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中华实验眼科杂志 2015年第9期33卷 769-773页

作者：阴正勤李世迎蹇骞第三军医大学西南医院眼科、重庆市视觉损伤与修复重点实验室重庆400038

干细胞具有自我更新能力和多向分化潜能,能通过非对称分裂的方式产生功能和类型更为局限的前体细胞及多种细胞系,进而再生新的细胞,参与损伤组织的修复和重建,是细胞移植研究和再生医学研究的主要对象.眼是一种由多种组织细胞和神经细... 详细信息

干细胞具有自我更新能力和多向分化潜能,能通过非对称分裂的方式产生功能和类型更为局限的前体细胞及多种细胞系,进而再生新的细胞,参与损伤组织的修复和重建,是细胞移植研究和再生医学研究的主要对象.眼是一种由多种组织细胞和神经细胞组成的感觉器官,干细胞移植治疗眼科变性性疾病具有易操作、可视性好、所需种子细胞量少和排斥反应轻的优点,在干细胞基础研究和临床研究中受到广泛关注.国内外研究团队正在进行干细胞移植治疗眼部不可逆疾病的Ⅰ、Ⅱ期临床试验,我国经WHO注册的Ⅰ期临床试验也正处于病例招募阶段,以评估干细胞移植治疗眼部疾病的疗效和安全性.目前,关于干细胞移植治疗眼部疾病的研究仍存在很多尚需解决的问题.本文中评述眼科干细胞移植研究的进展以及进一步的研究方向。

关键词：干细胞/移植黄斑变性视网膜变性角膜疾病晶状体/再生临床试验人

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GCaMP基因工程化的C17.2神经干细胞的钙离子成像研究

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第三军医大学学报 2015年第11期37卷 1064-1069页

作者：宋蔚林赵从健阴正勤王一第三军医大学西南医院全军眼科中心视觉损伤与再生修复重庆市重点实验室重庆400038

目的研究GCa MP(属于基因编码钙指示剂/蛋白钙指示剂)基因工程化的C17.2神经干细胞的钙离子成像。方法用慢病毒转染C17.2细胞,获得稳定表达GCa MP基因的C17.2-GCa MP细胞。Real-time PCR定量检测C17.2细胞及C17.2-GCa MP细胞中神经干细... 详细信息

目的研究GCa MP(属于基因编码钙指示剂/蛋白钙指示剂)基因工程化的C17.2神经干细胞的钙离子成像。方法用慢病毒转染C17.2细胞,获得稳定表达GCa MP基因的C17.2-GCa MP细胞。Real-time PCR定量检测C17.2细胞及C17.2-GCa MP细胞中神经干细胞标志物巢蛋白(nestin)的表达情况。将C17.2细胞(Fluo-4 AM染色后)和C17.2-GCa MP细胞置于定制数字荧光显微镜下进行钙离子荧光检测。结果 Real-time PCR检测结果提示C17.2细胞及C17.2-GCa MP细胞中nestin表达差异无统计学意义(P>0.05)。C17.2-GCa MP细胞较Fluo-4 AM染色C17.2细胞钙离子荧光锐波(spike)波形持续时间长且相对荧光强度强(P<0.05),在Fluo-4 AM染色C17.2细胞中能观察到钙离子荧光慢波(wave)波形,而C17.2-GCa MP wave波形不典型。结论 C17.2-GCa MP细胞在保持神经干细胞干性的同时能够监测细胞内钙离子变化,能够运用于神经干细胞移植治疗视网膜色素变性功能整合的研究。

关键词： C17.2神经干细胞 GCaMP GECI Fluo-4 AM

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3T3-fGFP细胞摄取神经干细胞胞外泌囊泡的途径

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第三军医大学学报 2015年第12期37卷 1193-1199页

作者：陈曦赵从健阴正勤第三军医大学西南医院全军眼科中心视觉损伤与再生修复重庆市重点实验室重庆400038

目的以超速离心方案提取胞外囊泡的鉴定为基础,初步探求小鼠神经干细胞C17.2胞外囊泡与小鼠胚胎成纤维细胞3T3-fGFP细胞之间的通讯交流通路。方法分别用超速离心法获得胞外囊泡（EV）和Total Exosome Isolation Kit试剂盒获得外泌体（EX... 详细信息

