检索结果-内蒙古大学图书馆

第二军医大学学报 1999年第8期20卷 509-512页

作者：卢洋黎怀星傅继梁第二军医大学基础医学部医学遗传学教研室上海200433

目的：构建一个用于比较研究哺乳动物细胞内表达基因和沉默基因的不同突变机制的质粒载体。方法和结果：设计并构建一种具两个ｌａｃⅠ突变靶基因的突变研究载体：ｐＭＣＬａｃⅠ／Ｎｅｏ质粒。在该质粒中，一个ｌａｃⅠ靶基因受 ... 详细信息

目的：构建一个用于比较研究哺乳动物细胞内表达基因和沉默基因的不同突变机制的质粒载体。方法和结果：设计并构建一种具两个ｌａｃⅠ突变靶基因的突变研究载体：ｐＭＣＬａｃⅠ／Ｎｅｏ质粒。在该质粒中，一个ｌａｃⅠ靶基因受ＣＭＶ启动子的驱动而使其在人和哺乳动物细胞内能表达，而另一个ｌａｃⅠ靶基因则不能表达。将所获得的ｐＭＣＬａｃⅠ／Ｎｅｏ质粒经酶切鉴定后，再进行如下功能鉴定：一是分析两个ｌａｃⅠ靶基因在大肠杆菌细胞内的功能状态，结果显示这两个ｌａｃⅠ基因在ＤＨ５α宿主菌内功能正常；二是将其导入ＮＩＨ３Ｔ３细胞内，分析两个靶基因是否能模拟哺乳动物细胞内表达基因和沉默基因的功能状态。结果表明其中一个ｌａｃⅠ靶基因在ＮＩＨ３Ｔ３细胞中处于转录表达状态。结论：本研究构建了一种新型的突变研究载体，位于该载体上的两个ｌａｃⅠ靶基因能模拟人和哺乳动物细胞内表达基因和沉默基因的功能状态。

关键词：基因突变 lacⅠ基因质粒 DNA损伤沉默基因

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TGFβ_1基因对肝癌细胞癌基因表达的体外观察

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第二军医大学学报 1999年第5期20卷 292-294,F003页

作者：封岩曹广文张晓琴高峰孔宪涛第二军医大学长征医院临床免疫中心第二军医大学基础医学部微生物学教研室

目的：观察转化生长因子β１（ＴＧＦβ１）转入对人肝癌细胞系癌基因表达的影响。方法：ｐＬ（ＴＧＦβ１）ＳＮ和相应重组病毒上清用脂质体转染包装细胞及肝癌细胞，经Ｇ４１８筛选后，进行免疫组化染色，观察癌基因蛋白表达的改变。... 详细信息

目的：观察转化生长因子β１（ＴＧＦβ１）转入对人肝癌细胞系癌基因表达的影响。方法：ｐＬ（ＴＧＦβ１）ＳＮ和相应重组病毒上清用脂质体转染包装细胞及肝癌细胞，经Ｇ４１８筛选后，进行免疫组化染色，观察癌基因蛋白表达的改变。结果：提取的ＴＧＦβ１ｃＤＮＡ连接物经酶切鉴定，证明有正向插入及反向插入两类。病毒上清ＴＧＦβ１含量在１６～４１ｎｇ／ｍｌ，套式ＰＣＲ后均出现２９０ｂｐ条带。转基因后肝癌细胞癌基因蛋白免疫组化染色结果：ｃ－ｍｙｃ，ｃ－ｍｅｔ及ｒａｓ癌基因表达，反向ＴＧＦβ１转入者为（＋）～（），而正向转入均为（－）。免疫组化检测其ＴＧＦβ１表达蛋白，空白对照染色（±），正向则为（）。结论：正向插入的ＴＧＦβ１ｃＤＮＡ可使癌基因ｃ－ｍｙｃ，ｃ－ｍｅｔ及ｒａｓ表达减少，提示它在体外对肝癌细胞具有负调控作用。

关键词：肝肿瘤癌基因转化生长因子 TGFβ1

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人促红细胞生成素在大肠杆菌中融合高表达：稀有密码子对外源蛋白翻译速率的影响

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第二军医大学学报 1995年第4期16卷 323-325页

