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人肝癌SMMC-7721细胞热休克反应条件的确立

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第二军医大学学报 2002年第8期23卷 920-921页

作者：徐晓辉王学敏谭金兴徐仁宝第二军医大学基础医学部生物化学与分子生物学教研室上海200433 第二军医大学基础医学部病理生理学教研室

热休克反应在生物界广泛存在，热休克时细胞变化的机制是当前研究的一个重要领域。本实验在热休克反应时糖皮质激素受体（glucocorticoid receptor，GR）减少机制的研究中，确立了人肝癌SMMC-7721细胞的热休克反应条件。

关键词：肝癌 SMMC-7721细胞热休克反应细胞培养肝肿瘤糖皮质激素

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CNTF在周围神经损伤及再生中的表达和分布

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第二军医大学学报 2002年第6期23卷 605-607页

作者：郑宏良由振东周水淼李兆基路长林严进黄益灯王成海刘葛音第二军医大学长海医院耳鼻咽喉科上海200433 第二军医大学基础医学部神经生物学教研室

目的 :探讨周围神经损伤及修复后神经干睫状神经营养因子 (CNTF)的表达及分布。方法 :以犬喉返神经损伤及修复再生为实验模型 ,采用原位杂交及免疫组织化学技术 ,结合图像分析技术检测 CNTF m RNA及其蛋白反应产物的灰度及面积。结果 ... 详细信息

目的 :探讨周围神经损伤及修复后神经干睫状神经营养因子 (CNTF)的表达及分布。方法 :以犬喉返神经损伤及修复再生为实验模型 ,采用原位杂交及免疫组织化学技术 ,结合图像分析技术检测 CNTF m RNA及其蛋白反应产物的灰度及面积。结果 :正常神经 CNTF位于神经膜细胞中。神经切断后远段神经干 CNTF表达迅速下降 ,6周后消失。随着神经的再生CNTF表达逐渐增加 ,表达产物分布于包绕再生轴突及髓鞘的神经膜细胞质中 ,CNTF蛋白还出现于再生的轴突中。神经再生完成后 ,表达仍明显低于正常状态。近段神经干也出现类似远段的改变。结论 :再生神经 CNTF的表达呈下调型并与轴突再生有关 ;CNTF的重分布为神经再生提供合适的微环境。

关键词： CNTF 周围神经损伤神经再生神经生长因子睫状神经营养因子喉神经声带麻痹

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小鼠受精卵显微操作方法的改进

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第二军医大学学报 2002年第9期23卷 1032-1033页

作者：李建秀胡卫江胡以平第二军医大学基础医学部细胞生物学教研室上海200433 第二军医大学实验动物中心

目的 :改进小鼠受精卵显微操作方法 ,提高小鼠受精卵的存活率、假孕母鼠生产率及得仔率。方法 :以一定长度大小及浓度的 DNA片段为材料 ,分别进行常规及改进的显微操作后 ,统计分析受精卵存活率、假孕母鼠生产率及得仔率。结果 :经改... 详细信息

目的 :改进小鼠受精卵显微操作方法 ,提高小鼠受精卵的存活率、假孕母鼠生产率及得仔率。方法 :以一定长度大小及浓度的 DNA片段为材料 ,分别进行常规及改进的显微操作后 ,统计分析受精卵存活率、假孕母鼠生产率及得仔率。结果 :经改进后缩短操作时间的显微操作法与常规显微操作法相比 ,小鼠受精卵的存活率由 6 0 .3%提高至 79.5 %、假孕母鼠生产率由 35 .7%提高至 5 6 .8%、得仔率由 10 .1%提高至 14.1%,均有显著差别 (P<0 .0 1)。结论 :改进的显微操作法可推广应用于常规的转基因小鼠制备。

关键词：受精卵存活率生产率得仔率显微操作法

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重组人可溶性THANK在大肠杆菌中的高效表达

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第二军医大学学报 2002年第2期23卷 143-146页

作者：娄永华焦炳华第二军医大学基础医学部生物化学与分子生物学教研室上海200433

目的 :克隆人 THANK的全长基因及编码可溶性胞外区的基因 ,并在大肠杆菌中表达可溶性 THANK。方法 :采用RT- PCR从 PMA诱导的 HL 6 0细胞中克隆人 THANK全长编码基因 ,继以 PCR扩增出可溶性 THANK编码区基因 (134～2 85位氨基酸 ) ,PC... 详细信息

