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重庆微生物学会第九届会员代表大会暨学术年会

作者：饶贤才陈志瑾第三军医大学微生物学教研室重庆市微生物工程实验室

肽抗生素(Peptide antibiotics)或称为抗微生物肽(Antimicrobial peptide,AP)是宿主细胞产生的一类对抗病原体感染的肽类活性物质,是宿主天然免疫防御系统的重要组成部分。迄今为止,已从植物、被囊动物、昆虫、两栖动物和哺乳动物中分... 详细信息

肽抗生素(Peptide antibiotics)或称为抗微生物肽(Antimicrobial peptide,AP)是宿主细胞产生的一类对抗病原体感染的肽类活性物质,是宿主天然免疫防御系统的重要组成部分。迄今为止,已从植物、被囊动物、昆虫、两栖动物和哺乳动物中分离和纯化了1000多种肽抗生素,它们多为13～45个

关键词：抗病毒作用抗生素哺乳动物病毒包膜靶细胞抗病毒活性

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抗耐药性金黄色葡萄球菌嵌合药靶的设计与构建

抗耐药性金黄色葡萄球菌嵌合药靶的设计与构建

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重庆微生物学会第九届会员代表大会暨学术年会

作者：杨杰王冬梅胡珍原薇薇陈志瑾饶贤才第三军医大学微生物学教研室重庆市微生物工程实验室

目的:设计耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)耐药相关TG-TPase嵌合基因,进行分子建模及三维结构观察,并构建了原核表达质粒,进行嵌合基因的表达,为进一步制备靶蛋白、利用其酶学活性建立抑制分子筛选系统奠定基础。方法:运用Bioedit和DNAS... 详细信息

目的:设计耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)耐药相关TG-TPase嵌合基因,进行分子建模及三维结构观察,并构建了原核表达质粒,进行嵌合基因的表达,为进一步制备靶蛋白、利用其酶学活性建立抑制分子筛选系统奠定基础。方法:运用Bioedit和DNAStar软件对MRSA耐药性相关转糖基酶(TGase)和转肽酶(TPase)活性片段序列和活性区结构特点及其活性发挥进行分析,设计TG-TPase嵌合药靶,并通过引物设计从MRSA菌株中克隆PBP2的TG基因片段和PBP2a的TP基因片段,进一步用引物延伸法、酶切连接等分子生物学操作构建TG-TPase嵌合基因并亚克隆至原核表达质粒pET30b中,转化Rosetta(DE3)plysS大肠埃希菌,用IPTG进行诱导表达,并对表达的蛋白进行SDS-PAGE分析。结果设计的TG-TPase嵌合药靶包括PBP2分子的TGase活性区、绞链区的N-端,PBP2a分子绞链区C-端及完整的TPase结构域,融合基因为1935bp,编码645个氨基酸,等电点为7.10,相对分子量72kDa。用PCR法从MRSA菌株中成功克隆了青霉素结合蛋白PBP2的TG片段和PBP2a的TP片段,构建了TG-TPase嵌合基因及其原核表达质粒,并在大肠埃希菌中表达出药靶蛋白,表达结果与预期设计相符合。结论成功设计并构建了耐药性金葡菌TG-TPase嵌合基因及其重组表达工程菌,为进一步纯化蛋白并利用其酶学活性进行抗耐药性金葡菌抑制剂的筛选奠定基础。

关键词： MRSA TPase TGase 活性中心分子设计

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酵母表达肽抗生素hPAB-β抗单纯疱疹病毒活性分析

酵母表达肽抗生素hPAB-β抗单纯疱疹病毒活性分析

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重庆微生物学会第九届会员代表大会暨学术年会

作者：陈志瑾饶贤才丛延广杨杰王冬梅胡珍原薇薇第三军医大学微生物学教研室重庆市微生物工程实验室

肽抗生素(Peptide antibiotics)为生物体基因编码的小肽,通常由12～60个氨基酸残基构成,分子量小于5kDa。它们在动、植物中的广泛分布,提示其在生物体的生长及抗感染中发挥重要作用。虽然发现了一些阴离子型肽抗生素,但绝大多数肽抗生... 详细信息

