠创面愈合率为(92.7±4.3)%,明显高于空白对照组的(73.5±7.4)%,P<0.05。伤后14 d,与空白对照组和单纯水凝胶组相比,含锌水凝胶组小鼠创面的新生表皮长度更长、厚度更厚,胶原沉积更多,新生血管和M2型巨噬细胞分布更丰富。结论含锌水凝胶具有良好的生物相容性、清除氧自由基能力和体内外抗菌效果、促血管生成能力,可持续缓释锌离子,促进创面再上皮化及胶原合成,从而促进小鼠全层皮肤缺损感染创面愈合。

关键词：生物相容性材料水凝胶感染糖尿病,实验性锌离子抗菌性创面修复

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虫媒病防控研究与卫勤保障

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陆军军医大学学报 2022年第1期44卷 9-15页

作者：徐文岳徐小峰陆军军医大学(第三军医大学)基础医学院病原生物学教研室重庆400038 陆军军医大学(第三军医大学)基础医学院医学遗传学教研室重庆400038

虫媒病不但是全球公共卫生问题,而且也是影响世界各国军队卫勤保障的重要问题。媒介生物的有效控制和叮咬防护手段的研制能从群体水平上控制和预防各种虫媒病的流行和传播,而针对具体虫媒病的特异性疫苗和药物的研制则能有效预防特定虫... 详细信息

虫媒病不但是全球公共卫生问题,而且也是影响世界各国军队卫勤保障的重要问题。媒介生物的有效控制和叮咬防护手段的研制能从群体水平上控制和预防各种虫媒病的流行和传播,而针对具体虫媒病的特异性疫苗和药物的研制则能有效预防特定虫媒病的感染。虽然目前在媒介生物控制、驱避剂和疟疾疫苗研制等方面取得了显著的进展,但仍然缺乏安全、高效的虫媒病防控手段,有待于在基因驱动改造媒介生物种群、昆虫寻找宿主和机体抗虫媒病原体保护性免疫机制等方面展开深入研究。

关键词：虫媒病媒介生物防控叮咬防护疫苗卫勤保障

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WalK(S221P)突变促进金黄色葡萄球菌荚膜产生的作用研究

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陆军军医大学学报 2023年第23期45卷 2460-2466页

作者：郭祖文饶一凡彭华刚饶贤才陆军军医大学(第三军医大学)基础医学院微生物学教研室重庆400038 重庆大学生物工程学院重庆400030

目的探究WalK(S221P)突变促进金葡菌荚膜产生的作用及可能机制。方法采用转录组测序(RNA-seq)分析WalK(S221P)突变对金葡菌基因表达的影响,采用RT-qPCR检测荚膜合成基因的表达变化。利用荚膜染色和透射电镜观察确认WalK(S221P)突变促进... 详细信息

目的探究WalK(S221P)突变促进金葡菌荚膜产生的作用及可能机制。方法采用转录组测序(RNA-seq)分析WalK(S221P)突变对金葡菌基因表达的影响,采用RT-qPCR检测荚膜合成基因的表达变化。利用荚膜染色和透射电镜观察确认WalK(S221P)突变促进金葡菌荚膜产生的作用,再用RT-qPCR筛选参与介导WalK(S221P)促进荚膜合成的调控分子,通过结合位点分析和凝胶迁移阻滞实验(EMSA)证实WalKR对目标分子的调控作用。结果RNA-seq分析显示WalK(S221P)突变对196个金葡菌基因的表达水平影响显著,其中16个荚膜合成操纵子基因在XN108中的表达均显著上调。RT-qPCR检测显示荚膜合成相关capA,capH和capK在含有WalK(S221P)突变的XN108及K-Newman菌株中分别较回复株XN108-R和野生型Newman菌株显著上调。荚膜染色和透射电镜观察显示XN108的荚膜合成相比于回复株XN108-R明显增多,增厚。RT-qPCR筛选提示WalK(S221P)促进金葡菌荚膜合成可能是通过上调MgrA表达水平实现的,结合位点检索分析及EMSA实验证实WalK激活的WalR具有直接结合mgrA基因调控区的功能。结论金葡菌WalK(S221P)突变具有促进金葡菌荚膜产生的作用,该作用的发挥可能通过上调MgrA的表达而实现。

