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2005全国第二届核酸疫苗研讨会

作者：李凯万斌胡振林何晓文何颖姜磊孙树汉第二军医大学医学遗传学教研室第二军医大学医学遗传学教研室第二军医大学医学遗传学教研室第二军医大学医学遗传学教研室第二军医大学医学遗传学教研室第二军医大学医学遗传学教研室第二军医大学医学遗传学教研室

动脉粥样硬化(Atherosclerosis AS)是目前人类发病率最高、危害最大的疾病之一,现已明确AS的发生是一个多种因素在多层次上综合作用的过程,巨噬泡沫细胞是动脉粥样硬化斑块早期损伤、脂质条纹的主体,在动脉粥样硬化病理过程中起主要作用... 详细信息

动脉粥样硬化(Atherosclerosis AS)是目前人类发病率最高、危害最大的疾病之一,现已明确AS的发生是一个多种因素在多层次上综合作用的过程,巨噬泡沫细胞是动脉粥样硬化斑块早期损伤、脂质条纹的主体,在动脉粥样硬化病理过程中起主要作用,巨噬泡沫细胞的形成及其作用是动脉粥样硬化斑块损伤形成、发展和崩解的关键。CpG基序(CpG-motif)又称为免疫激活序列,对CpG基序的认识始于对细菌的DNA组份(bDNA)激活哺乳动物免疫系统作用的研究,进一步的实验证明发挥作用的主要是bDNA中的一些以未甲基化的CpG二核苷酸对为核心的碱基序列,而且含有这类序列的寡核苷酸(CpG-ODN)也具有与bDNA类似的免疫激活作用,能够直接激活巨噬细胞、树突状细胞和B细胞等抗原呈递细胞,诱导多种Th-1型细胞因子分泌,上调共刺激分子表达等。但其是否影响巨噬细胞的形成未见报道。我们在利用基因表达谱芯片研究CpG-ODN对巨噬细胞基因表达谱影响的研究中,发现CpG-ODN刺激巨噬细胞后,两次芯片杂交筛选出重复差异表达的基因119条,其中有3条与泡沫细胞形成相关的基因受CpG-ODN调控。这3条基因分别为CD36、脂蛋白脂酶和Fc 2b受体。这些基因与泡沫细胞和动脉粥样硬化斑块的形成关系密切。为进一步研究CpG-ODN对巨噬泡沫细胞形成及相关基因的调控作用,首先要确证芯片杂交的结果。我们采用半定量RT-PCR技术对相关基因的差异表达进行了验证,采用组化染色的方法评估巨噬细胞泡沫化的程度,通过高效液相法测定细胞内的胆固醇及胆固醇酯。RT-PCR进一步验证了上述3条基因表达增高受CpG-ODN调控。细胞形态学分析和HPLC测定均说明经CpG-ODN刺激后,细胞内脂质增多。这些结果提示免疫激活剂CpG-ODN可增强巨噬细胞对氧化型低密度脂蛋白的摄取和消化,抑制细胞内胆固醇的合成,进而可能影响泡沫细胞和动脉粥样硬化斑块的形成。

关键词： CpG寡核苷酸动脉粥样硬化巨噬泡沫细胞低密度脂蛋白基因表达谱芯片

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CpG-ODN与受体TLR9在酸性内体中的结合及信号转导的触发

CpG-ODN与受体TLR9在酸性内体中的结合及信号转导的触发

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2005全国第二届核酸疫苗研讨会

作者：李凯胡振林何颖何晓文姜磊孙树汉第二军医大学医学遗传学教研室第二军医大学医学遗传学教研室第二军医大学医学遗传学教研室第二军医大学医学遗传学教研室第二军医大学医学遗传学教研室第二军医大学医学遗传学教研室

CpG-ODN作为极具临床应用前景的新型免疫调节剂近年来广受关注,但对其细胞内分子作用机制尚有许多问题有待阐明。最近的研究发现CpG-ODN的特异性识别受体可能是一种膜蛋白TLR9。我们在研究中发现CpG-ODN仅在偏酸pH条件下与免疫细胞膜特... 详细信息