目的以超速离心方案提取胞外囊泡的鉴定为基础,初步探求小鼠神经干细胞C17.2胞外囊泡与小鼠胚胎成纤维细胞3T3-fGFP细胞之间的通讯交流通路。方法分别用超速离心法获得胞外囊泡（EV）和Total Exosome Isolation Kit试剂盒获得外泌体（EXO）;用透射电镜和原子力显微镜分别对两种样品进行形态学比较;用SDS-PAGE和Western blot分别对两种样品进行生物化学比较;用染料标记超速离心法获得胞外囊泡;将标记的胞外囊泡与3T3-fGFP细胞共孵育,对3T3-fGFP细胞摄取胞外囊泡进行研究;通过药理实验筛选3T3-fGFP细胞摄取胞外囊泡的主要通路。结果 C17.2细胞生长良好,形态规则未出现明显分化现象。在透射电镜下两种样品均观察到圆形双层膜结构和＂杯状＂外形的囊泡,直径分布多集中在300 nm以内,并且发现胞外囊泡的平均直径大于外泌体。原子力显微镜的结果显示,两种样品的高度分布多集中在2~20 nm以内,直径分布多集中在300 nm以内,并且外泌体的平均高度和平均直径均大于胞外囊泡。SDS-PAGE结果显示两种样品所含蛋白种类、表达丰度接近。在相同上样量下HSP70的表达强度两者接近,但CD63、CD9和CD81 3种蛋白在胞外囊泡中表达更强。摄取实验表明C17.2细胞胞外囊泡可以被3T3-fGFP细胞内化,被包裹在囊泡内,转运到细胞核周围的区域,并且摄取数量随着时间延长而增加（P〈0.05）。通过药理实验确定网格蛋白（Clathrin）介导的内吞通路为3T3-f GFP细胞摄取C17.2细胞胞外囊泡的主要通路。结论小鼠神经干细胞外泌体可能主要经网格蛋白介导的通路参与了神经干细胞与3T3-fGFP细胞的通讯。

关键词：小鼠神经干细胞胞外囊泡 3T3-fGFP细胞网格蛋白介导通路

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重视临床视觉电生理检查的规范应用

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第三军医大学学报 2015年第12期37卷 1174-1177页

作者：李世迎王刚第三军医大学西南医院全军眼科中心视觉损伤与再生修复重庆市重点实验室

人眼的视网膜受光或图形刺激后,在视觉感受器内引起光化学和光电反应,产生电位改变,形成神经冲动,传给双极细胞,神经节细胞,经视神经、视交叉、视束、外侧膝状体、视放射终止于大脑皮质的距状裂视中枢。

关键词：电生理视网膜视皮层

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非动脉炎性前部缺血性视神经病变的电生理及临床特征分析

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第三军医大学学报 2015年第12期37卷 1208-1212页

作者：王敏王刚李世迎刘勇孟晓红阴正勤第三军医大学西南医院全军眼科中心视觉损伤与再生修复重庆市重点实验室重庆400038

目的研究非动脉炎性前部缺血性视神经病变(NAION)的电生理及临床特征。方法收集2013年3月至2014年3月我院确诊为NAION的17例患者28眼,分析其图形视觉诱发电位(PVEP)、荧光素眼底血管造影(FFA)、视野(VF)等临床检查特征。结果 28眼均行P... 详细信息

