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第二军医大学学报 2002年第2期23卷 129-131页

作者：娄永华焦炳华第二军医大学基础医学部生物化学与分子生物学教研室上海200433

目的 :分析细胞因子对外周血单核细胞 L IGHT基因的诱导表达 ,并克隆人 L IGHT基因。方法 :采用新鲜健康人外周血单核细胞 (PMBC) ,分别以 L PS、TNFα、IL - 2、IFN-γ及 PMA刺激以诱导 L IGHT基因表达 ,RT- PCR分析 PMBC内L IGHT基因... 详细信息

目的 :分析细胞因子对外周血单核细胞 L IGHT基因的诱导表达 ,并克隆人 L IGHT基因。方法 :采用新鲜健康人外周血单核细胞 (PMBC) ,分别以 L PS、TNFα、IL - 2、IFN-γ及 PMA刺激以诱导 L IGHT基因表达 ,RT- PCR分析 PMBC内L IGHT基因转录表达。采用 PCR产物直接克隆法克隆人全长 L IGHT基因及其胞外区编码基因 ,并对胞外区编码基因进行大肠杆菌表达。结果 :当用 IFN-γ和 PMA刺激 PMBC后 4 8h,可诱导 L IGHT基因的明显表达 ,而 L PS、IL - 2和 TNFα则不能诱导。克隆的人 L IGHT全长基因及 L IGHT胞外区编码基因 ,经过 DNA序列测定证实基因序列与文献报道一致。 L IGHT基因胞外区在大肠杆菌获得一定程度的表达。结论 :本研究对人 L IGHT基因及其胞外区编码基因进行了克隆和表达。

关键词： LIGHT TNF超家族外周血单核细胞 RT-PCR 基因克隆基因表达

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大鼠肝再生时线粒体通透性转换的变化

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第二军医大学学报 2004年第3期25卷 292-294页

作者：缪明永朱克军汪振诚刘军华蒋雷王学敏焦炳华第二军医大学基础医学部生物化学与分子生物学教研室上海200433

目的 :研究大鼠肝再生过程中肝细胞线粒体膜通透性转换 (PT)的变化规律。方法 :SD大鼠肝 70 %部分切除 (PH)制作肝再生模型 ,断头取肝分离线粒体后 ,通过检测静息态和不同浓度钙离子诱导下线粒体悬液在 5 4 0 nm处光密度值 (D540 )变... 详细信息

目的 :研究大鼠肝再生过程中肝细胞线粒体膜通透性转换 (PT)的变化规律。方法 :SD大鼠肝 70 %部分切除 (PH)制作肝再生模型 ,断头取肝分离线粒体后 ,通过检测静息态和不同浓度钙离子诱导下线粒体悬液在 5 4 0 nm处光密度值 (D540 )变化来观察线粒体 PT的时相变化。结果 :与对照组比较 ,大鼠肝再生早期 (PH后 0～ 2 4 h)和后期 (PH后 1 2 0～ 1 6 8h)都表现为肝线粒体先收缩后肿胀 ,也即通透性先下降后增高 ;同时大鼠肝再生早期肝线粒体可明显抵抗钙离子的诱导作用 ,而 PH后2 4 h和 1 6 8h组的大鼠肝线粒体对钙离子的诱导非常敏感。环孢素 A(Cs A)可阻断钙的诱导作用。结论 :大鼠肝再生过程中线粒体 PT出现明显规律性改变。

关键词：大鼠肝再生线粒体通透性转换钙离子环孢素A

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腺病毒介导的PTEN cDNA对子宫内膜癌细胞凋亡的影响

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中华妇产科杂志 2006年第8期41卷 549-553页

作者：杨培丽刘玉环崔英蔡在龙毛积芳第二军医大学长海医院妇产科第二军医大学长海医院基础医学部生物化学与分子生物学教研室上海200433

目的研究外源性PTEN cDNA的表达对子宫内膜癌细胞凋亡的影响。方法用细菌内同源重组法构建含野生型抑癌基因PTEN cDNA的复制缺陷型腺病毒Ad-PTEN,蛋白印迹法鉴定转染Ad-PTEN后,子宫内膜癌细胞系RL95-2细胞中PTEN蛋白的表达。将RL95-2细... 详细信息