CpG-ODN作为极具临床应用前景的新型免疫调节剂近年来广受关注,但对其细胞内分子作用机制尚有许多问题有待阐明。最近的研究发现CpG-ODN的特异性识别受体可能是一种膜蛋白TLR9。我们在研究中发现CpG-ODN仅在偏酸pH条件下与免疫细胞膜特异结合并显示更强的免疫激活作用,据此推测CpG-ODN系于酸性内体中与其识别受体TLR9结合。为证实上述推测,提出进行以下研究:(1)、分析pH对重组TLR9结合CpG-ODN的影响;(2)、利用共聚焦激光扫描显微镜分析CpG—ODN与TLR9及其下游信号分子MyD88的细胞内共存部位及其与内体的关系。该课题于2004年提出申请后获得了国家自然基金的资助,批准我们进行申请内容的研究,目前,(1)部分研究内容已基本完成,我们已获得了小鼠TLR9的全长cDNA克隆,并于COS细胞内表达了其胞外区部分,进而以凝胶阻滞实验研究了CpG-ODN与重组表达的TLR9胞外区的相互作用,结果提示在微偏酸性(pH 6.4)条件下CpG-ODN可以更高的亲和力与TLR9结合,并显示一定的CpG序列选择性。这些结果为证实我们的上述推测提供了重要的实验依据。

关键词： CpG-寡核苷酸受体内体

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Annexin B1单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立和特性鉴定

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第二军医大学学报 2005年第12期26卷 1347-1349页

作者：高远舰王俊霞王凯慧张毅颜宏利孙树汉第二军医大学基础医学部医学遗传学教研室上海200433 河北医科大学实验动物中心石家庄050017

目的:制备抗Annexin B1单克隆抗体,为进一步研究Annexin B1的生理功能奠定基础。方法:制备了具有抗原性的Annexin B1,并采用脾内包埋法免疫小鼠,无菌取出脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,随后以ELISA方法和有限稀释法进行3次筛选和亚... 详细信息

目的:制备抗Annexin B1单克隆抗体,为进一步研究Annexin B1的生理功能奠定基础。方法:制备了具有抗原性的Annexin B1,并采用脾内包埋法免疫小鼠,无菌取出脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,随后以ELISA方法和有限稀释法进行3次筛选和亚克隆。结果:用杂交瘤技术,我们获得了1株杂交瘤细胞株,能稳定地分泌高滴度的针对Annexin B1的特异单抗。结论:成功筛选并制备了Annexin B1的特异单抗,为下一步功能研究打下了良好的基础。

关键词：膜联蛋白B1 杂交瘤单克隆抗体

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乙肝DNA疫苗对树突状细胞刺激T细胞增殖活性的影响

乙肝DNA疫苗对树突状细胞刺激T细胞增殖活性的影响

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2005全国第二届核酸疫苗研讨会

作者：李德安何晓文孙树汉第二军医大学医学遗传学教研室第二军医大学医学遗传学教研室第二军医大学医学遗传学教研室

构建了带有middle HBsAg基因的质粒pVAX-Mid作为乙肝DNA疫苗。根据之前在DNA疫苗-亚单位疫苗联合免疫方面取得的成果,我们用4组C57小鼠进行3次接种,间隔为4周,分别接种2种不同的疫苗:DNA疫苗pVAX-Mid和亚单位疫苗HBsAg。第三次接种后第2... 详细信息

构建了带有middle HBsAg基因的质粒pVAX-Mid作为乙肝DNA疫苗。根据之前在DNA疫苗-亚单位疫苗联合免疫方面取得的成果,我们用4组C57小鼠进行3次接种,间隔为4周,分别接种2种不同的疫苗:DNA疫苗pVAX-Mid和亚单位疫苗HBsAg。第三次接种后第21天处死所需的组,取脾脏和股骨。脾脏先制备成单细胞悬液,用Hypaque-Ficoll密度梯度离心得到单个核细胞,再用尼龙毛吸附法分离出T细胞。从股骨得到的骨髓细胞悬浮于完全培养液中,加在6孔板中37℃,5%CO2孵育48 h得到贴壁细胞,再加入mGM-CSF和mIL-4在体外培养并被诱导成成熟的树突状细胞。以得到的T细胞和树突状细胞做混合淋巴细胞反应,结果显示D-D-S组的小鼠树突状细胞能最有效地刺激T细胞增殖。用流式细胞仪检测树突状细胞的表面抗原显示,经过DNA疫苗免疫的小鼠其树突状细胞表达的CD80、CD83和CD86均显著高于非免疫组(P<0.05)。以上结果提示乙肝DNA疫苗能有效激活树突状细胞使机体产生细胞免疫,其机制可能在于树突状细胞表面的共刺激分子表达的上调。