作者：郭瀛军王易伦陆惠萍陆德如第二军医大学基础医学部分子遗传学教研室

本实验分别用两种融合表达载体（ｐＧＥＸ－２Ｔ及ｐＤＳ－６Ｈ）在大肠杆菌ＸＬ１－Ｂｌｕｅ中表达人促红细胞生成素（ｈ－ＥＰＯ）。结果发现，虽然ｈ－ＥＰＯ基因中大肠杆菌使用频率为０％或１％的密码子占密码子总量的１４．３％，... 详细信息

本实验分别用两种融合表达载体（ｐＧＥＸ－２Ｔ及ｐＤＳ－６Ｈ）在大肠杆菌ＸＬ１－Ｂｌｕｅ中表达人促红细胞生成素（ｈ－ＥＰＯ）。结果发现，虽然ｈ－ＥＰＯ基因中大肠杆菌使用频率为０％或１％的密码子占密码子总量的１４．３％，但实验中却取得了较高的蛋白表达量。ｐＧＥＸ－２Ｔ和ｐＤＳ－６Ｈ中表达的融合蛋白（分子量：４４４００和２３８００）分别占细菌总蛋白的２９．７％和１７．５％。从而提示，一个基因中的密码子使用频率与翻译延长速率之间可能不是一种简单的对应关系。表达载体ｐＧＥＸ－２Ｔ中５＇融合基因长度达１３００ｂｐ，而ｐＤＳ－６Ｈ中仅为３６ｂｐ，而ｐＤＳ－６Ｈ但两者表达水平却无显著差异，因此作为翻译起始限制因素的翻译起始区的ＡＴＧ下游顺序仅需长约３６个核苷酸。

关键词：促红细胞生成素密码子翻译基因表达大肠杆菌

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氟烷、七氟醚肝毒性与肝细胞钙平衡

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第二军医大学学报 1997年第1期18卷 1-5页

作者：俞卫锋冯伟华俞凤珍魏尧梅郑唯强沙继宏第二军医大学东方肝胆外科医院麻醉科 200433 第二军医大学基础医学部生物化学教研室第二军医大学长海医院烧伤科第二军医大学基础医学部病理解剖学教研室第二军医大学基础医学部中心实验室

目的:研究卤代类吸入麻醉药肝毒性与肝细胞钙平衡的关系。方法：应用酶诱导缺氧大鼠模型、Ca(2＋)细胞化学定位法、EDX电镜微量元素分析、离体大鼠肝细胞及肝脏微粒体Ca(2＋)摄取及释放、肝脏显微病理的体视学分析及肝脏超微病理的电子... 详细信息

目的:研究卤代类吸入麻醉药肝毒性与肝细胞钙平衡的关系。方法：应用酶诱导缺氧大鼠模型、Ca(2＋)细胞化学定位法、EDX电镜微量元素分析、离体大鼠肝细胞及肝脏微粒体Ca(2＋)摄取及释放、肝脏显微病理的体视学分析及肝脏超微病理的电子计算机图像处理等技术，从生化及形态学角度探讨肝脏细胞钙平衡的改变在氟烷性肝炎发生发展中的重要作用，并与七氟醚进行对比研究，观察其与氟烷的异同。结果：在酶诱导缺氧条件下，吸入氟烷可造成明显的肝损害，而同样情况下吸入七氟醚则无明显肝损害。氟烷可致肝细胞胞浆及线粒体钙负荷增加。结论：提示肝细胞Ca(2＋)平衡的改变在氟烷性肝炎的发生发展中起着重要作用。七氟醚对肝细胞钙平衡影响较小．亦无明显肝毒性。

关键词：麻醉药氟烷七氟醚肝毒性钙平衡

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肿瘤坏死因子突变体TNF60的研究

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第二军医大学学报 1998年第2期19卷 116-119页

作者：周凯娄永华焦炳华第二军医大学基础医学部微生物学教研室

目的：寻找具有更强抗肿瘤活性及增强或抑制ＴＮＦα生物学活性的ＴＮＦα突变蛋白。方法和结果：应用ＰＣＲ技术对ｒｈＴＮＦα进行大片段缺失突变，构建了ｒｈＴＮＦα分子Ｎ端缺失５９个氨基酸的突变体ＴＮＦ６０的编码基因，插入ｐ... 详细信息