关键词：金黄色葡萄球菌荚膜二元调控系统WalKR WalK(S221P) MgrA

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左旋棉酚通过下调X连锁凋亡抑制蛋白增强表柔比星抑制肝细胞癌的体外作用

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陆军军医大学学报 2022年第16期44卷 1599-1605页

作者：蒋文斌孙梁博杜烨湘肖云华黎伯胜闫小晶吴亚冉连继勤何凤田陆军军医大学(第三军医大学)基础医学院生物化学与分子生物学教研室重庆400038 陆军军医大学(第三军医大学)药学与检验医学系临床生物化学教研室重庆400038 陆军军医大学(第三军医大学)第一附属医院核医学科重庆400038

目的探讨左旋棉酚增强表柔比星杀伤肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)细胞的作用及可能机制。方法将HCC细胞(Hep3B及HuH7)分为溶剂对照组、左旋棉酚处理组、表柔比星处理组、联合用药组、对照siRNA+表柔比星组、沉默X连锁凋亡抑... 详细信息

目的探讨左旋棉酚增强表柔比星杀伤肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)细胞的作用及可能机制。方法将HCC细胞(Hep3B及HuH7)分为溶剂对照组、左旋棉酚处理组、表柔比星处理组、联合用药组、对照siRNA+表柔比星组、沉默X连锁凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein,XIAP)+表柔比星处理组、对照质粒+联合用药组、过表达XIAP+联合用药组,采用CCK-8方法检测各组细胞存活情况;流式细胞术检测各组细胞凋亡情况;Western blot检测剪切型聚(腺苷二磷酸-核糖)聚合酶[cleaved poly(ADP-ribose)polymerase,Cle-PARP]水平、XIAP水平及真核起始因子4E(eukaryotic initiation factor 4E,eIF4E)磷酸化水平。结果与溶剂对照相比,低浓度的左旋棉酚(5μmol/L)单独处理对HCC细胞存活无明显抑制作用(P>0.05),而将左旋棉酚与表柔比星联合使用后可显著增强表柔比星对HCC细胞的杀伤(P<0.05)、促进HCC细胞的凋亡及对剪切型PARP的诱导,同时还能抑制表柔比星诱导的XIAP上调及eIF4E磷酸化。此外,表柔比星抑制HCC细胞存活及升高剪切型PARP的能力能被沉默XIAP所增强,而被过表达XIAP所抑制。结论左旋棉酚可增强表柔比星抑制HCC细胞存活促进细胞凋亡的能力,其机制可能与抑制XIAP上调和eIF4E磷酸化有关,提示左旋棉酚可作为表柔比星治疗HCC的潜在增敏剂。

关键词：表柔比星左旋棉酚肝细胞癌 X连锁凋亡抑制蛋白真核起始因子4E

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金黄色葡萄球菌巨噬细胞胞内生存关键分泌蛋白筛选体系的构建

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陆军军医大学学报 2024年第8期46卷 815-821页

作者：石姚佳田湉熊廷蓉王于张笑恺邹全明河南大学药学院河南开封475004 陆军军医大学(第三军医大学)药学与检验医学系微生物与生化药学教研室国家免疫生物制品工程技术研究中心重庆400038 陆军军医大学士官学校基础部石家庄050081

目的建立金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,***)巨噬细胞胞内感染状态下分泌蛋白高通量筛选体系,探索金葡菌胞内生存所需关键分泌蛋白。方法利用课题组建立的金葡菌分泌蛋白真核系统表达载体库,通过DNA转染表达技术,得到能够在细... 详细信息