目的研究非动脉炎性前部缺血性视神经病变(NAION)的电生理及临床特征。方法收集2013年3月至2014年3月我院确诊为NAION的17例患者28眼,分析其图形视觉诱发电位(PVEP)、荧光素眼底血管造影(FFA)、视野(VF)等临床检查特征。结果 28眼均行PVEP检查,其中21眼P100波幅值在1°或15'空间频率均出现不同程度降低。P100波峰时在1°空间频率5眼中度延迟(>15 ms),其余23眼未见明显延迟或者轻度延迟;15'空间频率时6眼中度延迟(>15 ms),其余22眼峰时未见明显延迟或者轻度延迟(<15 ms)。15患者23眼行FFA检查,其中6患者(40%)患者臂-视网膜循环时间(ART)大于15 s。7眼后期出现高荧光,其余后期呈低荧光。28眼均行视野检查,其中10眼正常,7眼视敏度降低或暗点(4眼集中在生理盲点附近),7眼呈现与生理盲点相连的缺损,4眼残存部分视野。对比分析PVEP和FFA,发现FFA后期高荧光的患眼P100波峰时呈中度以上延迟,后期低荧光患眼的峰时未见明显延迟或轻度延迟。对比分析PVEP和视野,发现14眼VF和PVEP均异常,7眼视野正常时PVEP异常,4眼PVEP正常时而VF异常。结论 NAION的PVEP的P100波峰时大多为正常或轻度延迟,当视乳头水肿、FFA后期视盘高荧光时P100波峰时明显延迟。FFA的ART延长不是NAION的敏感指标。PVEP对于视野正常的患眼有辅助诊断的价值。

关键词：非动脉炎性前部缺血性视神经病变图形视觉诱发电位视野荧光素眼底血管造影

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C57BL/***-Aec1Aec2干燥综合征模型小鼠干眼表型及性别差异研究

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第三军医大学学报 2015年第9期37卷 876-880页

作者：王贵渠赵琎徐海伟王一谢汉平第三军医大学西南医院全军眼科中心视觉损伤与再生修复重庆市重点实验室重庆400038

目的探讨C57BL/***-Aec1Aec2干燥综合征模型小鼠干眼体征严重程度及泪腺炎症反应与性别的关系。方法 C57BL/***-Aec1Aec2小鼠雌性和雄性组各45只,在生后第4、8、12、16、20周龄时进行泪液分泌实验(Schirmer’s testⅠ)、角膜荧光素染色... 详细信息

目的探讨C57BL/***-Aec1Aec2干燥综合征模型小鼠干眼体征严重程度及泪腺炎症反应与性别的关系。方法 C57BL/***-Aec1Aec2小鼠雌性和雄性组各45只,在生后第4、8、12、16、20周龄时进行泪液分泌实验(Schirmer’s testⅠ)、角膜荧光素染色及评分和泪腺组织HE染色、炎症细胞浸润计数评估及角膜上皮细胞表面微绒毛扫描电镜观察。结果第4周龄时,C57BL/***1Aec2雌、雄性小鼠均未出现明显的干眼体征。从第8周龄开始,随着周龄增加,2组小鼠泪液分泌值均逐渐减少;角膜荧光素染色及评分值均明显加重;HE染色显示泪腺组织腺管、腺泡等结构破坏及炎症细胞浸润程度逐渐加重;扫描电镜观察显示角膜上皮细胞脱落增多,微绒毛减少,细胞紧密连接减少或中断。第16周龄时,雌性小鼠组较同龄雄性小鼠组的泪液分泌值显著减少(P=0.035),角膜荧光素染色评分高(P=0.028),雌性小鼠泪腺组织破坏及炎症细胞浸润程度更严重(P=0.017)。结论雌性C57BL/***-Aec1Aec2干燥综合征模型成年小鼠干眼体征较雄性更为严重,推测可能与雌激素水平变化有关。

关键词：干眼 C57BL/6.NOD-Aec1Aec2小鼠性别炎症浸润

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数字化眼动仪对先天性特发性眼球震颤手术疗效的定量评估

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中华眼科杂志 2015年第6期51卷 439-444页

作者：杨红余涛姚军平台正王敏阴正勤第三军医大学西南医院西南眼科医院、重庆市视觉损伤与再生修复重点实验室重庆400038 武汉科技大学临床学院眼科重庆市广电集团

目的评估数字化眼动仪在先天性特发性眼球震颤（CIN）手术疗效判定中的可行性.方法采用自身配对设计对16例CIN患者进行数字化眼动仪检测的前瞻性研究,记录患者数字化眼动仪检测的相对静止区以及手术前后各偏转角度注视下的眼球震颤的... 详细信息

