一、研究背景心血管疾病已经成为当今世界对人类健康危害最严重的一类疾病,而随着人们物质生活水平的不断提高、人口老龄化的不断发展,心血管疾病的患病率仍会呈现持续增加趋势。作为心血管疾病的典型代表,急性心肌梗塞或心肌梗死(myocardial infarction, MI)具有较高的死亡率和发病率,是全球范围内重大的健康问题之一。依据世界卫生组织(World Health Organization,WHO)的数据,心肌梗死占到目前全球死亡的30%,同时预计到2030年每年至少有2300万人死于该病发作,且其发病率呈逐年上升趋势。其中心肌细胞受损和缺血是心肌梗死中最常见的病理改变,而成年心肌细胞作为一种高度分化的终末细胞,一般认为其不能再生。目前,对于急性心肌梗死的病人,我们通常会及时的应用药物治疗以及PCI等手段进行治疗,旨在及早高效的恢复心梗后缺血心肌血液供应,阻止心肌缺血性损伤的进一步发展、加重,减少心肌梗死面积,从而最终改善心肌梗死临床预后。尽管当前我们对于心肌梗死的治疗取得了长足的进步,但仍无法从根本上逆转心室重构以及后续的心功能不全与心力衰竭,这也就意味着我们的治疗手段仅能控制、减小心肌梗死所带来的不良预后,而不能从根本上达到“救治”已经受损的心肌细胞甚至“治愈”的效果。当前,利用干细胞治疗心肌梗死的研究已成为心血管疾病的一个重要研究领域,并得到广泛的关注和研究,已有多种干细胞在实验室或临床应用于心肌梗死的干细胞治疗中,主要包括骨髓源间充质干细胞、脂肪源间充质干细胞、诱导多能性干细胞及胚胎干细胞等,虽然取得了一定的治疗效果,但这种效果是不稳定且不显著的,同时诱导多功能干细胞和胚胎干细胞治疗还面临着致瘤性和伦理学问题。心肌球源性干细胞(cardiosphere-derived cells ,CDC)是由心脏组织块培养而来,表达c-kit及Islet-1心肌组细胞以及众多周围支持细胞共同组成的心脏源性细胞亚群,可稳定传代的干细胞。一项最新的CADUCEUS临床研究表明,经冠脉移植自源性心肌球源性干细胞治疗的患者在一年后,相较于一般患者瘢痕组织减少,有效心肌数量增加,心功能得到改善,且并没有其他安全风险,因此,心肌球源性干细胞是当前最有前景的移植治疗心肌梗死的干细胞类型之一。尽管心肌球源性干细胞移植治疗在动物和患者身上都能保护并改善心梗后的受损心肌,当它和其他干细胞治疗方案一样仍面临着移植后宿主心脏恶劣微环境所导致的低存活率的瓶颈,这些恶劣的微环境包括较高的炎症因子和大量的氧自由基。当前已有多项在动物身上的研究应用遗传基因改良的操作,向干细胞中引入改善移植后存活的相关基因以期解决这一难题,例如PHD2、AKT、Bcl-2,SDF-1以及趋化因子受体1等。虽然这些研究取得了一定成果,但离实际的临床应用还有一定的距离。当然,如果能找到一种临床上已知且能够有效地提高干细胞移植后的存活率的药物,,从而提高干细胞治疗的效果,将十分鼓舞人心。在近年多项研究中发现,二甲双胍(metformin,MET),作为治疗2型糖尿病的一线临床药物,可激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)。AMPK是一种蛋白激酶,它能够促进脂肪酸氧化,促进葡萄糖运输,加速糖酵解,抑制体内甘油三酯和蛋白质合成,与此同时,体外实验表明激活AMPK可通过保护线粒体凋亡的机制促进心肌细胞的存活。令人惊喜的是,一项在狗身上进行的研究证实了二甲双胍能够通过AMPK依赖的途径减少氧化应激所导致的心肌细胞凋亡,从而表明二甲双胍具有潜在的独立于降糖作用之外的心脏保护作用,进而具有减轻缺血再灌注引起的损伤的效果。AMPK是调节细胞能量代谢稳态的关键因子,对于干细胞的存活亦有重要作用。在一项关于胚胎干细胞的研究中,eNOS的过表达帮助干细胞维持低含量的NO,从而减少胚胎干细胞的凋亡。心肌球源性干细胞是有离体心脏组织在体外分离、培养获得的,与心脏细胞有同源性,同时,eNOS是一种潜在的独立细胞保护信号分子,在血管内皮细胞、心肌细胞以及不同类型的干细胞中有所表达,CDCs中eNOS也有表达。考虑到心肌球源性干细胞和心肌组织的同源性,我们提出如下科学问题:二甲双胍能否拮抗超氧应激对CDCs的损伤作用、提高其存活率,进而增强CDC移植治疗心肌梗死的效果?这种保护作用是通过激活AMPK/eNOS信号通路来介导的吗?二甲双胍这种抗氧化应激功能对于心肌球源性干细胞是否有类似的保护作用,二甲双胍能否实质性的提高心肌球源性干细胞移植后的在体存活率,以及二甲双胍的引入能否有效提高心肌球源性干细胞移植治疗心肌梗死的治疗效果,本研究期待探讨这些问题的答案。二、研究内容和方法1、分离提取心肌球源性干细胞:将已有的GFP转基因标记的C57小鼠的心脏组织迅速剪取离体,