目的建立金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,***)巨噬细胞胞内感染状态下分泌蛋白高通量筛选体系,探索金葡菌胞内生存所需关键分泌蛋白。方法利用课题组建立的金葡菌分泌蛋白真核系统表达载体库,通过DNA转染表达技术,得到能够在细胞内表达金葡菌分泌蛋白的RAW264.7巨噬细胞阵列。金葡菌感染RAW264.7后,清除胞外菌,观察金葡菌胞内生存情况。最后通过构建相应分泌蛋白的过表达及敲除金葡菌验证筛选结果。结果通过探索RAW264.7质粒转染剂量、金葡菌感染复数(multiplicity of infection,MOI)以及感染时间,确立筛选体系的最优质粒转染剂量为1.0μg/孔、MOI为1.0、感染时间为4 h。筛选结果结合相应分泌蛋白过表达和敲除菌株验证,成功筛选出hypothetical protein、Serine protease E等分泌蛋白具有促进胞内金葡菌生存功能。结论成功构建金葡菌巨噬细胞胞内生存关键分泌蛋白筛选体系。

关键词：金黄色葡萄球菌巨噬细胞胞内感染分泌蛋白

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胃印戒细胞癌的H3K27me3沉默子重塑特征及转录调控功能

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陆军军医大学学报 2025年第5期47卷 417-425页

作者：杜艾贝任原锋储召乐刘碧颖李先锋向俊宇陈东风王涛王斌郭海英张璇李玉红陆军军医大学基础医学院细胞生物学教研室重庆陆军特色医学中心(第三军医大学大坪医院)消化内科消化系统肿瘤精准防治重庆市重点实验室重庆重庆市中医院肿瘤科重庆

目的通过表观遗传组学技术,解析胃印戒细胞癌(signet-ring cell carcinoma of the stomach,SRCC)的H3K27me3沉默子的全基因组特征及其对基因转录的调控作用,以阐明SRCC恶性进展的表观调控机制。方法采集2021年1月至2023年12月陆军特色... 详细信息

目的通过表观遗传组学技术,解析胃印戒细胞癌(signet-ring cell carcinoma of the stomach,SRCC)的H3K27me3沉默子的全基因组特征及其对基因转录的调控作用,以阐明SRCC恶性进展的表观调控机制。方法采集2021年1月至2023年12月陆军特色医学中心消化内科35例胃镜样本(正常胃窦/胃体15例,SRCC 20例)。采用以下多组学分析:染色质可及性测序(assay for transposase-accessible chromatin with high-throughput sequencing,ATAC-seq)检测染色质开放区域;染色质靶向捕获测序(cleavage under targets and tagmentation,CUT&Tag)捕获H3K27me3沉默子区域;转录组测序(transcriptome sequencing,RNA-seq)分析转录组。测序于Illumina NovaSeq 6000平台完成(符合深度标准)。通过DESeq2筛选H3K27me3相关差异基因(|Log_(2)FC|>1,FDR<0.05),并通过基因本体论(Gene Oncology,GO)和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)分析进行功能富集,Homer鉴定转录因子基序,Cytoscape构建调控网络,并使用免疫组化进行验证,探讨其调控机制。结果SRCC沉默子主要分布于基因组远端基因间区(占37.06%)。与正常组织相比,SRCC中H3K27me3沉默子信号显著降低(95%CI:1.34~2.30,P=0.007),共鉴定出6257个丢失位点(FDR<0.01)。CUT&Tag和RNA-seq整合分析显示,380个因沉默子丢失而上调的基因显著富集于免疫相关通路,如T细胞受体信号通路(OR=4.2,95%CI:2.8~6.3,P=0.002)。免疫组化验证表明,转录因子EHF表达显著升高(P<0.05)。结论SRCC中存在H3K27me3沉默子重塑现象,转录因子EHF可能在SRCC恶性进展中发挥关键作用。

关键词：胃印戒细胞癌表观遗传组蛋白修饰沉默子 H3K27me3

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基于增强CT图像和Swin Transformer网络的食管癌T分期智能诊断模型的构建与评估