肽抗生素(Peptide antibiotics)为生物体基因编码的小肽,通常由12～60个氨基酸残基构成,分子量小于5kDa。它们在动、植物中的广泛分布,提示其在生物体的生长及抗感染中发挥重要作用。虽然发现了一些阴离子型肽抗生素,但绝大多数肽抗生素为阳离子型。如动物的防御素(Defensins)即为一组阳离子型肽抗生素,它首先从兔的中性粒细胞中发现,而后发现在不同动物的巨噬细胞、小肠paneth细胞、上皮细胞中也有表达,具有抗细菌、抗病毒、抗真菌等多种功能。根据半胱氨酸的分布及形成二硫键的方式不同,哺乳动物的防御素分为α-,β-和θ-三个亚家族。人的防御素分子中均含有6个半胱氨酸,可形成3对二硫键。迄今已发现17种人防御素,包括6个α-防御素(HNP1～4,HD5和HD6)和11个β-防御素(HBD1～6和HBD25～29)。它们在人体遭受感染后,机体的特异性免疫建立之前发挥重要作用。在临床耐药菌问题日益严重、病毒感染又缺乏特异性治疗手段的今天,肽抗生素的发现及深入研究无疑给临床抗感染治疗点燃了新的希望。

关键词：肽抗生素阳离子型酵母表达活性分析单纯疱疹病毒

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金黄色葡萄球菌PBP2a相互作用蛋白的筛选

金黄色葡萄球菌PBP2a相互作用蛋白的筛选

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重庆微生物学会第九届会员代表大会暨学术年会

作者：原薇薇杨杰王冬梅胡珍朱军民陈志瑾张俊磊王嘉丽刘佳饶贤才第三军医大学微生物学教研室重庆市微生物工程实验室

目的PBP2a是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)细胞壁合成的转肽酶(TPase)活性提供者,与MRSA耐药性的发生密切相关。通过建立细菌双杂交技术,筛选MRSA中与PBP2a相互作用的蛋白,为深入探讨PBP2a介导MRSA耐药的机制奠定基础。方法利用PCR扩... 详细信息

目的PBP2a是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)细胞壁合成的转肽酶(TPase)活性提供者,与MRSA耐药性的发生密切相关。通过建立细菌双杂交技术,筛选MRSA中与PBP2a相互作用的蛋白,为深入探讨PBP2a介导MRSA耐药的机制奠定基础。方法利用PCR扩增,获得PBP2a蛋白的编码基因MecA,插入pRBR构建成诱饵质粒pBR-PBP2a。提取MRSAN315株基因组DNA,经Sau3AI部分酶切后连接到pRAC质粒的BamHI位点,获得基因组DNA表达文库;将文库质粒转化含诱饵质粒pBR-PBP2a的报告菌株KS1,利用细菌双杂交技术进行筛选,获得与诱饵质粒编码的融合蛋白相互作用的猎物,对猎物中编码序列进行DNA测序和生物信息学分析,确定与PBP2a有相互作用的蛋白或多肽。结果成功构建了pBR-PBP2a诱饵质粒,可表达PBP2a与大肠埃希菌RNA聚合酶α亚单位N端序列的融合蛋白。所构建的MRSA N315株基因组文库覆盖率达9倍,满足文库筛选的需要。将文库转化含诱饵质粒和报告基因的KS1宿主菌,利用细菌双杂交技术经3次筛选,共获得9个猎物克隆,其报告基因(LacZ)的活性均升高2倍以上,对9个猎物质粒进行了测序,信息学分析表明它们均来自于MRSA N315基因组,插入片段最长者944bp,最短者343bp,9个插入片段中含14个编码基因,其中10个功能未知,1个编码二氢吡啶二羧酸合酶、1个编码二氢吡啶二羧酸还原酶,2个编码的染色体解离SMC蛋白。9个克隆中介导与PBP2a相互作用的多肽由14-47氨基酸组成。结论利用细菌双杂交技术从MRSA基因组文库中成功筛选到与PBP2a相互作用的多肽,为下一步研究这些多肽对PBP2a活性的影响,深入认识PBP2a介导MRSA耐药性发生的机理奠定了坚实的基础。

关键词： PBP2a 基因组文库金黄色葡萄球菌相互作用蛋白

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抗MRSA嵌合药靶TG-TPase的设计与构建

抗MRSA嵌合药靶TG-TPase的设计与构建

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重庆微生物学会第九届会员代表大会暨学术年会

作者：杨杰饶贤才王冬梅胡珍原薇薇陈志瑾第三军医大学微生物学教研室重庆市微生物工程实验室

关键词：嵌合基因大肠埃希菌 TG-TPase

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中国兽医学报 2009年第3期29卷 308-311页

作者：丁红雷毛旭虎王豪举邹全明第三军医大学临床微生物学及免疫学教研室重庆市生物制药工程技术研究中心重庆400038 西南大学动物科技学院重庆市牧草与草食家畜重点实验室重庆400716 西南大学蚕学与系统生物学研究所重庆400715