目的：寻找具有更强抗肿瘤活性及增强或抑制ＴＮＦα生物学活性的ＴＮＦα突变蛋白。方法和结果：应用ＰＣＲ技术对ｒｈＴＮＦα进行大片段缺失突变，构建了ｒｈＴＮＦα分子Ｎ端缺失５９个氨基酸的突变体ＴＮＦ６０的编码基因，插入ｐＢＶ２２０载体并在蛋白酶缺陷的大肠杆菌ＳＧ１１１７中获得较高表达，表达量为２０．４％。重组蛋白经变性、复性和纯化，纯度＞９７％。ＴＮＦ６０对Ｌ９２９，Ｈｅｐ－２，Ｕ９３７三株细胞均丧失了细胞毒性，但都表现出增强ｒｈＴＮＦα细胞毒性的作用。

关键词：肿瘤坏死因子基因缺失聚合酶链反应基因突变

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绿色荧光蛋白在大肠杆菌中的克隆及高效表达

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第二军医大学学报 1997年第5期18卷 406-408页

作者：陆惠萍周凤娟孙树汉第二军医大学基础医学部分子遗传学教研室

目的：在大肠杆菌中克隆及高效表达绿色荧光蛋白基因（ＧＦＰ－Ｓ６５Ｔ）。方法：ＰＣＲ法克隆ＧＦＰ－Ｓ６５ＴｃＤＮＡ并改造其两端的限制性内切酶位点，构建重组原核表达载体ｐＲＳＥＴ－ＧＦＰＳ６５Ｔ。结果：在ＩＰＴＧ诱导条件... 详细信息

目的：在大肠杆菌中克隆及高效表达绿色荧光蛋白基因（ＧＦＰ－Ｓ６５Ｔ）。方法：ＰＣＲ法克隆ＧＦＰ－Ｓ６５ＴｃＤＮＡ并改造其两端的限制性内切酶位点，构建重组原核表达载体ｐＲＳＥＴ－ＧＦＰＳ６５Ｔ。结果：在ＩＰＴＧ诱导条件下，ＧＦＰ－Ｓ６５Ｔ的表达量占细菌总蛋白量的１５％以上。细菌培养物及其超声上清在长波紫外线的照射下，发出明亮的绿色荧光。结论：ＧＦＰ－Ｓ６５Ｔ可以作为原核细胞中的报告基因，用标准的长波紫外线即可检测其表达。

关键词：基因表达大肠杆菌绿色荧光蛋白克隆

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重组人肿瘤坏死因子α衍生物3a的制备及纯化

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第二军医大学学报 1996年第4期17卷 324-327页

作者：王梁华焦炳华第二军医大学基础医学部微生物学教研室

目的：制备符合临床应用标准的高纯度重组人肿瘤坏死因子α衍生物３ａ（ｒｈ－ＴＮＦαＤ３ａ）。方法：高效表达ｒｈ－ＴＮＦαＤ３ａ的Ｅ．ｃｏｌｉ工程菌经过超声破碎、硫酸铵分段盐析、ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ－２００层析，得到电泳... 详细信息

目的：制备符合临床应用标准的高纯度重组人肿瘤坏死因子α衍生物３ａ（ｒｈ－ＴＮＦαＤ３ａ）。方法：高效表达ｒｈ－ＴＮＦαＤ３ａ的Ｅ．ｃｏｌｉ工程菌经过超声破碎、硫酸铵分段盐析、ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ－２００层析，得到电泳纯ｒｈ－ＴＮＦαＤ３ａ，其比活性为１．８８×１０８ＩＵ／ｍｇ。进一步超滤浓缩，ＤＥＡＥＳｅｐｈａｄｅｘＡ－５０纯化，比活性达２×１０８ＩＵ／ｍｇ。结果：纯度＞９８．２％，回收率约为６５％，内毒素＜２Ｅｕ·（１０６ＩＵ）－１·ｍｌ－１。结论：建立了适宜的ｒｈ－ＴＮＦαＤ３ａ纯化方法，连续三批原料和制剂通过国家卫生部药品生物制品检定所检定，符合ＷＨＯ有关基因工程产品临床用药标准，为过渡到临床验证打下了基础。

关键词：肿瘤坏死因子衍生物纯化制备 rh-TNFαD3a

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地高辛标记的DNA探针检测核酸疫苗中宿主菌基因组DNA的含量