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陆军军医大学学报 2023年第16期45卷 1770-1778页

作者：王润媛陈星材吴蔚姚洁郭美马晋峰曹锡梅粘永健吴毅崔慧林山西医科大学基础医学院组织胚胎学教研室太原030001 陆军军医大学(第三军医大学)生物医学工程与影像医学系数字医学教研室重庆400038 陆军军医大学(第三军医大学)第一附属医院胸外科重庆400038 陆军军医大学(第三军医大学)第一附属医院心外科重庆400038 山西省肿瘤医院普外科太原030013

目的基于增强CT图像和Swin Transformer网络,拟构建食管癌T分期智能诊断模型。方法收集2018年1月至2022年4月在陆军军医大学第一附属医院和山西省肿瘤医院胸外科经病理证实为食管癌的150例患者的45000张术前增强CT图像。经过UperNet Swi... 详细信息

目的基于增强CT图像和Swin Transformer网络,拟构建食管癌T分期智能诊断模型。方法收集2018年1月至2022年4月在陆军军医大学第一附属医院和山西省肿瘤医院胸外科经病理证实为食管癌的150例患者的45000张术前增强CT图像。经过UperNet Swin网络自动分割和肿瘤体积的计算,使用ResNet50、Swin Transformer和VIT 3个网络进行食管癌T分期智能诊断模型的构建。使用精准率、召回率、F1-score、特异度以及阴性预测值(negative predictive value,NPV)等指标在150例内部数据集上评价模型性能,描绘混淆矩阵和ROC曲线。结果在3个食管癌T分期诊断的模型中,Swin Transformer模型结合肿瘤体积、病理信息等特征的分期诊断效果最好,T1~T4期的精准率分别为1.00、0.67、0.83、1.00,AUC为0.861,优于ResNet50和VIT分期诊断模型,它们的精准率分别为0.13、0.27、0.59、0.81和0.03、0.14、0.56、0.75,AUC分别是0.611和0.542。结论与ResNet50和VIT网络比较,Swin Transformer网络能够更精准进行食管癌智能T分期诊断。

关键词：深度学习食管癌增强CT Swin Transformer T分期诊断

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小鼠THBS1基因敲除改善内脏脂肪免疫微环境并抑制结直肠癌腹腔种植转移

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陆军军医大学学报 2023年第18期45卷 1907-1915页

作者：汪腾高源赵昆向远彩缪洪明陆军军医大学(第三军医大学)高原军事医学系病理生理学教研室重庆400038 西南医科大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室四川泸州646000

目的探究血小板反应蛋白1(thrombospondin-1,THBS1)基因敲除对结直肠癌免疫微环境与肿瘤进展的作用。方法构建THBS1基因敲除小鼠,经PCR、琼脂糖凝胶电泳明确小鼠基因型。用THBS1基因野生型(THBS1^(+/+))与THBS1基因敲除(THBS1^(-/-))小... 详细信息

