检索结果-内蒙古大学图书馆

Fas/FasL系统的功能主要是能诱导细胞的凋亡,但是,越来越多的证据显示Fas信号显现出与凋亡不相关的功能,如诱导细胞的增值和分化。我们和其他研究室的研究证明,Fas活化后的DC可大量分泌炎性细胞因子和趋化因子,介导炎症反应,越来越多的证据表明慢性炎症与肿瘤免疫耐受的形成密切相关。那么肿瘤内的Fas信号是否也可介导炎症

关键词：肺癌细胞 Fas 髓系抑制性细胞信号增强

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TBK1的磷酸化修饰及其分子调节机制

TBK1的磷酸化修饰及其分子调节机制

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第九届全国免疫学学术大会

作者：陈涛涌俞宙杨明金曹雪涛医学免疫学国家重点实验室暨第二军医大学免疫学研究所浙江大学免疫学研究所

研究背景:机体通过模式识别受体(PRR)识别微生物的多糖、蛋白和核苷酸等成分,产生炎症因子和Ⅰ型干扰素(IFNα/β),发挥抗细菌或抗病毒的免疫防御功能。TBK1(TANK binding kinase 1)及其同源分子IKKε可以活化IRF3、IRF7调节IFNα/β的... 详细信息

研究背景:机体通过模式识别受体(PRR)识别微生物的多糖、蛋白和核苷酸等成分,产生炎症因子和Ⅰ型干扰素(IFNα/β),发挥抗细菌或抗病毒的免疫防御功能。TBK1(TANK binding kinase 1)及其同源分子IKKε可以活化IRF3、IRF7调节IFNα/β的产生,在TLR、RIG-I以及dsDNA受体介导的抗感染天然免疫功能中发挥核心枢纽的作用。但是,TBK1活化的分子机制目前仍不清楚,尤其是蛋白激酶磷酸化修饰这一经典调控机制是否调节TBK1的激酶活性并调节Ⅰ型干扰素产生和抗病毒免疫反应还未有明确的结论。目的:探讨TBK1磷酸化修饰的关键位点并寻找磷酸化TBK1并活化TBK1的关键蛋白激酶。方法:首先采用蛋白质谱(MS)的方法分析TBK1在受到VSV病毒刺激后发生磷酸化修饰的潜在位点,然后借助于MS寻找能够与TBK1发生结合的蛋白激酶。采用点突变的方法突变MS发现的TBK1的磷酸化位点,结合IFNβ报告基因检测,验证TBK1发生功能性磷酸化修饰的位点;制备磷酸化位点特异性的单克隆抗体,验证VSV及HSV-1感染后TBK1发生磷酸化改变的位点。针对MS发现的蛋白激酶,使用siRNA的方法敲低其表达,通过q-PCR、ELISA和Western印迹的方法研究并寻找能够影响TBK1磷酸化并调节Ⅰ型干扰素产生的丝苏氨酸、酪氨酸蛋白激酶。借助于CRISPR-Cas9介导的基因组编辑技术删除相关蛋白激酶,验证其对TBK1磷酸化水平和激酶活性的影响。最后,使用体外激酶分析确认TBK1的上游蛋白激酶。结果:我们发现VSV刺激RAW264.7细胞后,TBK1在20余个丝/苏氨酸位点以及2个酪氨酸位点发生了磷酸化修饰。通过突变这些磷酸化位点结合报告基因分析,我们发现Ser93和Ryr179、Tyr185位点可能是TBK1的功能性磷酸化修饰位点。通过TBK1结合分子的MS分析,我们发现可能有20余种丝苏氨酸蛋白激酶和近10种酪氨酸蛋白激酶与TBK1的功能相关;通过siRNA敲低这些蛋白激酶,我们发现TAO3和c-Src可能是最为重要的促进TBK1磷酸化的上游蛋白激酶。TAO3敲低或者删除后,VSV和HSV-1诱导的TBK1的磷酸化(Ser72)显著下降,同时IFNα/β和水平显著降低,并且伴随TBK1激酶活性和IRF3磷酸化的降低;类似地敲低c-Src或删除c-Src的表达也可以显著抑制细胞抗病毒效应及TBK1的磷酸化和激酶活性。结论:磷酸化修饰是调节TBK1活性的重要调控机制,TAO3和c-Src可能是调节TBK1丝苏氨酸磷酸化以及酪氨酸磷酸化的关键激酶,这种经典的磷酸化调节模式可能在机体抗病毒过程中发挥关键的作用。