为了了解大肠杆菌O157分离菌株携带毒力及黏附相关基因的情况及菌株的多态性。用聚合酶链式反应扩增stx1、stx2、eaeA、ehxA、EspA和Tccp基因。选用限制性内切酶HincⅡ和EcoRⅡ对分离的O157∶H7菌株eaeA基因进行酶切,选用限制性内切酶Ha... 详细信息

为了了解大肠杆菌O157分离菌株携带毒力及黏附相关基因的情况及菌株的多态性。用聚合酶链式反应扩增stx1、stx2、eaeA、ehxA、EspA和Tccp基因。选用限制性内切酶HincⅡ和EcoRⅡ对分离的O157∶H7菌株eaeA基因进行酶切,选用限制性内切酶HaeⅢ、HinfⅠ、EcoRⅡ和RsaⅠ对分离的O157∶H7菌株ehxA基因进行酶切,最后对这两个基因进行PCR-RFLP分析。结果,所有O157∶H7菌株扩增出eaeA、ehxA、EspA和Tccp基因,但没有扩增出stx1和stx2基因;4株O157∶H?菌株,均没有扩增出stx2、eaeA、ehxA、EspA和Tccp基因,且只有1株扩增出stx1基因。所有分离菌株的eaeA基因和ehxA基因选用限制性内切酶酶切之后所得酶切片段数目和大小与标准菌株的eaeA基因和ehxA基因选用限制性内切酶酶切之后所得酶切片段数目和大小相同。结果表明,由于所有菌株缺失stx2基因,其致病力相对较低,且在基因水平较为保守,多态性较为单一。

关键词：大肠杆菌O157 毒力及黏附相关基因 PCR RFLP

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稳定过表达p50基因细胞株的构建及鉴定

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局解手术学杂志 2009年第2期18卷 78-80页

作者：陈炜高娜王嘉丽张俊磊田衍平安静第三军医大学基础医学部微生物学教研室重庆市微生物工程实验室重庆400038 第三军医大学基础医学部组织胚胎学教研室重庆400038 首都医科大学基础医学院微生物学教研室北京100069

目的筛选出稳定过表达p50基因的细胞克隆株ECV-p50,为研究dynei-n-dynactin复合体在登革病毒逆行性运输中的作用奠定基础。方法将构建的pRe-p50质粒稳定转染至ECV304细胞,通过间接免疫荧光染色和免疫印迹实验进行鉴定。结果经间接免疫... 详细信息

目的筛选出稳定过表达p50基因的细胞克隆株ECV-p50,为研究dynei-n-dynactin复合体在登革病毒逆行性运输中的作用奠定基础。方法将构建的pRe-p50质粒稳定转染至ECV304细胞,通过间接免疫荧光染色和免疫印迹实验进行鉴定。结果经间接免疫荧光染色和免疫印迹实验验证,稳定过表达p50基因的细胞克隆株命名为ECV-p50。结论成功建立了稳定过表达p50基因的细胞克隆株ECV-p50,为后续研究积累了有价值的实验资料。

关键词：病毒微管骨架逆行性运输过表达 p50

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革兰阴性菌基因敲除载体的构建及其应用

革兰阴性菌基因敲除载体的构建及其应用

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重庆微生物学会第九届会员代表大会暨学术年会

作者：王景穆媛媛黎庶陈志瑾熊坤丛延广第三军医大学基础医学部微生物学教研室重庆市微生物工程实验室遵义医学院研究生院

目的构建1个适用于革兰阴性菌的精确基因敲除载体并证明其有效性。方法构建的载体主要包括以下成分:π蛋白依赖性复制起点ori R6K;接合转移基因mob,使载体可以通过简单的接合方式实现转移;多克隆位点序列:EcoRⅠ-XbaⅠ-ApaⅠ-SfiⅠ-Sac... 详细信息

目的构建1个适用于革兰阴性菌的精确基因敲除载体并证明其有效性。方法构建的载体主要包括以下成分:π蛋白依赖性复制起点ori R6K;接合转移基因mob,使载体可以通过简单的接合方式实现转移;多克隆位点序列:EcoRⅠ-XbaⅠ-ApaⅠ-SfiⅠ-SacⅠ-NotⅠ-SpeⅠ-NdeⅠ-SacⅡ-BglⅡ;反向选择标志SacB;正向选择标志卡那霉素抗性片段。载体构建完成后,采用该载体对弗氏枸橼酸杆菌的yeeZ基因进行框架内敲除,以验证其有效性。结果成功构建了敲除载体,命名为pYG4,并对yeeZ基因进行了框架内精确敲除获得突变株。结论本研究构建的载体适用于对革兰阴性菌进行目的基因的精确敲除,将在细菌基因功能研究中得到广泛的应用。