目的探究血小板反应蛋白1(thrombospondin-1,THBS1)基因敲除对结直肠癌免疫微环境与肿瘤进展的作用。方法构建THBS1基因敲除小鼠,经PCR、琼脂糖凝胶电泳明确小鼠基因型。用THBS1基因野生型(THBS1^(+/+))与THBS1基因敲除(THBS1^(-/-))小鼠构建结直肠癌皮下荷瘤与腹腔种植转移模型,观察THBS1基因敲除对小鼠肿瘤生长情况的影响。用流式细胞术检测腹腔种植转移模型中THBS1基因敲除后对结直肠癌附睾脂肪中免疫细胞的变化。结果与THBS1^(+/+)小鼠相比,THBS1^(-/-)小鼠在结肠癌皮下荷瘤模型中肿瘤生长没有差异(P>0.05),而在腹腔种植转移模型中则显著抑制肿瘤生长(P<0.05)。流式细胞术检测结果显示,与THBS1^(+/+)小鼠相比,THBS1基因敲除后腹腔种植转移模型小鼠的附睾脂肪组织中总巨噬细胞比例增高(P<0.01),其中M1型(经典型或促炎型)巨噬细胞比例升高(P<0.01)、M2型(替代活化型或抗炎型)巨噬细胞比例下降(P<0.01);髓源性抑制细胞(myeloid-derived suppressor cells,MDSC)比例下降(P<0.05),其中Ly6C亚群(P<0.01)比例升高,Ly6G亚群比例降低(P<0.05);CD8+T细胞比例显著升高(P<0.01)、CD4^(+)T细胞比例降低(P<0.01)。与THBS1^(+/+)小鼠相比,THBS1基因敲除小鼠外周血总巨噬细胞、M1型巨噬细胞、M2型巨噬细胞比例均无变化(P>0.05);MDSC及ly6C亚群比例无变化(P>0.05),ly6G亚群比例降低(P<0.05);CD8^(+)T细胞比例显著降低(P<0.05)、CD4+T细胞比例无变化(P>0.05)。结论THBS1基因敲除通过增强肿瘤免疫抑制结直肠癌细胞腹腔种植转移。

关键词：血小板反应蛋白1 结直肠癌免疫微环境附睾脂肪

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GraSR通过MurC促进金黄色葡萄球菌中等耐受万古霉素的作用研究

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重庆医科大学学报 2024年第10期49卷 1067-1073页

作者：张柳英李映红简福霞彭华刚陆军特色医学中心重症医学科重庆400042 陆军军医大学/第三军医大学基础医学院微生物学教研室重庆400038

目的:探讨GraS(T136I)突变对万古霉素中等耐受金黄色葡萄球菌(vancomycin-intermediate Staphylococcus aureus,VISA)耐药性的影响及机制。方法:采用同源重组技术将XN108(VISA)的GraS(T136I)突变位点引入到Newman(VSSA)构建突变菌株Newman-GraS(T136I),利用相同的方法在XN108中将突变位点进行回复,构建回复菌株XN108-GraS(I136T),利用E-test法测定各菌株对万古霉素的耐药性,通过透射电子显微镜观察各菌株细胞壁厚度,采用RT-qPCR检测了金葡菌细胞壁肽聚糖合成相关基因在XN108及其突变回复菌株XN108-GraS(I136T)中的表达水平变化,通过LacZ报告系统检测XN108和XN108-GraS(I136T)中murC基因启动子活性,通过结合位点分析和凝胶迁移阻滞实验(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)证实GraSR对murC基因的调控作用。结果:Newman-GraS(T136I)和XN108-GraS(I136T)替换菌株构建成功。回复株XN108-GraS(I136T)对万古霉素的MIC从原来的12μg/mL下降到8μg/mL,突变菌株Newman-GraS(T136I)对万古霉素的MIC从野生株的1.5μg/mL上升到4μg/mL。透射电子显微镜结果显示,XN108-GraS(I136T)的细胞壁(20.097±2.862) nm较野生株XN108(40.283±3.784) nm明显变薄(P=0.000)。通过RT-qPCR实验发现,金葡菌细胞壁肽聚糖合成相关基因murC、murD和mraY在回复菌株XN108-GraS(I136T)中表达下调(P=0.000),且murC的下降水平最多(约1.935倍),LacZ活性检测分析显示XN108中murC基因的启动子活性(2 182.333±104.580)明显强于其在XN108-GraS(I136T)(1 593.333±179.258)中的活性(P=0.008),结合位点检索分析及EMSA实验证实GraS激活的GraR具有直接结合murC基因调控区的功能。结论:金葡菌GraS(T136I)突变具有促进VISA的形成的作用,该作用可能是通过上调细胞壁合成关键基因murC的表达,导致细胞壁增厚来实现的。

关键词：金黄色葡萄球菌万古霉素耐药性 GraSR 细胞壁

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