关键词：乙肝 DNA疫苗树突状细胞联合免疫

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肝组织特异表达人核受体nr5a2转基因小鼠的构建(英文)

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Acta Genetica Sinica 2005年第12期32卷 1241-1247页

作者：王水良杨桦谢幼华汪垣厉建中王龙王铸钢傅继梁第二军医大学医学遗传学教研室中国科学院上海生命科学院生化和细胞生物研究所上海200031 上海南方模式生物研究中心上海201203

人乙肝病毒增强子ⅡB1结合因子(hB1F)系FtzF1(NR5A)亚家族的新成员。经基因重组法将人hb1fcDNA置于小鼠白蛋白增强子/启动子序列下游构建成肝特异重组载体,通过原核显微注射将该载体导入小鼠受精卵原核,经注射且状态良好的卵回输至假孕... 详细信息

人乙肝病毒增强子ⅡB1结合因子(hB1F)系FtzF1(NR5A)亚家族的新成员。经基因重组法将人hb1fcDNA置于小鼠白蛋白增强子/启动子序列下游构建成肝特异重组载体,通过原核显微注射将该载体导入小鼠受精卵原核,经注射且状态良好的卵回输至假孕母鼠输卵管。产下仔鼠经PCR和Southernblotting鉴定,同时RTPCR和Westernblotting分析转基因的表达。阳性Founder鼠与正常C57鼠交配以建立转基因纯系小鼠,F1代以PCR法鉴定。结果共获得4只PCR鉴定转基因阳性Founder鼠,其中一只同时经Southernblotting鉴定为阳性。RTPCR和Westernblotting结果显示,外源基因在转基因小鼠的肝组织成功表达。遗传学分析表明,转基因已整合入小鼠基因组并可稳定遗传。

关键词：核受体转基因小鼠肝特异基因表达 NR5A2(hB1F)

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DNA疫苗诱导的小鼠抗肿瘤特异性细胞免疫和体液免疫

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中国癌症杂志 2005年第4期15卷 309-312页

作者：王中川傅传刚王庆敏何天霖郝立强孙树汉第二军医大学附属长海医院肛肠外科上海200433 第二军医大学医学遗传学教研室上海200433

目的:检测以双表达质粒pIRES为载体构建的带有全序列癌胚抗原(CEA)基因和IL-2基因的核苷酸疫苗对机体特异性抗肿瘤免疫反应的激活效果。方法:利用分子生物学技术,将CEA基因片段和IL-2基因片段连接于真核双表达质粒pIRES中,用肌内注射方... 详细信息

目的:检测以双表达质粒pIRES为载体构建的带有全序列癌胚抗原(CEA)基因和IL-2基因的核苷酸疫苗对机体特异性抗肿瘤免疫反应的激活效果。方法:利用分子生物学技术,将CEA基因片段和IL-2基因片段连接于真核双表达质粒pIRES中,用肌内注射方法接种核酸疫苗;检测疫苗在小鼠肌肉组织中的表达情况及其对小鼠脾细胞CEA特异性细胞免疫和体液免疫反应的激活效果。结果:小鼠经肌内注射质粒后,免疫组化证实该核酸疫苗可在体内有效表达CEA分子;免疫检测显示注射后小鼠血清中出现抗CEA抗体,脾细胞IL-4分泌增强,特异性淋巴细胞增值反应明显并伴有自然杀伤细胞NK活性显著增高。结论:实验所构建的核酸疫苗pIRES-CEA,pIRES-IL-2,pIRES-IL-2等可在小鼠体内高效表达并表现出良好的免疫原性。