关键词： TBK1 磷酸化修饰蛋白激酶 I型干扰素抗病毒反应

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小鼠免疫抑制性受体mKLRL1的生物学功能及其基因治疗肿瘤的研究

小鼠免疫抑制性受体mKLRL1的生物学功能及其基因治疗肿瘤的研究

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第十四届全国肿瘤生物治疗大会

作者：李平郑月娟杨阳徐红梅钱程李楠曹雪涛于益芝第二军医大学免疫研究所暨医学免疫学国家重点实验室

免疫细胞表面受体在免疫细胞发挥免疫效应的过程中具有重要的作用,尤其是免疫抑制性和活化性受体,决定着免疫细胞的状态和功能,对于免疫抑制性受体及其负向调控作用的研究也引起了很多科学家的重视,成为免疫学领域的热门课题。本室曾通... 详细信息

免疫细胞表面受体在免疫细胞发挥免疫效应的过程中具有重要的作用,尤其是免疫抑制性和活化性受体,决定着免疫细胞的状态和功能,对于免疫抑制性受体及其负向调控作用的研究也引起了很多科学家的重视,成为免疫学领域的热门课题。本室曾通过大规模随机基因测序分别从人和小鼠DC的cD NA文库中获得一条含有C型凝集素样结构域（c-type lectin-like domain,CTLD）的新核苷酸序列,命名为杀伤细胞凝集素样受体L1（Killer cell Lectin-like Receptors L1,KLRL1,已在Gen Bank上登录,人和小鼠KLRL1登录号分别为AF247788和NM77686）。对于人KLRL1（h KLRL1）的研究表明,这是一个具有免疫抑制性功能的受体（Han Y…Cao ***;2004,104:2858-2866）。本研究深入探讨了mK LRL1与DCs、NK的功能关系,并观察了mK LRL1干扰型腺病毒基因治疗肿瘤的效果。对于mK LRL1生化特性的分析表明,mK LRL1在真核细胞内表达为糖基化蛋白分子,且该分子的天然形式可能存在两种糖基化修饰状态。由于mK LRL1主要表达于DCs、NK、T细胞和单核巨噬细胞系,鉴于DCs在免疫应答中的独特功能,我们进一步分析了在DCs成熟、活化过程中mK LRL1的表达水平变化,结果显示mK LRL1可能对于未成熟DCs的功能有着很重要的作用,也可能参与对DCs成熟的调控。抑制mK LRL1在免疫细胞中的表达有助于深入分析其功能,为此我们合成了3对针对KLRL1的干扰小RNA,发现一对干扰效率高的小RNA分子,遂以该片段构建干扰腺病毒载体,同时也构建了mK LRL1的重组腺病毒,结果表明组成性的表达mK LRL1分子对DCs的表型无明显影响,与成熟DCs相比,mK LRL1修饰的DCs吞噬能力明显增强,该DCs与T细胞混合培养时刺激T细胞的增殖能力减弱,促进抗原特异性T细胞增殖的能力也降低,且修饰后的DCs分泌更多的IL-10,但TNF-α分泌明显减少,表现为对DCs功能的负向调控作用。我们还发现mK LRL1作为一种免疫抑制性受体可以抑制NK细胞的杀伤活性。我们进一步我们构建了CT26的肿瘤模型,然后通过注射干扰腺病毒观察了其抗肿瘤效应,瘤体内注射干扰病毒的小鼠表现为肿瘤生长明显减慢。总之,我们的研究结果表明mK LRL1作为抑制性受体既阴性调节DCs的功能,也抑制NK细胞的细胞毒活性,还有可能作为基因治疗肿瘤的新靶点。

