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目的：观察P311在体外创伤模型中对表皮干细胞迁移的作用并探讨其机制.方法：(1)应用Ⅳ型胶原快速黏附法分离培养人ESC,同时构建腺病毒空载体pAdEasy-增强型绿色荧光蛋白(EGFP)及P311腺病毒表达载体pAdEasy-EGFP-P311,转染ESC.经丝裂霉素C处理2h后行划痕实验.划痕后0(即刻)、24、48、72 h测量固定位置细胞迁移距离.(2)分离培养P311KO及WT新生小鼠表皮干细胞,经丝裂霉素C处理2h后行划痕实验.划痕后0、24、48、72 h测量固定位置细胞迁移距离.(3) Pulldown实验检测P311对腺病毒转染人ESC及P311KO及WT新生小鼠表皮干细胞中RhoA、Cdc42、Rac1活性的影响.结果：划痕后24h,P311高表达组人ESC迁移距离为522.9±50.1um,明显高于EGFP组344.9±72.8um,P＜ 0.01.划痕24h,小鼠P311WT组ESC迁移距离为335.8um±63.9um,明显高于小鼠P311KO组151.1±***实验显示,P311高表达组RhoA、Cdc42、Rac1活性较EGFP组增高了1.4、1.8、2.0倍.小鼠P311KO组较WT组RhoA、Cdc42、Rac1活性分别下降了49.6％、69.8％、78.6％.结论：P311可能通过活化RhoA、Cdc42、Rac1促进ESC的迁移功能.

关键词： P311 表皮干细胞细胞迁移 RhoA Rac1

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P311腺病毒表达载体的构建及其在表皮干细胞中的表达

P311腺病毒表达载体的构建及其在表皮干细胞中的表达

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2013年全军烧伤外科学术年会

作者：张小容胡晓红姚志慧贺伟峰罗高兴吴军第三军医大学西南医院烧伤研究所创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室疾病蛋白质组学重庆市市级重点实验室 400038

目的构建P311腺病毒表达载体并观察其在转染人表皮干细胞(human epidermal stem cells,hESCs)后P311的表达情况。方法扩增含有P311的全长cDNA,然后亚克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV中,再与pAdEasy-1质粒在大肠杆菌BJ5183中进行同源重组... 详细信息

目的构建P311腺病毒表达载体并观察其在转染人表皮干细胞(human epidermal stem cells,hESCs)后P311的表达情况。方法扩增含有P311的全长cDNA,然后亚克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV中,再与pAdEasy-1质粒在大肠杆菌BJ5183中进行同源重组产生含有P311的骨架质粒(pAdEasy/P311)。将验证正确的pAdEasy/P311用Pac Ⅰ酶切后转染293细胞,从而包装出P311的腺病毒表达载体(Adv-P311)。用Adv-P311转染hESCs,并采用RT-PCR和荧光激活细胞分类计数的方法检测其表达情况。结果PCR、酶切和测序结果证明,成功地将P311全长cDNA克隆到骨架质粒中,并包装出腺病毒表达载体。同时Adv2-P311转染hESCs后可有效地增加hESCs 中P311的表达。结论P311的腺病毒表达载体的成功构建和其在hESCs中的表达,为研究P311在干细胞移植中的应用奠定基础。

关键词： P311 腺病毒构建表皮干细胞

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P311在小鼠浅Ⅱ度烧伤模型中对表皮干细胞迁移的影响

P311在小鼠浅Ⅱ度烧伤模型中对表皮干细胞迁移的影响

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2013年全军烧伤外科学术年会

作者：姚志慧张小容胡晓红贺伟峰罗高兴吴军第三军医大学西南医院烧伤研究所创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室疾病蛋白质组学重庆市市级重点实验室 400038

目的:观察P311在小鼠浅Ⅱ度烧伤模型中对表皮干细胞迁移的作用并探讨其机制. 方法:(1)、选取8-10周C57BL/6雄性小鼠,应用YLS-Q5超级温控烫伤仪,于不同温度、时间、压力下制作小鼠烫伤模型,进行取材、固定、包埋、切片、HE染色,判断... 详细信息