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第二军医大学学报 2003年第8期24卷 902-903页

作者：贺艳施柯孙树汉第二军医大学基础医学部医学遗传学教研室上海200433

将合成的引物与宿主菌的染色体模板 DNA进行 PCR扩增的核糖体 DNA片段 ,以地高辛进行标记 ,与待测 DNA样品进行点杂交 ,确定制备的乙肝 DNA疫苗中其宿主菌基因组含量 <15 ng/μg质粒 DNA。这提示地高辛标记的探针用于检测基因组 DNA... 详细信息

将合成的引物与宿主菌的染色体模板 DNA进行 PCR扩增的核糖体 DNA片段 ,以地高辛进行标记 ,与待测 DNA样品进行点杂交 ,确定制备的乙肝 DNA疫苗中其宿主菌基因组含量 <15 ng/μg质粒 DNA。这提示地高辛标记的探针用于检测基因组 DNA的方法灵敏。

关键词：地高辛标记 DNA探针核酸疫苗宿主菌基因组 DNA含量乙肝 DNA疫苗制品

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口蹄疫病毒融合表位基因在pET原核系统的高表达及产物的纯化

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第二军医大学学报 2003年第8期24卷 904-905页

作者：陈祖欢张洪英郭瀛军林懿朱维佳孙树汉第二军医大学基础医学部医学遗传学教研室上海200433

构建口蹄疫融合表位基因 - SG表达载体 p ET- SG,转化重组子与 K80 2 ,新鲜过夜菌以 2 %接种量接种 2 YT培养液 ,37℃培养 2 h后用 IPTG诱导 ,每隔 1h取样 ,共 8h。根据 SDS- PAGE结果 ,口蹄疫融合表位基因 - SG在 p ET原核表达系统可... 详细信息

构建口蹄疫融合表位基因 - SG表达载体 p ET- SG,转化重组子与 K80 2 ,新鲜过夜菌以 2 %接种量接种 2 YT培养液 ,37℃培养 2 h后用 IPTG诱导 ,每隔 1h取样 ,共 8h。根据 SDS- PAGE结果 ,口蹄疫融合表位基因 - SG在 p ET原核表达系统可获得较高表达 ,用 IPTG诱导 4 h蛋白表达量最高 ,用 Ni+柱亲和层析可得到较纯蛋白。

关键词：口蹄疫病毒融合表位基因 pET原核系统基因表达纯化

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基于Cre重组酶体系的小鼠HPRT定点整合打靶载体的构建及其应用

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第二军医大学学报 2001年第6期22卷 538-541页

作者：郑敬民李坚杨桦傅继梁第二军医大学基础医学部医学遗传学教研室上海200433

目的 :构建带有 Cre重组酶识别位点变异体 lox6 6的针对小鼠 HPRT基因的基因打靶载体 ,并用于小鼠胚胎干细胞基因打靶研究。方法 :利用含 HPRT基因组 DNA片段的质粒 p MP8和人工合成含 lox6 6序列的寡核苷酸 ,构建含 Cre重组酶识别位点... 详细信息

目的 :构建带有 Cre重组酶识别位点变异体 lox6 6的针对小鼠 HPRT基因的基因打靶载体 ,并用于小鼠胚胎干细胞基因打靶研究。方法 :利用含 HPRT基因组 DNA片段的质粒 p MP8和人工合成含 lox6 6序列的寡核苷酸 ,构建含 Cre重组酶识别位点变异体 lox6 6的置换型打靶载体 ,经过限制性内切酶酶切鉴定其结构正确后 ,用电穿孔法对小鼠胚胎干细胞 R1株进行基因转染 ,经 G418/ 6 - TG(6 - thioguanine)分组药物筛选 ,进行 p SP- HPRT- lox6 6 - Neo载体的应用研究。结果 :得到了与设计一致的置换型打靶载体 p SP- HPRT- lox6 6 - Neo;将线性化的打靶载体导入 ES细胞后 ,能与靶位点有效地发生同源重组 ,获得了 2 0个靶基因被灭活了的 ES细胞克隆。结论 :此研究成功构建了含 Cre重组酶识别位点变异体 lox6 6针对小鼠 HPRT基因位点的置换型打靶载体。

关键词：基因打靶胚胎干细胞 HPRT基因 Cre重组酶小鼠

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