目的研究外源性PTEN cDNA的表达对子宫内膜癌细胞凋亡的影响。方法用细菌内同源重组法构建含野生型抑癌基因PTEN cDNA的复制缺陷型腺病毒Ad-PTEN,蛋白印迹法鉴定转染Ad-PTEN后,子宫内膜癌细胞系RL95-2细胞中PTEN蛋白的表达。将RL95-2细胞随机分成3组: (1)空白对照组:仅用培养基而不加腺病毒;(2)Ad-CMV组:转染复制缺陷型空载体腺病毒Ad-CMV; (3)Ad-PTEN组:转染复制缺陷型腺病毒Ad-PTEN,前两组均为对照组。采用细胞膜磷脂酰丝氨酸(PS)外翻检测、活化半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)测定及染色体DNA片段化检测这3种方法,从不同角度检测PTEN蛋白的表达对RL95-2细胞凋亡的影响。结果经Ad-PTEN介导的PTEN cDNA能够在RL95-2细胞中持续有效地表达。Ad-PTEN组转染后24、48、72、96 h,RL95-2细胞中细胞膜PS外翻细胞分别占(6．09±1．01)％、(9．98±2．17)％、(11．74±2．65)％、(27．69±8．67)％,各个时间点分别与两个对照组比较,差异均有统计学意义(P<0．05);RL95-2细胞中活化caspase-3细胞分别占(2．6±0．5)％、(18．0±4．4)％、(21．8±5．1)％、(33．7±9．9)％,各个时间点分别与两个对照组比较,差异均有统计学意义(P<0．05)。Ad-PTEN转染后48 h,RL95-2细胞中出现特异性的染色体DNA梯状条带。结论腺病毒介导的PTEN cDNA能够有效地在RL95-2细胞中表达,并诱导其凋亡,为子宫内膜癌的基因治疗提供了理论基础。

关键词：磷酸单酯水解酶类肿瘤抑制蛋白质类腺病毒科子宫内膜肿瘤细胞凋亡

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重组人可溶性VEGI在大肠杆菌中的高效表达

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第二军医大学学报 2002年第2期23卷 140-142页

作者：娄永华焦炳华肖扬朱玉平王梁华第二军医大学基础医学部生物化学与分子生物学教研室上海200433

目的 :在大肠杆菌中高效表达重组人可溶性 VEGI,纯化重组蛋白并分析其生物学活性。方法 :采用 PCR方法对编码人 VEGI全基因进行修饰 ,获得编码成熟蛋白第 2 9～ 174位氨基酸的 C端胞外区基因片段 ,将 PCR产物亚克隆到 p MD-18T中 ,经 DN... 详细信息

目的 :在大肠杆菌中高效表达重组人可溶性 VEGI,纯化重组蛋白并分析其生物学活性。方法 :采用 PCR方法对编码人 VEGI全基因进行修饰 ,获得编码成熟蛋白第 2 9～ 174位氨基酸的 C端胞外区基因片段 ,将 PCR产物亚克隆到 p MD-18T中 ,经 DNA测序证实后亚克隆入高表达载体 p L OU- 1,转化大肠杆菌 BL 2 1,获得高表达菌株。经 IPTG诱导获得高表达 ,纯化表达产物并检测其对内皮细胞 ECV30 4增殖的抑制活性。结果 :重组人可溶性 VEGI在大肠杆菌中获得高效表达 ,约占细菌总蛋白的 4 0 % ;纯化的重组蛋白经复性后具有直接抑制内皮细胞增殖的活性。结论 :重组人可溶性 VEGI在大肠杆菌中获得高效表达 ,且表达的重组蛋白具有抑制内皮细胞生长作用。

关键词：血管内皮聚合酶链反应血管生长抑制因子基因表达重组人可溶性VEGI 大肠杆菌

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细菌双杂交系统在细胞外蛋白质相互作用中的应用

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第二军医大学学报 2003年第10期24卷 1095-1098页

作者：张弛王梁华罗以勤张兴群高云史薇包晨颖球谊焦炳华第二军医大学基础医学部生物化学与分子生物学教研室上海200433

目的:探索应用细菌双杂交系统在细胞外蛋白质之间相互作用的可行性。方法:应用Stratagene BacterioMatch two hy-brid system,以pTRG构建编码TRAIL细胞外可溶性区域序列融合表达质粒;以pBT构建编码DR4、DR5、OPG等的细胞外区域序列融合... 详细信息