目的评估数字化眼动仪在先天性特发性眼球震颤（CIN）手术疗效判定中的可行性.方法采用自身配对设计对16例CIN患者进行数字化眼动仪检测的前瞻性研究,记录患者数字化眼动仪检测的相对静止区以及手术前后各偏转角度注视下的眼球震颤的频率、振幅、震强,用相关分析判断数字化眼动仪检测与临床观察之间相对静止区的一致性,配对样本t检验判断个体手术前后水平方向水平、垂直眼球震强的改善情况,并对左右侧25°内的间隔5°的各注视点手术前后相应位点的震强进行比较,记录各注视点改善的位点数.结果数字化眼动仪检测判定和临床观察之间的相对静止区一致性高（r=0.952,P＜0.01）;16例CIN患者中有9例手术前后水平震强改善（t=2.335～6.609,P＜0.05）,5例患者手术前后垂直震强改善（t=2.176～5.471,P＜0.05）;手术前后水平方向67.63％（117/173）的注视点水平震强得到改善,69.94％（121/173）的注视点的垂直震强得到改善.结论自行研制的数字化眼动仪能有效进行CIN患者手术前后眼球震颤的检测和定量评估手术疗效.

关键词：眼震先天性眼外科手术眼球运动检测诊断设备治疗结果

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Mitf和Pax6基因在小鼠胚胎干细胞向视网膜色素上皮细胞分化过程中的表达

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第三军医大学学报 2015年第9期37卷 827-832页

作者：吴昊芊彭广华阴正勤第三军医大学西南医院全军眼科中心、视觉损伤与再生修复重庆市重点实验室重庆400038 解放军总医院眼科北京100853

目的探讨Mitf和Pax6基因在小鼠胚胎干细胞(mouse embryonic stem cells,m ESCs)向视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞分化过程中的表达规律及其作用。方法免疫荧光染色、流式细胞仪检测分化前m ESCs株在不同代数的干... 详细信息

目的探讨Mitf和Pax6基因在小鼠胚胎干细胞(mouse embryonic stem cells,m ESCs)向视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞分化过程中的表达规律及其作用。方法免疫荧光染色、流式细胞仪检测分化前m ESCs株在不同代数的干性标志表达情况。采用悬浮培养加诱导剂形成拟胚体(embryoid bodies,EBs)的方式诱导m ESCs向RPE细胞分化,在分化前第0天,分化后第10、40天,采用流式细胞仪检测Mitf和Pax6在细胞中的表达规律及其与m ESCs向RPE细胞分化的关系。结果m ESCs株AB1在持续传代过程中形态一致且其干性标志SSEA1表达比例在不同代数之间差异无统计学意义(P>0.05)。分化所得细胞的RPE细胞成熟标志Bestropih、CRALBP、RPE65的表达比例分别为(61.6±2.4)%、(31.0±3.9)%、(57.8±2.0)%。在分化前第0天,Mitf、Pax6的表达比例分别为(1.7±1.5)%、(6.5±0.2)%,分化第10天分别为(28.5±7.2)%、(60.2±15.6)%,分化第40天分别为(5.7±2.1)%、(4.6±0.6)%。结论在m ESCs向RPE细胞的分化过程中,Mitf和Pax6均呈先上升后下降的趋势,提示Mitf和Pax6参与了RPE细胞的分化过程。

关键词：胚胎干细胞分化视网膜色素上皮细胞 Mitf Pax6

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三维培养hESCs来源视杯样组织中c-kit和SSEA-4的时空表达特点研究

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第三军医大学学报 2015年第12期37卷 1178-1182页

作者：付彩云曾玉晓黎其友高笠雄邹婷黄厚斌阴正勤解放军总医院眼科北京100853 第三军医大学西南医院全军眼科中心视觉损伤与再生修复重庆市重点实验室重庆400038

