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第三军医大学学报 2019年第3期41卷 187-191页

作者：刘勇陆军军医大学(第三军医大学)第一附属医院全军眼科中心视觉损伤与再生修复重庆市重点实验室重庆400038

随着白内障超声乳化手术、角膜移植等治疗技术的普及,白内障和角膜盲这两类主要的致盲性眼病逐步被攻克,而老年性黄斑变性(age related macular degeneration,AMD)、视网膜色素变性(retinitis pigmentosa,RP)和青光眼等视网膜视神经变... 详细信息

随着白内障超声乳化手术、角膜移植等治疗技术的普及,白内障和角膜盲这两类主要的致盲性眼病逐步被攻克,而老年性黄斑变性(age related macular degeneration,AMD)、视网膜色素变性(retinitis pigmentosa,RP)和青光眼等视网膜视神经变性类疾病成为威胁人类视力健康的主要疾病。该类疾病的共同特点是:视网膜中的关键细胞(如感光细胞、视网膜色素上皮细胞和神经节细胞)变性、死亡,患者的视功能逐渐丧失至失明。由于变性和凋亡的神经细胞不能再生,干细胞移植成为目前最具前景的治疗策略。

关键词：干细胞视网膜转化医学

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神经干细胞与大鼠RPE细胞间的线粒体转运及对RPE细胞凋亡的影响

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第三军医大学学报 2017年第11期39卷 1112-1116页

作者：陈冲林邹婷黎其友徐海伟阴正勤第三军医大学西南医院全军眼科中心视觉损伤与再生修复重庆市重点实验室重庆400038

目的研究小鼠神经干细胞(neural stem cells,NSCs)C17.2细胞系与从RCS大鼠变性视网膜中原代分离视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelial,RPE)的线粒体交换方式及其对RPE细胞特性的影响。方法分离RCS大鼠RPE细胞并进行培养和鉴... 详细信息

目的研究小鼠神经干细胞(neural stem cells,NSCs)C17.2细胞系与从RCS大鼠变性视网膜中原代分离视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelial,RPE)的线粒体交换方式及其对RPE细胞特性的影响。方法分离RCS大鼠RPE细胞并进行培养和鉴定。分别用线粒体特异性标记物Mitotracker-red和Mitotracker-green标记RPE细胞和小鼠NSCs细胞的线粒体,将两种细胞共培养,激光共聚焦显微镜下观察两种细胞之间隧道纳米管(tunneling nanotubes,TNT)的形成及线粒体转运方式。采用流式细胞仪检测与NSCs共培养后RPE细胞的反应性活性氧类(reactive oxygen species,ROS)水平、细胞周期和细胞凋亡水平的变化。结果来源于RCS大鼠视网膜的第3代RPE细胞生长状态良好,RPE65及Bestrophin蛋白阳性率细胞均大于95%。与NSCs共培养24 h后,可见RPE细胞与NSCs间TNT的形成,NSCs中的线粒体向RPE细胞方向单向运动,接受NSCs转运的线粒体后,RPE细胞的ROS水平降低(P<0.01);RPE细胞的增殖能力增加,处于S期的细胞比例明显增加(P<0.01),细胞增殖指数(PI)显著增加(P<0.05);RPE细胞早期凋亡细胞比例显著降低(P<0.05)。结论 NSCs可通过与相邻的变性RPE细胞之间形成TNT并向其转运线粒体而改善变性RPE细胞的存活。

关键词：干细胞视网膜色素变性视网膜色素上皮线粒体隧道纳米管

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人胚胎干细胞三维培养视网膜祖细胞移植后对变性大鼠视功能改善及其存活、迁移、分化

人胚胎干细胞三维培养视网膜祖细胞移植后对变性大鼠视功能改善及...