目的:观察P311在小鼠浅Ⅱ度烧伤模型中对表皮干细胞迁移的作用并探讨其机制. 方法:(1)、选取8-10周C57BL/6雄性小鼠,应用YLS-Q5超级温控烫伤仪,于不同温度、时间、压力下制作小鼠烫伤模型,进行取材、固定、包埋、切片、HE染色,判断烫伤深度.(2)、取18只8-10周C57BL/6雄性小鼠,制作小鼠背部浅Ⅱ度烫伤模型,于伤后6、12、24、48、72h取创面及创周皮肤组织,采用免疫组化方法观察P311表达情况.(3)取6只新生C57BL/6小鼠,连续3天腹腔注射50μg/g溴脱氧尿苷(BrdU,2次/d)建立ESC示踪模型.7周后于其背部制作浅Ⅱ度烧伤创面.伤后72 h取创面皮肤组织制作连续切片,免疫组织化学染色,观察P311阳性和BrdU阳性细胞空间共定位情况.(3)构建腺病毒空载体pAdEasy-增强型绿色荧光蛋白(EGFP)及P311腺病毒表达载体pAdEasy-EGFP-P311.同时制作小鼠全层皮肤缺损模型,于创面周围皮下注射相同数量腺病毒载体,观察创面愈合情况. 结果:小鼠皮肤浅Ⅱ度烧伤模型致伤条件为:温度65℃,致伤时间3s,压力为探头重力.浅Ⅱ度烧伤后不同时相点,P311在创面不同部位的表达量各不相同.伤后创面毛囊、新生表皮中P311表达量随时间延长逐渐上升;创周表皮及毛囊的P311表达量于伤后24h达高峰.应用BrdU标记的小鼠浅Ⅱ度烧伤创面新生表皮层可见P311阳性细胞和BrdU阳性细胞共定位.将纯化腺病毒注射于全层皮肤缺损模型创周,P311高表达组可明显促进创面愈合. 结论:P11可明显促进小鼠浅Ⅱ度烧伤创面愈合及表皮干细胞迁移.

关键词：烧伤创面表皮干细胞移植腺病毒表达载体全层皮肤缺损模型

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大鼠皮层线粒体双向凝胶电泳体系的建立

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医学分子生物学杂志 2013年第2期10卷 91-94页

作者：杨涌涛谢鹏陈康宁黄河清贺伟峰重庆医科大学附属第一医院神经内科重庆市400016 第三军医大学西南医院神经内科重庆市400038 第三军医大学全军烧伤研究所创伤、烧伤、复合伤国家重点实验室疾病蛋白质组学重庆市市级重点实验室重庆市400038

目的构建稳定的大鼠皮层线粒体双向凝胶电泳体系。方法 SD大鼠在规定的时间内快速断头取脑，冰上分离大脑皮层组织，两次密度梯度离心纯化线粒体。利用双向凝胶电泳技术改良等电聚焦的电压存3500V聚焦，总伏小时同定为14000Vh。以12％的... 详细信息

目的构建稳定的大鼠皮层线粒体双向凝胶电泳体系。方法 SD大鼠在规定的时间内快速断头取脑，冰上分离大脑皮层组织，两次密度梯度离心纯化线粒体。利用双向凝胶电泳技术改良等电聚焦的电压存3500V聚焦，总伏小时同定为14000Vh。以12％的SDS，PAGE进行第二向电泳．银染显色。结果得到了分辨率较高的皮层线粒体蛋白双向凝胶电泳图谱。结论利用改进的方法构建了高质量的双向电泳图谱，为各种疾病状态下皮层线粒体差异蛋白的研究提供了实验基础。

关键词：蛋白质组学双向凝胶电泳线粒体

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P311在小鼠浅Ⅱ度烧伤及体外细胞创伤模型中对表皮干细胞迁移的影响

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中华烧伤杂志 2012年第3期28卷 213-218页

作者：孙薇姚志慧詹日兴张小容崔艳艳谭江琳杨思思胡晓红周俊峄吴军罗高兴第三军医大学西南医院全军烧伤研究所创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室重庆市疾病蛋白质组学重点实验室重庆400038

目的观察P311在小鼠浅Ⅱ发烧伤技体外细胞创伤模型中对表皮干细胞（ESC）辽移的作用并探讨其机制。方法（1）取18只C57BL／6小鼠，其中15只行背部浅Ⅱ度烧伤，于伤后6、12、24、48、72h取创面及创周皮肤组织，各时相点3只；余下3只小鼠... 详细信息

目的观察P311在小鼠浅Ⅱ发烧伤技体外细胞创伤模型中对表皮干细胞（ESC）辽移的作用并探讨其机制。方法（1）取18只C57BL／6小鼠，其中15只行背部浅Ⅱ度烧伤，于伤后6、12、24、48、72h取创面及创周皮肤组织，各时相点3只；余下3只小鼠作为正常对照，同法取止常皮肤标本。采用生物素-链霉亲和素-过氧化物酶（SP）染色法观察P311在上述皮肤组织中的表达。（2）取6只新生的C57BL／6小鼠，连续3d腹腔注射50μg／g溴脱氧尿苷（BrdU，2次／（1）建立ESC示踪模型。7周后于其背部制作浅Ⅱ度烧伤创面。伤后72h取创面皮肤组织制作连续切片，SP法免疫组织化学染色，观察P311阳性和BrdU阳性细胞空间共定位情况。（3）构建腺病毒空载体pAdEasy-增强型绿色荧光蛋h（EGFP）及P311腺病毒表达载体pAdEasy-EGFP-P311，并进行包装。应用Ⅳ型胶原快速黏附法分离培养人ESC,按照随机数字表法将其分为P311高表达组和EGFP对照组，每组3孔，分别以pAdEasy-EGFP-P311及pAdEasy-EGFP腺病毒感染ESC。2组ESC经丝裂毒素C处理2h后行划痕实验。划痕后0（即刻）、24、48、72h测量地固定范围内划痕剩余面积，计算划痕愈合面积百分比。对数据进行独立样本t检验。结果（1）浅Ⅱ度烧伤后不同时相点，P311在创面不同部位的表达量各不相同。伤后创面毛囊、新生表皮巾P311表达量随时间延长逐渐上升；创用表皮及毛囊的P311表达量于伤后12h达高峰，72h回落至正常。（2）应用BrdU标记的小鼠浅Ⅱ度烧伤创Ⅲ新生表皮层可见P311阳性细胞和BrdU阳性细胞共定位。（3）划痕后48、72h，P311高表达组ESC划痕愈合面积百分比分别为（69±31）％、（89±26）％，明显高于EGFP刘照组[（35±12）％、（46±31）％，t值分别为-2．336、-2，611，P值均小于0．05]。结论P311可明显促进小鼠浅Ⅱ度烧伤创面及体外细胞创伤模型中的ESC迁移，可能在创面修复中起重要作用。