关键词： C型凝集素样结构域杀伤细胞受体 NK细胞细胞毒作用免疫受体酪氨酸相关的抑制性基序肿瘤基因治疗

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MiR-142-5p通过靶向IGF2BP3调控多柔比星诱导的肝癌细胞凋亡

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中国肿瘤生物治疗杂志 2017年第6期24卷 581-587页

作者：胡烨许小青王冰晶徐贺楠侯晋罗晓玲梁安民曹雪涛中国医学科学院北京协和医学院基础医学研究所北京100006 第二军医大学免疫学研究所暨医学免疫学国家重点实验室上海200433 广西医科大学附属肿瘤医院广西南宁530021

目的:探讨miR-142-5p对多柔比星诱导的原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)细胞凋亡的影响及其作用机制。方法:收集广西医科大学附属肿瘤医院88例HCC患者手术切除的癌组织及癌旁组织(距癌灶组织边缘2~5 cm)标本。采用实时荧... 详细信息

目的:探讨miR-142-5p对多柔比星诱导的原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)细胞凋亡的影响及其作用机制。方法:收集广西医科大学附属肿瘤医院88例HCC患者手术切除的癌组织及癌旁组织(距癌灶组织边缘2~5 cm)标本。采用实时荧光定量PCR检测人HCC组织和癌旁组织、人正常肝细胞以及HCC细胞系中miR-142-5p的表达量。向HCC细胞SMMC-7721中转染miR-142-5p mimics,流式细胞术检测过表达miR-142-5p后SMMC-7721细胞在多柔比星(doxorubicin)(1μg/ml)诱导下凋亡的变化;生物信息学方法预测miR-142-5p可靶向结合胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白3(insulin-like growth factor 2 mRNA-binding protein 3,IGF2BP3)基因,并采用荧光素酶报告基因实验进行验证。采用实时荧光定量PCR及Western blotting检测过表达miR-142-5p的SMMC-7721细胞中IGF2BP3的mRNA及蛋白表达情况。结果:与癌旁组织和正常肝细胞相比,HCC组织(-6.91±2.61 vs-11.59±2.59,P<0.01)和多种HCC细胞系中miR-142-5p呈明显低表达(均P<0.01);过表达miR-142-5p可显著促进多柔比星诱导的HCC细胞SMMC-7721的凋亡[(49.40±3.47)%vs(19.50±1.74)%,P<0.01];过表达miR-142-5p可明显降低HCC细胞中IGF2BP3的mRNA及蛋白表达水平(P<0.01),敲减IGF2BP3表达可进一步促进多柔比星诱导的SMMC-7721细胞的凋亡(P<0.01)。荧光素酶报告基因实验结果显示,miR-142-5p能够抑制IGF2BP3的3'UTR荧光素酶报告基因的活性。结论:miR-142-5p在HCC组织标本和体外培养细胞系中的表达水平均显著降低,转染miR-142-5p mimics后能够促进多柔比星诱导的HCC细胞的凋亡,其机制可能与miR-142-5p靶向作用IGF2BP3从而促进HCC细胞凋亡有关。

关键词：肝细胞癌 miR-142-5p 多柔比星凋亡胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白3基因

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RasGRP3抑制巨噬细胞Toll样受体介导的炎症反应

RasGRP3抑制巨噬细胞Toll样受体介导的炎症反应

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第九届全国免疫学学术大会

作者：陈涛涌唐松青曹雪涛王建莉医学免疫学国家重点实验室暨第二军医大学免疫学研究所浙江大学免疫学研究所

研究背景:Toll样受体(TLR)的活化是一把双刃剑,过度的活化则导致损伤性的炎症反应和继发的自身免疫病,因此TLR的信号传导必须受到严格的调控。小G蛋白(如Ras、Rap)是一种分子量较小的可以结合GTP/GDP并水解GTP的重要蛋白质家族,其与TLR... 详细信息