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第三届中国老年医学与科技创新大会

作者：邹婷高笠雄曾玉晓徐海伟阴正勤第三军医大学西南医院全军眼科中心视觉损伤与再生修复重庆市重点实验室 400038重庆

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结膜瓣遮盖手术在难治性角膜疾病治疗中的作用评价

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第三军医大学学报 2016年第10期38卷 1166-1172页

作者：陶丹杨于力谢汉平第三军医大学西南医院全军眼科中心视觉损伤与再生修复重庆市重点实验室重庆400038

目的评价结膜瓣遮盖术在各种类型难治性角膜疾病治疗中的疗效。方法回顾分析我中心从2001-2014年住院治疗的各种类型难治性角膜疾病患者161例（161只眼）,均为经过针对性药物治疗无效或病情加重者。161例患者中,感染性角膜溃疡118例,包... 详细信息

目的评价结膜瓣遮盖术在各种类型难治性角膜疾病治疗中的疗效。方法回顾分析我中心从2001-2014年住院治疗的各种类型难治性角膜疾病患者161例（161只眼）,均为经过针对性药物治疗无效或病情加重者。161例患者中,感染性角膜溃疡118例,包括真菌性角膜溃疡71例,细菌性角膜溃疡16例,疱疹病毒性角膜溃疡31例;非感染性角膜疾病43例,包括大泡性角膜病变22例,神经麻痹性角膜溃疡6例,角膜移植片溃疡10例,角膜异物取出后穿孔或接近穿孔5例。均由同一术者行桥式结膜瓣遮盖手术治疗,术后针对原发病继续进行药物治疗。随访3-106个月,观察临床疗效。结果 161例患者中,共治愈141例。治愈率87.6%。其中,感染性角膜溃疡（包括真菌性、细菌性、疱疹病毒性角膜溃疡）118例中,共治愈99例,治愈率83.9%。真菌性角膜溃疡71例,治愈54例,治愈率76.1%;细菌性角膜溃疡16例,治愈15例,治愈率93.8%;疱疹病毒性角膜溃疡31例,治愈30例,治愈率96.8%;非感染性角膜疾病43例,治愈42例,治愈率97.7%。感染性角膜溃疡的治愈率与非感染性角膜疾病的治愈率相比差异有统计学意义（P=0.048）。非感染性角膜疾病的治愈率明显高于感染性角膜疾病。在感染性角膜疾病中,疱疹病毒性角膜溃疡的疗效优于真菌性、细菌性角膜溃疡（P=0.047）。共发生21例手术并发症,其中结膜瓣部分溶解11例,结膜瓣穿孔4例,结膜瓣滑脱4例,继发青光眼2例。感染性角膜疾病中,手术后发生并发症20例,发生率16.9%,非感染性角膜疾病手术后并发症1例,发生率2.3%,两者并发症发生率比较,差异有统计学意义（P=0.015）,非感染性角膜疾病手术并发症的发生率明显低于感染性角膜疾病。结论结膜瓣遮盖手术对各种类型的难治性角膜疾病治疗效果显著,对非感染性角膜病变的疗效优于感染性角膜病。对于急性化脓性角膜溃疡,手术前进行针对性治疗可能有助于提高手术的成功率。

关键词：结膜瓣遮盖术难治性角膜疾病

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正常猕猴与人的视网膜电图及视觉诱发电位对比研究

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第三军医大学学报 2016年第12期38卷 1437-1441页

作者：刘闻一戴加满赵从健李世迎阴正勤第三军医大学西南医院全军眼科中心视觉损伤与再生修复重庆市重点实验室重庆400038

目的研究正常猕猴与人视网膜电图(FERG,PERG)及视觉诱发电位(FVEP,PVEP)的异同。方法选取通过眼底照相及光学相干断层扫描(OCT)等眼科相关检查确定眼部没有明显异常的正常成年猕猴3只(6眼)及健康成年人8例(16眼),对其FERG、PERG、FVEP、... 详细信息