关键词： DNN疫苗癌胚抗原大肠癌白细胞介素-2

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癌胚抗原与γ-干扰素核酸疫苗对机体特异性细胞免疫的激活作用

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肿瘤防治杂志 2005年第14期12卷 1041-1044页

作者：王中川傅传刚何天霖郝立强王庆敏孙树汉第二军医大学附属长海医院肛肠外科上海200433 第二军医大学医学遗传学教研室上海200433

目的检测以双表达质粒pIRES为载体构建的带有全序列癌胚抗原(carcinoembry-onic antigens,CEA)基因和γ-干扰素(interfer-on-γ,IFN-γ)基因的核苷酸疫苗对机体特异性抗肿瘤免疫反应的激活效果。方法利用分子生物学技术,将CEA基因片段和... 详细信息

目的检测以双表达质粒pIRES为载体构建的带有全序列癌胚抗原(carcinoembry-onic antigens,CEA)基因和γ-干扰素(interfer-on-γ,IFN-γ)基因的核苷酸疫苗对机体特异性抗肿瘤免疫反应的激活效果。方法利用分子生物学技术,将CEA基因片段和IFN-γ基因片段连接于真核双表达质粒pIRES中,用肌肉注射方法接种核酸疫苗;检测疫苗在小鼠肌肉组织中的表达及其对小鼠脾细胞CEA特异性细胞免疫反应的激活效果。结果小鼠经肌肉注射质粒后,核酸疫苗可在体内有效表达CEA和IFN-γ分子;小鼠特异性淋巴细胞增殖反应明显增高,并且伴有自然杀伤细胞(natural killercell,NK细胞)活性显著增高,F=15289·67,P<0·001。结论实验所构建的核酸疫苗pIRES-CEA、pIRES-CEA-IFN-γ和pIRES-CEA-IFN-γ等可在小鼠体内高效表达,并表现出良好的细胞免疫原性。

关键词：癌胚抗原/免疫学干扰素Ⅱ型/免疫学杀伤细胞,天然基因表达聚合酶链反应

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卡介菌基因组DNA制备工艺研究

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中国生物制品学杂志 2005年第1期18卷 36-38页

作者：王静胡振林周凤娟凌亦凌孙树汉河北医科大学病理生理教研室石家庄050017 第二军医大学基础医学部医学遗传学教研室上海200433

目的　摸索制备高纯度卡介菌 (MycobacteriumbovisBacillusCalmette Gu啨ｒｉｎ ,BCG)基因组DNA(BCG -DNA)的制备工艺。方法　采用超声破碎结核杆菌 ,加热使蛋白变性初步去除菌体蛋白 ,进一步经蛋白酶消化 ,乙醇沉淀DNA组分 ,再经离子... 详细信息

目的　摸索制备高纯度卡介菌 (MycobacteriumbovisBacillusCalmette Gu啨ｒｉｎ ,BCG)基因组DNA(BCG -DNA)的制备工艺。方法　采用超声破碎结核杆菌 ,加热使蛋白变性初步去除菌体蛋白 ,进一步经蛋白酶消化 ,乙醇沉淀DNA组分 ,再经离子交换和凝胶过滤层析 ,去除残余菌体蛋白和多糖 ,精制DNA ,并进行质量检测。结果　所制备的BCG -DNA片段大小介于 2 0 0～ 2 5 0bp之间 ,纯度大于 95 % ,蛋白含量占 0 . 1% ,多糖残留占 3 .5 %。结论此方法制备的BCG- DNA纯度较高 ,且无有机溶剂残留 ,适用于BCG DNA制备。

关键词： BCG 卡介菌多糖结核杆菌超声 DNA 酶消化制备工艺高纯度去除

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卡介苗基因组DNA对哮喘小鼠模型过敏性气道炎症的影响

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中国呼吸与危重监护杂志 2005年第5期4卷 352-354,347,i0001页