目的:探索应用细菌双杂交系统在细胞外蛋白质之间相互作用的可行性。方法:应用Stratagene BacterioMatch two hy-brid system,以pTRG构建编码TRAIL细胞外可溶性区域序列融合表达质粒;以pBT构建编码DR4、DR5、OPG等的细胞外区域序列融合表达质粒。重组质粒分别相应共转化报告菌株XL1-Blue MRF,报道基因产物以抗羧苄青霉素和β-半乳糖苷酶活性作为转录激活的指标。结果:pTRG-TRAIL与pBT-DR4,pTRG-TRAIL与pBT-DR5及对照组分别共转化后在高浓度羧苄青霉素(500μg/ml以上)筛选下宿主菌呈转录激活状态,pTRG-TRAIL与pBT-OPG组共转化后在低浓度羧苄青霉素(250μg/ml以下)筛选下宿主菌呈转录激活状态,用X-Gal-PETG平皿可以进一步验证阳性克隆。对照组pTRG-TRAIL与pBT-LGF2,pBT-DR4、pBT-DR5或pBT-OPG与pTRG-Gal114组共转化后呈阴性。结论:所用的双杂交序列皆为编码这些蛋白质的细胞外区域,而这些蛋白质本身的相互作用已有其他报道验证,所以细菌双杂交系统可以用于细胞外蛋白质的相互作用研究。

关键词：细菌双杂交系统细胞外蛋白质相互作用临床应用可行性 TNF相关凋亡诱导配体质粒构建

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携带HSV－tk基因的人肝癌特异性逆转录病毒载体的构建

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第二军医大学学报 1996年第2期17卷 101-104页

作者：高军曹广文戚中田仇小芳吴宗娣杜平杨文国崔龙第二军医大学基础医学部微生物学教研室第二军医大学长海医院普通外科

构建携带单纯疱疹病毒ｔｋ基因（ＨＳＶ－ｔｋ）的人肝癌特异性逆转录病毒载体。方法和结果：切除逆转录病毒载体ｐＭＮＳＭ内部的ＳＶ４０启动子使之成为ｐＭＮＭ；从真核表达载体ｐＢＰＧＫ－ｔｋ质粒中游离带有磷酸甘油酸激酶基因（... 详细信息

构建携带单纯疱疹病毒ｔｋ基因（ＨＳＶ－ｔｋ）的人肝癌特异性逆转录病毒载体。方法和结果：切除逆转录病毒载体ｐＭＮＳＭ内部的ＳＶ４０启动子使之成为ｐＭＮＭ；从真核表达载体ｐＢＰＧＫ－ｔｋ质粒中游离带有磷酸甘油酸激酶基因（ｐｇｋ）启动子调控的ＨＳＶ－ｔｋ片段，克隆到ｐＭＮＭ的ＰＬ位点上，构建成普通型ＰＭＮｐ－ｔｋ逆转录病毒载体；从ｐＧＥＭ．７Ｚ－ＡＦＰｅ质粒中游离人甲胎蛋白基因增强子核心序列，克隆到ｐＭＮｐ－ｔｋ的ｐｇｋ启动子上游，构建成人肝癌特异型ｐＭＮＡＰ－ｔｋ逆转录病毒载体。结论：该载体对肝癌特异性前药转换基因治疗有重要意义。

关键词：肝肿瘤基因治疗逆转录病毒载体 HSV-tk

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核转录因子κB RNA适体重组腺病毒载体的构建

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第二军医大学学报 2003年第6期24卷 650-653页

作者：游兴姬杨生生蔡在龙张志珍焦炳华毛积芳第二军医大学基础医学部生物化学与分子生物学教研室上海200433

目的 :构建核转录因子 κB(NF- κB) RNA适体 (aptamer)重组腺病毒载体 p Adeasy- aptamer,制备重组腺病毒 Ad- ap-tam er并测定其活性。方法 :采用亚磷酸二酯法合成 aptamer c DNA的 6个寡核苷酸片段并拼接完整 ,克隆至 p GEM- 7Z载体... 详细信息