目的研究正常猕猴与人视网膜电图(FERG,PERG)及视觉诱发电位(FVEP,PVEP)的异同。方法选取通过眼底照相及光学相干断层扫描(OCT)等眼科相关检查确定眼部没有明显异常的正常成年猕猴3只(6眼)及健康成年人8例(16眼),对其FERG、PERG、FVEP、PVEP进行检测和记录,导出数据后运用SPSS 13.0软件行统计学分析。结果暗适应0.01ERG的b波及暗适应3.0ERG的a波,b波猕猴与人相比峰时明显较短,振幅明显较低(P<0.05)。暗适应Ops的OS2波猕猴与人相比振幅明显较低(P<0.05)。明适应3.0ERG的a波,b波峰时和振幅,明适应30 Hz震荡电位振幅两者差异无统计学意义。FVEP的P2波猕猴与人相比峰时明显较短,振幅明显较高(P<0.05)。PERG猕猴与人相比P50及N95波振幅明显较低(P<0.05)。PVEP的P100波峰时猕猴与人差异无统计学意义,P100波振幅猕猴与人相比较低(P<0.05)。结论视网膜电图及视觉诱发电位可对猕猴行视功能评价,作为评估人视网膜功能的参照。

关键词：猕猴视网膜电图视觉诱发电位光学相干断层扫描

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氧化石墨烯对人胚胎干细胞诱导的视网膜色素上皮细胞活性的影响

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第三军医大学学报 2016年第12期38卷 1410-1415页

作者：曾玉晓吴畏徐海伟阴正勤史春梦第三军医大学军事预防医学院全军复合伤研究所创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室重庆400038 第三军医大学西南医院全军眼科中心视觉损伤与再生修复重庆市重点实验室重庆400038

目的探索氧化石墨烯(graphene oxide,GO)对人胚胎干细胞(human embryonic stem cell,h ESC)诱导的视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelial,RPE)活性的影响。方法 h ESCs通过自发分化法诱导为RPE细胞,通过免疫荧光法和透射电镜... 详细信息

目的探索氧化石墨烯(graphene oxide,GO)对人胚胎干细胞(human embryonic stem cell,h ESC)诱导的视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelial,RPE)活性的影响。方法 h ESCs通过自发分化法诱导为RPE细胞,通过免疫荧光法和透射电镜对其进行鉴定后,将h ESC-RPE细胞与浓度分别为0、12.5、25、50和100μg/m L的GO共培养24 h,采用CCK-8试剂盒检测其细胞活力,与浓度为50μg/m L的GO共培养24 h,流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞内反应性活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平。结果 h ESC分化的RPE细胞,呈典型的铺路石样形态,细胞间连接紧密,胞浆富含色素颗粒;免疫荧光检测表达RPE细胞早晚期及紧密连接的标记,并具有吞噬感光外节能力;电镜观察到顶端的微绒毛,细胞呈单层;GO经原子力显微镜检测,说明制备的氧化石墨烯溶液以单层为主;经紫外-可见吸收以及拉曼光谱测试表明石墨经过强氧化之后,其有序的结构遭到破坏,产生了许多缺陷和出现了大量的无序结构;CCK-8细胞活性检测结果显示各组均无统计学差异;细胞凋亡和氧化应激实验中与空白组之间差异没有统计学意义。结论 GO对于h ESC-RPE细胞生物相容性好,提示其有望作为RPE细胞的纳米载体。

关键词：人胚胎干细胞 RPE细胞氧化石墨烯细胞活性

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神经干细胞与RPE细胞的线粒体交换及其对RPE细胞增生和能量代谢的影响

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中华实验眼科杂志 2015年第5期33卷 424-429页

作者：孙荣莎徐海伟阴正勤第三军医大学西南医院全军眼科中心重庆市视觉损伤与再生修复重点实验室重庆400038

背景研究表明,干细胞可通过与损害靶细胞进行线粒体交换的方式修复受损细胞.视网膜色素变性疾病是以视网膜色素上皮（RPE）细胞凋亡为病理基础的眼病,干细胞是否能够通过上述机制进行治疗尚不清楚. 目的研究神经干细胞（NSCs）能否通... 详细信息