研究背景:Toll样受体(TLR)的活化是一把双刃剑,过度的活化则导致损伤性的炎症反应和继发的自身免疫病,因此TLR的信号传导必须受到严格的调控。小G蛋白(如Ras、Rap)是一种分子量较小的可以结合GTP/GDP并水解GTP的重要蛋白质家族,其与TLR信号传导的关系目前研究极少,尤其是小G蛋白分子的调控分子与TLR以及天然免疫的关系目前尚未见相关报导。目的:探讨Ras鸟苷酸释放蛋白(Ras guanine nucleotide-releasing protein,RasGRP)对于TLR信号传导的调控作用及其分子机制。方法:首先使用q-PCR等方法探讨巨噬细胞中RasGRP1-4分子在TLR活化后的表达水平和变化趋势,寻找巨噬细胞优势表达的RasGRP分子。采用siRNA敲低相应RasGRP分子的表达后,采用不同浓度TLR配体处理巨噬细胞,q-PCR和ELISA方法检测细胞因子的表达水平以明确RasGRP分子的效应,并通过Western印迹检测TLR信号通路的改变。通过转基因小鼠的方法,建立高表达RasGRP3和功能缺陷的RasGRP3的转基因小鼠,使用TLR配体模拟感染的模型、Ⅱ型胶原诱导的关节炎(CIA)模型以及DSS诱导的结肠炎模型探讨RasGRP3在炎症反应中的作用。最后,采用CRISPR-Cas9介导的基因组编辑技术删除RAW264 7细胞RasGRP3的表达,验证其对TLR的调节效应和机制。结果:我们发现RasGRP3是巨噬细胞中优势表达的RasGRP分子,敲低RasGRP3的表达显著促进TLR3/4/9诱导的炎症因子TNF、IL-1β、IL-6和iNOS的表达或分泌,抑制Rap1的活化,提示RasGRP3通过活化Rap1负向调节TLR的信号传导,抑制巨噬细胞炎症炎症的产生。在模拟感染的转基因小鼠模型里,我们发现过表达RasGRP3的小鼠在受到TLR3/4/9配体刺激后,IL-6的产生显著下降;在CIA模型里,过表达RasGRP3的小鼠前肢关节表现为显著减弱的软骨损伤和显著改善的临床症状;在DSS诱导结肠炎模型里,过表达RasGRP3的小鼠结肠中炎症细胞的浸润和结肠损伤也显著抑制。信号分子的研究发现,RasGRP3促进Akt的去磷酸化但抑制ERK1/2的活化。结论:RasGRP3是重要的负向调节TLR信号传导的分子,RasGRP3通过抑制ERK1/2的活化抑制炎症因子的产生,在多种炎症性疾病中发挥保护作用,可能是巨噬细胞负向调节TLR活化的重要"刹车"机制。

关键词： TLR RasGRP3 Rap1 炎症反应巨噬细胞

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新型MIP-2γ/GM-CSF融合蛋白对DC的双重生物学功能及相关机制研究

新型MIP-2γ/GM-CSF融合蛋白对DC的双重生物学功能及相关机制研究

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中国免疫学会第十届全国免疫学学术大会

作者：张意陈国友王建莉于益芝蒋应明周维明曹雪涛第二军医大学免疫学教研室暨医学免疫学国家重点实验室浙江大学免疫学研究所

目的：制备新型MIP-2γ/GM-CSF细胞因子融合蛋白，研究其趋化和激活DC的双重生物学功能.方法：通过基因工程方法构建高表达MIP-2γ/GM-CSF融合蛋白的2种***酵母工程菌株，并优化发酵、纯化条件，制备了高纯度的MIP-2g/hGM-CSF、MIP-2g/m...

目的：制备新型MIP-2γ/GM-CSF细胞因子融合蛋白，研究其趋化和激活DC的双重生物学功能.方法：通过基因工程方法构建高表达MIP-2γ/GM-CSF融合蛋白的2种***酵母工程菌株，并优化发酵、纯化条件，制备了高纯度的MIP-2g/hGM-CSF、MIP-2g/mGM-CSF融合蛋白.首先以Transwell体系检测融合蛋白对树突状细胞DC的诱导迁移效应.接着以流式细胞仪分析重组蛋白对DC表型的影响，检测其作用DC后引起的MLR反应和细胞因子分泌情况.进行动物体内实验，研究MIP-2γ/GM-CSF融合蛋白对CT26细胞转染的荷瘤小鼠的抗肿瘤效应，并研究了其相关的作用机制.