作者：商艳李强胡振林施柯周凤娟刘忠令孙树汉第二军医大学长海医院呼吸内科上海200433 第二军医大学医学遗传学教研室

目的探讨腹腔注射卡介苗基因组DNA(BCGDNA)对哮喘小鼠模型的影响。方法BALB/c小鼠经鸡卵蛋白(OVA)免疫建立哮喘模型,分别于致敏前、激发时腹腔注射100μgBCGDNA,观察哮喘小鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)中细胞总数和嗜酸性粒细胞数(EOS),EL... 详细信息

目的探讨腹腔注射卡介苗基因组DNA(BCGDNA)对哮喘小鼠模型的影响。方法BALB/c小鼠经鸡卵蛋白(OVA)免疫建立哮喘模型,分别于致敏前、激发时腹腔注射100μgBCGDNA,观察哮喘小鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)中细胞总数和嗜酸性粒细胞数(EOS),ELISA检测脾单核细胞(SMNC)培养上清和BALF中白细胞介素4(IL4)、IL5、IL12及γ干扰素(IFNγ)的含量变化,常规病理切片观察肺内炎症情况,ABPAS染色观察杯状细胞增生和黏液分泌情况。结果哮喘小鼠OVA致敏前及激发时腹腔注射BCGDNA后可明显增加BALF和脾单核细胞培养上清中IL12和IFNγ的产生,使IL4和IL5的产生减少,BALF中嗜酸性粒细胞减少,黏液过度分泌明显减轻。结论哮喘小鼠腹腔注射BCGDNA可诱导IL12和IFNγ产生,抑制Th2型细胞反应,减轻哮喘气道炎症。

关键词：卡介苗基因组DNA 哮喘小鼠动物模型过敏性气道炎症

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中国人HNPCC家系中hMSH2基因新突变及其功能分析

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第二军医大学学报 2005年第8期26卷 888-891页

作者：金黑鹰颜宏利宋立华崔龙丁义江孙树汉南京中医药大学附属南京市中医院全国肛肠医疗中心南京210001 第二军医大学基础医学部医学遗传学教研室上海200433 上海交通大学食品科学与工程系上海201101 第二军医大学长海医院肛肠外科上海200433

目的:报道1个在中国人遗传性非息肉病性结直肠癌(HNPCC)家系中发现的基因突变,并对其功能进行分析。方法:抽提1组符合Amsterdam标准的HNPCC家系先证者和其他家系成员的基因组DNA,PCR扩增先证者hMLH119个外显子和hMSH216个外显子,利用变... 详细信息

目的:报道1个在中国人遗传性非息肉病性结直肠癌(HNPCC)家系中发现的基因突变,并对其功能进行分析。方法:抽提1组符合Amsterdam标准的HNPCC家系先证者和其他家系成员的基因组DNA,PCR扩增先证者hMLH119个外显子和hMSH216个外显子,利用变性高效液相技术(dHPLC)筛查,对异常峰型利用DNA测序方法检测基因突变。发现先证者hMSH2基因存在错义突变后,对家系中其他成员和50名散发性大肠癌患者和100名正常成年人进行相同位点的检测,以判定是单核苷酸多态性位点(SNP)还是突变。利用5对微卫星标记对该家系中的2例肿瘤进行微卫星不稳定分析,免疫组化检测蛋白表达,利用同源建模方法对发现的突变位点进行功能分析,以研究突变的病理意义。结果:在该家系的2例结肠癌患者中均发现hMSH2基因第13外显子2108位出现CA的错义突变,导致703位Ser变异为Tyr,即C.2108C>A(***703Tyr),微卫星结果显示2例肿瘤均为微卫星高度不稳定(MSIH),肿瘤免疫组化结果显示hMSH1基因表达正常而hMSH2基因不表达。同源建模发现该位点与目前报道的hMSH2基因突变不同,突变位于第Ⅳ结构域,Ser突变为Tyr后空间位阻增大,影响了蛋白的正常折叠和功能。结论:Ser703Tyr是中国人HNPCC的一个新的病理性突变。

关键词：结直肠肿瘤,遗传性非息内性 hMSH2 突变

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