背景研究表明,干细胞可通过与损害靶细胞进行线粒体交换的方式修复受损细胞.视网膜色素变性疾病是以视网膜色素上皮（RPE）细胞凋亡为病理基础的眼病,干细胞是否能够通过上述机制进行治疗尚不清楚. 目的研究神经干细胞（NSCs）能否通过线粒体交换机制改善RPE细胞的增生和能量代谢功能.方法分离Long-Evans大鼠的视网膜进行RPE细胞的培养和传代,取第3代细胞用于实验,采用荧光显微镜检测RPE细胞中RPE65和Bestrophin蛋白的表达.小鼠NSCs C17.2细胞系和带绿色荧光蛋白（GFP）的C17.2细胞（GFP-C17.2细胞）进行培养和传代.分别采用线粒体特异性染色剂Mitotracker-green和Mitotracker-red标记RPE细胞和NSCs线粒体.将RPE细胞与小鼠NSCs进行共培养,用麦胚凝集素（WGA）标记隧道纳米管（TNT）,于激光扫描共焦显微镜下观察共培养的RPE细胞与小鼠NSCs间TNT中线粒体交换方式;采用流式细胞术检测RPE细胞与NSCs共培养前后的细胞周期改变;采用高效液相色谱（HPLC）技术检测共培养前后RPE细胞中ATP、ADP和AMP的质量分数. 结果培养的第3代RPE细胞生长良好,RPE65和Bestrophin表达阳性细胞均＞85％.NSCs和RPE细胞中线粒体对Mitotracker-red标记的阳性率均＞95％.2种细胞共培养后24 h可见RPE细胞与NSCs间形成的膜性TNT结构,WGA染色呈蓝色荧光.随着时间的推移,NSCs中呈红色荧光的线粒体通过TNT进入呈绿色荧光的RPE细胞中.接受TNT线粒体后,处于G1期的RPE细胞比例较未进行线粒体交换的RPE细胞明显下降,差异有统计学意义（P=0.016）,S期细胞和G2/M期细胞比例分别增加了5％和2％,差异均无统计学意义（P=0.114、0.189）.HPLC检测结果显示,与NSCs共培养后,RPE细胞中ATP、ADP和AMP质量分数分别为（8.77 ±3.68）、（2.76±0.92）和（1.07±0.65） μg/mg,较共培养前的（11.29±2.29）、（3.12±0.95）和（1.59±1.22） μg/mg均有所下降,但差异均无统计学意义（P=0.370、0.668、0.553）.结论 NSCs通过建立的TNT能将线粒体单向传递给共培养的RPE细胞,线粒体交换可能是NSCs改善RPE细胞增生和代谢能力的机制之一.

关键词：干细胞眼色素上皮/细胞学视网膜变性/治疗细胞培养共培养技术线粒体/代谢隧道纳米管动物

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GCaMP基因工程化的C17.2神经干细胞的钙离子成像研究

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第三军医大学学报 2015年第11期37卷 1064-1069页

作者：宋蔚林赵从健阴正勤王一第三军医大学西南医院全军眼科中心视觉损伤与再生修复重庆市重点实验室重庆400038

目的研究GCa MP(属于基因编码钙指示剂/蛋白钙指示剂)基因工程化的C17.2神经干细胞的钙离子成像。方法用慢病毒转染C17.2细胞,获得稳定表达GCa MP基因的C17.2-GCa MP细胞。Real-time PCR定量检测C17.2细胞及C17.2-GCa MP细胞中神经干细... 详细信息

目的研究GCa MP(属于基因编码钙指示剂/蛋白钙指示剂)基因工程化的C17.2神经干细胞的钙离子成像。方法用慢病毒转染C17.2细胞,获得稳定表达GCa MP基因的C17.2-GCa MP细胞。Real-time PCR定量检测C17.2细胞及C17.2-GCa MP细胞中神经干细胞标志物巢蛋白(nestin)的表达情况。将C17.2细胞(Fluo-4 AM染色后)和C17.2-GCa MP细胞置于定制数字荧光显微镜下进行钙离子荧光检测。结果 Real-time PCR检测结果提示C17.2细胞及C17.2-GCa MP细胞中nestin表达差异无统计学意义(P>0.05)。C17.2-GCa MP细胞较Fluo-4 AM染色C17.2细胞钙离子荧光锐波(spike)波形持续时间长且相对荧光强度强(P<0.05),在Fluo-4 AM染色C17.2细胞中能观察到钙离子荧光慢波(wave)波形,而C17.2-GCa MP wave波形不典型。结论 C17.2-GCa MP细胞在保持神经干细胞干性的同时能够监测细胞内钙离子变化,能够运用于神经干细胞移植治疗视网膜色素变性功能整合的研究。