目的 :构建核转录因子 κB(NF- κB) RNA适体 (aptamer)重组腺病毒载体 p Adeasy- aptamer,制备重组腺病毒 Ad- ap-tam er并测定其活性。方法 :采用亚磷酸二酯法合成 aptamer c DNA的 6个寡核苷酸片段并拼接完整 ,克隆至 p GEM- 7Z载体中 ,经酶切鉴定和测序后把 aptam er c DNA定向插入穿梭质粒 p Shuttle- CMV的多克隆位点上 ,再将重组质粒 p Shuttle- CMV-aptamer与腺病毒载体 p Adeasy在大肠杆菌 BJ5 183中同源重组产生重组腺病毒载体 p Adeasy- aptam er。用脂质体转染p Adeasy- aptam er至 HEK2 93细胞 ,产生有感染能力的重组腺病毒 Ad- aptam er,RT- PCR检测重组腺病毒在感染细胞中的表达 ,并测定其对体外抑制炎症细胞系释放炎症介质 IL- 1β和 IL- 6的影响。结果 :感染重组腺病毒的细胞具有 aptamer c DNA的表达 ,重组腺病毒能抑制感染细胞炎症介质的释放 ,具有预期的生物学活性。结论 :产生具有生物学活性的重组腺病毒 Ad-aptamer,为下一步基因治疗因 NF-

关键词：核转录因子κB RNA适体重组腺病毒载体构建基因治疗

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人胰高血糖素样肽-1 cDNA的克隆与表达

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第二军医大学学报 2001年第4期22卷 316-318页

作者：张志珍毛积芳窦鸿杨生生第二军医大学基础医学部生物化学与分子生物学教研室上海200433

目的 :克隆人胰高血糖素样肽 - 1(h GL P- 1) c DNA,构建原核表达质粒 p GEX- 4T- 3/ h GL P- 1c DNA,并诱导表达谷胱甘肽巯基转移酶 - h GL P- 1(GST- h GL P- 1)融合蛋白。方法 :采用亚磷酸二酯法合成 6个 h GL P- 1c DNA的寡核苷酸片... 详细信息

目的 :克隆人胰高血糖素样肽 - 1(h GL P- 1) c DNA,构建原核表达质粒 p GEX- 4T- 3/ h GL P- 1c DNA,并诱导表达谷胱甘肽巯基转移酶 - h GL P- 1(GST- h GL P- 1)融合蛋白。方法 :采用亚磷酸二酯法合成 6个 h GL P- 1c DNA的寡核苷酸片段 ,拼接成完整的 h GL P- 1c DNA ,克隆至 p BS SK(+ / - )载体中 ,经双酶切鉴定和测序后把 h GL P- 1c DNA定向插入融合基因表达载体 p GEX- 4T- 3的多克隆位点上 ,构建重组质粒 p GEX- 4T- 3/ h GL P- 1c DNA,并转化大肠杆菌 TG1。结果 :经限制性内切酶Bam H 、Xho 酶切和电泳 ,证明 h GL P- 1c DNA已插入到 p GEX- 4T- 3中并诱导表达出融合蛋白。结论 :成功诱导表达出融合蛋白 GST- h GL P- 1,为进一步获得大量可供实验研究和临床应用的重组 h GL P- 1创造条件。

关键词：胰高血糖素样肽-1 克隆分子基因表达糖尿病 cDNA

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玄参中环烯醚萜Epibueropyridinium A预防D-半乳糖性白内障的实验研究

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第二军医大学学报 2006年第11期27卷 1204-1206页

作者：黄才国魏善建第二军医大学基础医学部生物化学与分子生物学教研室上海200433

目的:探讨玄参中环烯醚萜Epibueropyridinium A对D-半乳糖性白内障形成的干预作用。方法:大鼠随机分为正常对照组、模型组、样品高、低剂量组和阳性对照组,每组10只。模型组腹腔注射D-半乳糖诱导大鼠白内障模型;样品高、低剂量组在注射D... 详细信息