关键词：烧伤创伤和损伤细胞运动 P311 表皮干细胞创面愈合

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一氧化氮对体外培养人表皮干细胞生物学行为的影响

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中华烧伤杂志 2012年第2期28卷 125-129页

作者：詹日兴孙薇姚志慧崔艳艳杨思思谭江琳周俊峄王颖杨俊杰张小容胡晓红吴军罗高兴第三军医大学西南医院全军烧伤研究所创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室疾病蛋白质组学重庆市重点实验室重庆400038

目的观察外源性NO对人表皮干细胞（ESC）脱黏附、增殖以及迁移功能的影响。方法采用改良Ⅳ型胶原快速黏附法分离、培养人ESC，倒置相差显微镜下观察其形态；蛋白质印迹法和免疫荧光法观察ESC标志物整合素p，和细胞角蛋H 19（ CK19）的... 详细信息

目的观察外源性NO对人表皮干细胞（ESC）脱黏附、增殖以及迁移功能的影响。方法采用改良Ⅳ型胶原快速黏附法分离、培养人ESC，倒置相差显微镜下观察其形态；蛋白质印迹法和免疫荧光法观察ESC标志物整合素p，和细胞角蛋H 19（ CK19）的表达。对贴壁生长的ESC行划痕处理，用O（对照）、1、10、100、500 μmolL NO供体S-亚硝基-N-乙酰-DL-青霉胺（SNAP）作用细胞12、24 h，检测细胞迁移率；Transwe11实验检测SNAP（浓度同上）对ESC趋化能力的影响（计数转膜细胞）。采用0、10、100、500 μmolL SNAP作用细胞1 h，黏附实验检测SNAP对ESC黏附功能的影响，计算黏附抑制率；于上述4种浓度SNAP作用O（即刻）、12、24、48 h，采用酶标仪检测ESC增殖水平，数据以吸光度值表示。对数据进行单凶素方差分析和Dunnett z检验。结果（1）倒置相差显微镜下可见，细胞培养5-9 d形成小克隆；培养10 -14 d，细胞增殖明显加快。蛋白质印迹法和免疫荧光法检测结果显示，所分离的细胞均能表达CK19和整合素p．。由此鉴定该细胞为ESC。（2）与O μmolL SNAP怍用12、24 h后细胞迁移率[（35.7±0.3）%、（45.7 ＋5.0）%]比较，1-100 μmolLSNAP均能促进ESC迁移，其中100 μmolL SNAP作用后细胞迁移率达峰值[（48.8±2.7）%、（82.1±15.8）%，P值分别为8. 34、5.10，P值均小于0.01]。100 y,mo1/L SNAP作用后转膜细胞数显著多于O μmolL SNAP作用后（t=9. 24，P=0.00）。100、500 μmolL SNAP作用后，ESC黏附能力明显低于OμmolL SNAP作用后（t值分别为4.30、4.67，P值均为0.00）。100、500 μmolL SNAP作用24、48 h，细胞增殖能力明显强于OμmolL SNAP作用后（t值为2.84-8.17，P值均小于0.05）。结论适宜浓度的外源性NO对体外培养人ESC的迁移功能有促进作用。外源性NO对体外培养人ESC具有脱黏附、促增殖作用。

关键词：一氧化氮细胞运动表皮干细胞创面愈合

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The effect of nitric oxide on the migration of epidermal stem cell

The effect of nitric oxide on the migration of epidermal ste...

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2013年全军烧伤外科学术年会

作者：詹日兴刘岱松徐瑞王玉振张小容胡晓红吴军罗高兴姚志慧杨思思谭江琳贺伟峰崔艳艳周俊峄杨俊杰第三军医大学西南医院全军烧伤研究所创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室疾病蛋白质组学重庆市市级重点实验室重庆400038

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