关键词： C17.2神经干细胞 GCaMP GECI Fluo-4 AM

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3T3-fGFP细胞摄取神经干细胞胞外泌囊泡的途径

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第三军医大学学报 2015年第12期37卷 1193-1199页

作者：陈曦赵从健阴正勤第三军医大学西南医院全军眼科中心视觉损伤与再生修复重庆市重点实验室重庆400038

目的以超速离心方案提取胞外囊泡的鉴定为基础,初步探求小鼠神经干细胞C17.2胞外囊泡与小鼠胚胎成纤维细胞3T3-fGFP细胞之间的通讯交流通路。方法分别用超速离心法获得胞外囊泡（EV）和Total Exosome Isolation Kit试剂盒获得外泌体（EX... 详细信息

目的以超速离心方案提取胞外囊泡的鉴定为基础,初步探求小鼠神经干细胞C17.2胞外囊泡与小鼠胚胎成纤维细胞3T3-fGFP细胞之间的通讯交流通路。方法分别用超速离心法获得胞外囊泡（EV）和Total Exosome Isolation Kit试剂盒获得外泌体（EXO）;用透射电镜和原子力显微镜分别对两种样品进行形态学比较;用SDS-PAGE和Western blot分别对两种样品进行生物化学比较;用染料标记超速离心法获得胞外囊泡;将标记的胞外囊泡与3T3-fGFP细胞共孵育,对3T3-fGFP细胞摄取胞外囊泡进行研究;通过药理实验筛选3T3-fGFP细胞摄取胞外囊泡的主要通路。结果 C17.2细胞生长良好,形态规则未出现明显分化现象。在透射电镜下两种样品均观察到圆形双层膜结构和＂杯状＂外形的囊泡,直径分布多集中在300 nm以内,并且发现胞外囊泡的平均直径大于外泌体。原子力显微镜的结果显示,两种样品的高度分布多集中在2~20 nm以内,直径分布多集中在300 nm以内,并且外泌体的平均高度和平均直径均大于胞外囊泡。SDS-PAGE结果显示两种样品所含蛋白种类、表达丰度接近。在相同上样量下HSP70的表达强度两者接近,但CD63、CD9和CD81 3种蛋白在胞外囊泡中表达更强。摄取实验表明C17.2细胞胞外囊泡可以被3T3-fGFP细胞内化,被包裹在囊泡内,转运到细胞核周围的区域,并且摄取数量随着时间延长而增加（P〈0.05）。通过药理实验确定网格蛋白（Clathrin）介导的内吞通路为3T3-f GFP细胞摄取C17.2细胞胞外囊泡的主要通路。结论小鼠神经干细胞外泌体可能主要经网格蛋白介导的通路参与了神经干细胞与3T3-fGFP细胞的通讯。

关键词：小鼠神经干细胞胞外囊泡 3T3-fGFP细胞网格蛋白介导通路

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重视临床视觉电生理检查的规范应用

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第三军医大学学报 2015年第12期37卷 1174-1177页

作者：李世迎王刚第三军医大学西南医院全军眼科中心视觉损伤与再生修复重庆市重点实验室

人眼的视网膜受光或图形刺激后,在视觉感受器内引起光化学和光电反应,产生电位改变,形成神经冲动,传给双极细胞,神经节细胞,经视神经、视交叉、视束、外侧膝状体、视放射终止于大脑皮质的距状裂视中枢。

关键词：电生理视网膜视皮层

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