目的:探讨玄参中环烯醚萜Epibueropyridinium A对D-半乳糖性白内障形成的干预作用。方法:大鼠随机分为正常对照组、模型组、样品高、低剂量组和阳性对照组,每组10只。模型组腹腔注射D-半乳糖诱导大鼠白内障模型;样品高、低剂量组在注射D-半乳糖同时分别给予20、10 mg/kg环烯醚萜Epibueropyridinium A灌胃;正常对照组仅仅灌胃生理盐水;晶体混浊度和山梨醇含量的变化阳性对照为依帕司他(10 mg/kg),SOD活性和丙二醛含量变化的阳性对照为VitE(30 mg/kg)。3、6周后用裂隙灯观察晶体混浊程度,处死动物后检测晶体中SOD的活性,丙二醛以及山梨醇的含量。结果:样品高、低剂量组大鼠白内障的晶体混浊度明显低于模型组,样品高剂量组低于低剂量组(P<0.01)。晶体中SOD活性(***-1)由模型组的32.1±11.2分别升高到样品低剂量组的65.9±16.7和样品高剂量组的83.2±15.6(P<0.01);丙二醛含量(***-1)由模型组的26.72±5.36分别降到样品低剂量组的18.34±4.29和样品高剂量组的15.66±5.47(P<0.01);山梨醇含量(μmol.g-1)在第3周时由模型组的24.33±2.57分别降到样品低剂量组的15.46±2.07和样品高剂量组的11.45±1.39(P<0.01),在第6周时由模型组的20.04±1.59分别降到样品低剂量组的15.82±1.42和样品高剂量组的13.22±1.37(P<0.05或0.01)。结论:玄参中环烯醚萜Epibueropyridinium A对大鼠糖性白内障形成有一定的预防作用。

关键词：白内障 Epibueropyridinium A 超氧化物歧化酶丙二醛山梨醇

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层粘连蛋白总糖肽对小鼠巨噬细胞功能的影响

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第二军医大学学报 1996年第4期17卷 320-323页

作者：刘艺萍周柔丽张莎第二军医大学基础医学部生物学教研室北京医科大学细胞生物学教研室

目的：观察层粘连蛋白总糖肽（Ｌａｍｉｎｉｎｇｌｙｃｏｐｅｐｔｉｄｅｓ，ＬＮ－Ｇｐｓ）对小鼠腹腔巨噬细胞（Ｍ）杀伤黑色素瘤Ｂ１６细胞及吞噬抗体包被的羊红细胞（ＥＡ）作用的影响。方法：将ＢＡＬＢ／ｃ小鼠腹腔Ｍ体外培养４８... 详细信息

目的：观察层粘连蛋白总糖肽（Ｌａｍｉｎｉｎｇｌｙｃｏｐｅｐｔｉｄｅｓ，ＬＮ－Ｇｐｓ）对小鼠腹腔巨噬细胞（Ｍ）杀伤黑色素瘤Ｂ１６细胞及吞噬抗体包被的羊红细胞（ＥＡ）作用的影响。方法：将ＢＡＬＢ／ｃ小鼠腹腔Ｍ体外培养４８ｈ后，再分别与０（对照），５０，１００，２００μｇ／ｍｌ终浓度的ＬＮ－Ｇｐｓ预温３０ｍｉｎ，用噻唑蓝比色法检测Ｍ对Ｂ１６细胞的杀伤作用，用联苯胺氧化比色法检测Ｍ吞噬ＥＡ的功能。结果：（１）Ｍ杀伤Ｂ１６细胞的作用呈剂量依赖性增高，其中１００μｇ／ｍｌ和２００μｇ／ｍｌ的ＬＮ－Ｇｐｓ可分别使Ｍ对Ｂ１６细胞的杀伤作用较对照组增高（１０．３±２．８）％和（２８．４±９．９）％（Ｐ均＜０．０５）。（２）Ｍ对ＥＡ吞噬作用降低，分别为对照组的（９２．２±１２．４）％（ＬＮ－Ｇｐｓ５０μｇ／ｍｌ）、（８７．０±１４．２）％（ＬＮ－Ｇｐｓ１００μｇ／ｍｌ，Ｐ＜０．０５）和（６９．４±１８．２）％（ＬＮ－Ｇｐｓ２００μｇ／ｍｌ，Ｐ＜０．０５）。（３）如果将Ｂ１６细胞与ＬＮ－Ｇｐｓ２００μｇ／ｍｌ先预温，则Ｍ对Ｂ１６细胞的杀伤作用较对照组（Ｂ１６细胞不与ＬＮ－Ｇｐｓ预温）明显下降，为对照组的（８４．７±７．３）％（Ｐ?

关键词：层粘连蛋白糖肽巨噬细胞吞噬作用 LN-Gps

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