研究背景目前关于结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)的所有研究,包括基因组学、转录组学和蛋白质组学等大量科学成果的获得,都是基于1882年Robert Koch对结核病(Tuberculosis,TB)的病原体是具有传染性的结核分枝杆菌这一现象的发现。虽然随后相关的诊断及治疗方法不断发展,但结核病至今仍然是一个全球性的公共卫生问题。据世界卫生组织(World health organization,WHO)报道,全球每年新增大约900万人感染结核分枝杆菌(包括处于感染活跃期和感染潜伏期两类),同时全球每年有大约150万人死于各种类型的结核病,因此,结核分枝杆菌是主要的单一感染致死病原菌。引起这一现象的原因可归结于结核分枝杆菌通过不断进化,使其拥有一套复杂的感染机制;人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus,HIV)感染增加了合并感染结核分枝杆菌的风险;日益增加的新发耐药、多重耐药及全耐药的结核分枝杆菌感染病例等。据报道,2014年全球范围新发感染人数为960万,其中40万为HIV感染者。2013年全球范围内约有48万新增多重耐药结核分枝杆菌病例。除了结核分枝杆菌之外,结核分枝杆菌复合群(Mycobacterium tuberculosis complex,MTBC)同样也可以引起肺结核。同时,鸟分枝杆菌复合群(Mycobacterium avium complex,MAC)和结核分枝杆菌复合群一样,都是从呼吸道感染中分离出来的。鸟分枝杆菌复合群多与肺部非结核分枝杆菌感染相关。快速诊断肺结核及肺外结核在治疗及控制疾病传染方面至关重要。尽管培养出病原菌是诊断结核病的金标准,但由于分枝杆菌培养耗时巨大,在临床上很少用到这一方法。因此,为了区分临床上肺部感染是由哪种病原菌引起,需要进行一系列生化检验及分子生物学检测等,目前常用的方法为主要为聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)、实时定量PCR(Real time polymerase chain reacton,RT-PCR)等。上述方法虽然比传统方法更节省时间,但是操作及分析难度明显增加,且由于扩增下限的存在无法对早期轻度感染进行准确判断。因此,建立一种更敏感、更快捷的检测方法对于临床预防及治疗结核病具有极其重要的意义。表面等离子体共振(Surface plasmon resonance,SPR)是一种光学物理现象,其原理是光发生折射及反射时,当入射角超过临界角(折射角为90度的入射角)时,理论上会出现全内反射现象。但是渐逝波(Evanescent wave)的存在使能量呈现出指数衰减。此时如果在反射界面涂一层薄的金膜或者银膜,因受入射光激发导致其表面自由电子产生电荷振荡,与渐逝波产生能量耦合,称为表面等离子体共振。以上述理论为基础建立的SPR生物传感器是学科交叉(物理学及生物学)的结合产物,出现于上世纪80年代,通过利用光在两种不同介质之间的反射及折射作用,检测生物芯片表面结合的生物分子质量的改变情况。近年来S P R传感器的研究和发展非常迅速。由于S P R传感器在实际应用中具有诸多优势,如:不用标记、样品用量少、可以实时在线检测以及灵敏度很高等,因此S P R传感器已经广泛用于各种生物分子(脂类、蛋白、核酸、细胞、细菌、病毒等)生物学特性的检测。滚环扩增(Rolling circle amplification,RCA)是在P C R基础上发展而来的一种可以在恒温条件下扩增DNA片段的技术。RCA基本理论形成于上世纪90年代中期,最初使用的是Exo-minus Klenow和Bst DNA多聚酶。由于P hi 29 DNA聚合酶具有更高的持续扩增能力以及链置换能力,因此于1998年开始使用P hi 29 DNA。RCA反应中的模板为环形的DNA分子,引物是和环形的DNA模板互补的一段短序列,通过P hi 29 DNA聚合酶的作用,扩增形成长单链DNA片段,从而可以在很短的时间内扩增出很多重复的串联DNA序列,实现信号的放大。这一技术因其自身特点,所以不需要精密的温度控制系统,扩增过程中扩增产物为线性长片段,更适合现场试验及即时检测。RCA在合成DNA的过程中,因其不会扩增产生新的单链DNA(Single-stranded DNA,ss DNA)3‘端(做为引物),因此具有较强的抗污染能力。RCA技术操作及反应简洁迅速,可以和芯片实验室技术结合用于多通路分析、便捷分析。因此,RCA技术应用比较广泛。指数富集的配基系统进化技术(Systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)是一个完善的、高
暂无评论