关键词：

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新型MIP-2γ/GM-CSF融合蛋白对DC的双重生物学功能及相关机制研究

新型MIP-2γ/GM-CSF融合蛋白对DC的双重生物学功能及相关机制研究

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第六届全国免疫学学术大会

作者：张意陈国友王建莉于益芝蒋应明卢琳曹雪涛第二军医大学免疫学研究所暨医学免疫学国家重点实验室浙江大学免疫研究所

[背景]:γ型巨噬细胞炎性蛋白(MIP-2γ)是我们从人树突状细胞(DC)的cDNA文库中独立克隆的一个不含ELR基序的新型CXC类趋化因子。初步研究表明MIP-2γ不仅对未成熟DC、造血干/祖细胞等造血、免疫细胞具有趋化作用。GM-CSF述可以促进DC

关键词： CSF 生物学功能 GM-CSF MIP-2 特异性免疫相关机制

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新型MIP-2γ/GM-CSF融合蛋白对DC的双重生物学功能及相关机制研究

新型MIP-2γ/GM-CSF融合蛋白对DC的双重生物学功能及相关机制研究

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第十届全国免疫学学术大会

作者：张意陈国友王建莉于益芝蒋应明周维明曹雪涛第二军医大学免疫学教研室暨医学免疫学国家重点实验室浙江大学免疫学研究所

目的 :制备新型MIP-2γ/GM-CSF细胞因子融合蛋白,研究其趋化和激活DC的双重生物学功能。方法 :通过基因工程方法构建高表达MIP-2γ/GM-CSF融合蛋白的2种***酵母工程菌株,并优化发酵、纯化条件,制备了高纯度的MIP-2g/h GM-CSF、MIP-2g/m ... 详细信息

目的 :制备新型MIP-2γ/GM-CSF细胞因子融合蛋白,研究其趋化和激活DC的双重生物学功能。方法 :通过基因工程方法构建高表达MIP-2γ/GM-CSF融合蛋白的2种***酵母工程菌株,并优化发酵、纯化条件,制备了高纯度的MIP-2g/h GM-CSF、MIP-2g/m GM-CSF融合蛋白。首先以Transwell体系检测融合蛋白对树突状细胞DC的诱导迁移效应。接着以流式细胞仪分析重组蛋白对DC表型的影响,检测其作用DC后引起的MLR反应和细胞因子分泌情况。进行动物体内实验,研究MIP-2γ/GM-CSF融合蛋白对CT26细胞转染的荷瘤小鼠的抗肿瘤效应,并研究了其相关的作用机制。结果 :制备了符合生物学功能实验要求的MIP-2γ/h GM-CSF融合蛋白、MIP-2γ/m GM-CSF融合蛋白。体外实验证实MIP-2γ/GM-CSF融合蛋白具有比MIP-2γ更强的趋化DC活性,能更有效地促进DC成熟、刺激MLR反应中反应性T细胞增殖,更显著促进IL-12p70、IL-1β和TNF-α分泌,这些表明融合蛋白能更有效提高DC诱导的特异性免疫反应。信号传导通路研究提示较之MIP-2γ、GM-CSF和两者联用,融合蛋白发挥更佳生物学效应的机制可能与其能更有效激发NF-k B信号通路有关。动物体内实验表明,MIP-2γ/GM-CSF融合蛋白还具有积极的抗肿瘤效应,能显著提高转染CT26的BALB/c荷瘤小鼠生存率,并有效抑制肿瘤生长、转移。病理学分析显示融合蛋白可以趋引树突状细胞和CD8+T细胞在肿瘤微环境浸润。结论:MIP-2γ/GM-CSF融合蛋白具有趋化DC和激活DC的双重功能,显著提高DC诱导的特异性免疫反应,具有治疗肿瘤的潜能,有可能成为一种具有自主知识产权的基因工程新型细胞因子产品,具有良好的应用开发前景。

关键词：巨噬细胞炎性蛋白 -2γ融合蛋白趋化激活DC

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