关键词：敲除载体构建突变株基因功能

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噬菌体PaP3多糖解聚酶对铜绿假单胞菌生物膜的作用研究

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免疫学杂志 2008年第2期24卷 184-187页

作者：贾鸣胡晓梅孙卫忠饶贤才胡福泉第三军医大学微生物学教研室重庆市微生物工程重点实验室重庆400038

目的检测重组铜绿假单胞菌噬菌体PaP3多糖解聚酶对铜绿假单胞菌生物膜的降解活性。方法经FITC-ConA/PI荧光双染色后,采用激光扫描共聚焦显微镜观察重组多糖解聚酶处理前后PA3生物膜的形态变化,以测定多糖解聚酶对生物膜的降解活性;测定... 详细信息

目的检测重组铜绿假单胞菌噬菌体PaP3多糖解聚酶对铜绿假单胞菌生物膜的降解活性。方法经FITC-ConA/PI荧光双染色后,采用激光扫描共聚焦显微镜观察重组多糖解聚酶处理前后PA3生物膜的形态变化,以测定多糖解聚酶对生物膜的降解活性;测定多糖解聚酶作用前、后铜绿假单胞菌对4种敏感抗生素(乳酸环丙沙星、加替沙星、头孢他啶、硫酸庆大霉素)的MIC、MBC变化情况,从而判断多糖解聚酶对抗生素的协同杀菌作用。结果FITC-ConA/PI荧光双染色结果显示,经重组多糖解聚酶处理后,铜绿假单胞菌生物膜的胞外多糖组分少而分散,包裹在胞外多糖组分里的细菌数量也大大减少,表明多糖解聚酶确实能够特异性的降解生物膜的胞外多糖组分。多糖解聚酶作用后四种抗生素相应的MIC、MBC都出现了不同程度的降低,其中以头孢他啶降低最为明显,表明多糖解聚酶对抗生素具有协同杀菌活性。结论重组噬菌体PaP3多糖解聚酶在体外可以特异性的降解铜绿假单胞菌生物膜的胞外多糖,有利于抗生素通透生物膜,作用于菌体,具有协同抗菌作用。

关键词：噬菌体PAP3 铜绿假单胞菌多糖解聚酶细菌生物膜

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TAT-EGFP融合蛋白的表达纯化及穿膜活性的研究

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免疫学杂志 2008年第6期24卷 630-633页

作者：李欢胡晓梅陈志瑾丛延广黎庶周莹冰李明胡福泉第三军医大学微生物学教研室重庆市微生物工程重点实验室重庆400038

目的在大肠埃希菌中高效表达TAT-EGFP融合蛋白并鉴定纯化,然后进行穿膜活性的研究。方法以本室前期构建的重组质粒pQE-EGFP为模板,采用PCR方法特异性扩增TAT-EGFP基因序列,随后克隆于原核表达载体pQE-31,所构建的重组质粒经测序鉴定后... 详细信息

目的在大肠埃希菌中高效表达TAT-EGFP融合蛋白并鉴定纯化,然后进行穿膜活性的研究。方法以本室前期构建的重组质粒pQE-EGFP为模板,采用PCR方法特异性扩增TAT-EGFP基因序列,随后克隆于原核表达载体pQE-31,所构建的重组质粒经测序鉴定后转化大肠埃希菌JM109,IPTG诱导表达;SDS-PAGE和Western blotting鉴定表达蛋白质,经Ni2+-金属螯合亲和层析纯化,将纯化蛋白加入体外培养的小鼠黑色素瘤B16细胞中,荧光显微镜下观察TAT蛋白的穿膜活性。结果成功构建了pQE-TAT-EGFP重组质粒的,转化大肠埃希菌JM109,经IPTG诱导,目的蛋白表达率为25%,SDS-PAGE、Western blotting初步测定目的蛋白的相对分子质量(Mr)约为30160,纯化得到了目的融合蛋白TAT-EGFP。并在体外培养的B16细胞中证实TAT-EGFP融合蛋白穿透生物膜的能力。结论通过对TAT-EGFP融合蛋白穿膜活性的分析,证实了TAT具有穿膜活性,为TAT-PEⅢ融合蛋白抑瘤活性的研究提供了理论依据,也为生物大分子药物进入组织细胞内发挥治疗作用奠定了基础。

关键词： TAT-EGFP融合蛋白表达纯化穿膜活性

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