目的研究人胚胎干细胞(human embryonic stem cells,h ESCs)三维培养后形成的视杯样组织中c-kit和SSEA-4表达的时空特性。方法 H1人胚胎干细胞行三维培养和神经诱导分化,在分化7、14、21、30、49、70、90 d固定组织并行免疫荧光鉴定检测... 详细信息

目的研究人胚胎干细胞(human embryonic stem cells,h ESCs)三维培养后形成的视杯样组织中c-kit和SSEA-4表达的时空特性。方法 H1人胚胎干细胞行三维培养和神经诱导分化,在分化7、14、21、30、49、70、90 d固定组织并行免疫荧光鉴定检测c-kit和SSEA-4的表达,同时在相应时间点将分化组织消化成单细胞行流式细胞仪检测验证。结果三维培养第14天可见Rax+视泡(optic vesicle,OV)样结构,第30天形成具有内层Pax6+、外层Mitf+的双层视杯样(optic cup,OC)结构,第90天可见部分Crx+细胞。c-kit主要表达于h ESCs来源OV状及OC状的神经上皮样结构中,SSEA-4早期均匀表达于整个组织,晚期则主要集中于周边部。c-kit+细胞比例呈先升高(P<0.01)后下降(P<0.01)趋势,并在分化14 d达40%的峰值。SSEA-4+细胞比例从分化0 d至70 d持续下降(P<0.01),直到90 d一直维持于该低水平。结论在三维培养h ESCs来源OV或OC状组织中,c-kit基因随诱导分化而激活,且主要表达于神经上皮层,呈先增高后下降趋势。SSEA-4早期高表达于整个组织,之后逐渐减少至周边部并维持于低水平状态。

关键词：三维培养视杯 c-kit SSEA-4 胚胎干细胞

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小波变换提取谷氨酸代谢对大鼠视网膜电图b波的时频域贡献特征

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第三军医大学学报 2015年第12期37卷 1200-1203页

作者：戴加满阴正勤李世迎重庆大学生物工程学院重庆400040 第三军医大学西南医院全军眼科中心视觉损伤与再生修复重庆市重点实验室重庆400038

目的通过建立Müller细胞内谷氨酰胺合成酶损伤模型,探讨b波的时频域特征,检测谷氨酸代谢对b波时频域的影响。方法大鼠(Rcs-rdy!-p!)右眼注射4μL不同浓度(7、70、140μg/μL)的谷氨酸合成酶抑制剂(DL-AAA),左眼注射等计量PBS作为... 详细信息

目的通过建立Müller细胞内谷氨酰胺合成酶损伤模型,探讨b波的时频域特征,检测谷氨酸代谢对b波时频域的影响。方法大鼠(Rcs-rdy!-p!)右眼注射4μL不同浓度(7、70、140μg/μL)的谷氨酸合成酶抑制剂(DL-AAA),左眼注射等计量PBS作为对照组。采用RETI-scan系统,环形角膜电极和不锈钢针状电极,记录18只30 d龄大鼠系列暗适应视网膜电图。导出数据后,在Matlab7.1环境下自编程序行小波分析。行配对样本t检验统计学分析。结果时域特征:随着DLAAA浓度的增加,a、b波的幅值降低。在低浓度时双眼间无统计学差异,中、高浓度实验组a、b波幅值较对照组均明显降低(P<0.05,P<0.01),而b波的峰时未见明显变化。高浓度时,b/a及T1/2d均出现明显变化。频域特征:在设定包络阈值为0.8时,归一化处理后发现,低浓度时最小环比基本重合,而随着药物浓度的增加,实验组最小环比则明显增高(P<0.05),且离散度增高,同时最高峰值的时间点后延(P<0.05)。结论抑制谷氨酰胺合成酶后,视网膜内谷氨酸代谢出现异常,该变化对b波的贡献在时域上体现为早期成分,在频域上体现为慢相低频成分,且对维持视网膜功能稳定性起到重要作用。

关键词：谷氨酸代谢谷氨酰胺合成酶 b波小波分析

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