目的 :克隆人 THANK的全长基因及编码可溶性胞外区的基因 ,并在大肠杆菌中表达可溶性 THANK。方法 :采用RT- PCR从 PMA诱导的 HL 6 0细胞中克隆人 THANK全长编码基因 ,继以 PCR扩增出可溶性 THANK编码区基因 (134～2 85位氨基酸 ) ,PCR产物克隆于 p MD- 18T,经 DNA测序证实后亚克隆到 p ET- 11a中。重组质粒转化 BL 2 1,以 1m mol/ LIPTG进行诱导表达产物 ,SDS- PAGE分析表达产物 ,对重组蛋白经纯化复性后测定生物学活性。结果 :RT- PCR扩增出编码人 THANK全长编码基因及 PCR扩增出 THANK1 34 - 2 85基因的 c DNA ,经序列分析证实与文献报道完全一致。含有THANK1 34 - 2 85编码基因的表达载体 ,转化大肠杆菌后表达出相对分子质量约 180 0 0的重组蛋白。该重组蛋白经纯化后能够诱导 U937细胞凋亡。结论 :成功克隆了人 THANK基因 ,并在大肠杆菌中表达重组可溶性 THANK,该重组蛋白在实验条件下具有诱导 U937细胞凋亡的作用。

关键词： TNF超家族 RT-PCR 基因克隆基因表达肿瘤重组人可溶性THANK 大肠杆菌

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小鼠神经细胞p35^(nck5a)基因5′非编码区基因表达调控功能初步研究

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第二军医大学学报 2002年第2期23卷 147-149页

作者：朱海英周常文王秀凤傅继梁李建秀王新民胡以平第二军医大学基础医学部医学遗传学教研室上海200433 山东省东营市环保科研所基础医学部细胞生物学教研室

目的 :观察阿尔茨海默病 (AD)的相关基因 p35 nck5a基因 5′侧翼区指导报告基因表达的能力。方法 :将对本实验室所克隆的 p35 nck5a基因 5′侧翼片段连接于报告基因 β-半乳糖苷酶基因的上游构建表达载体 ,利用体外培养细胞和转基因小... 详细信息

目的 :观察阿尔茨海默病 (AD)的相关基因 p35 nck5a基因 5′侧翼区指导报告基因表达的能力。方法 :将对本实验室所克隆的 p35 nck5a基因 5′侧翼片段连接于报告基因 β-半乳糖苷酶基因的上游构建表达载体 ,利用体外培养细胞和转基因小鼠实验体系来观察该片段在体内、外基因表达调控的差异。结果 :体外培养细胞中 p35 nck5a基因 5′侧翼序列不具有决定报告基因神经特异性表达的能力 ,但在基因组中整合有相同表达载体的转基因小鼠体内却能够指导报告基因的神经限制性表达。结论 :这种差异提示进行体内。

关键词： p35^nck5a基因小鼠转基因基因表达调控神经细胞 AD病

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高密度培养大肠杆菌表达重组人胰高血糖素样肽-1

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第二军医大学学报 2002年第3期23卷 254-256页

作者：张志珍毛积芳杨生生窦鸿第二军医大学基础医学部生物化学与分子生物学教研室上海200433

目的 :高密度发酵培养表达重组人胰高血糖素样肽 - 1( h GL P- 1)。方法 :将构建的重组质粒 p GEX- h GL P- 1转化大肠杆菌 BL 2 1( DE3 ) ,得到表达 h GL P- 1的工程菌株 *** BL 2 1( DE3 ) / p GEX- h GL P- 1。在 5 0 0 m l三角摇瓶... 详细信息

目的 :高密度发酵培养表达重组人胰高血糖素样肽 - 1( h GL P- 1)。方法 :将构建的重组质粒 p GEX- h GL P- 1转化大肠杆菌 BL 2 1( DE3 ) ,得到表达 h GL P- 1的工程菌株 *** BL 2 1( DE3 ) / p GEX- h GL P- 1。在 5 0 0 m l三角摇瓶中进行了诱导条件的摸索实验 ,之后用 5 L自控发酵罐对工程菌进行高密度培养 ,以获取 h GL P- 1和谷胱甘肽 S-转移酶融合蛋白 ( GST- h GL P- 1)。结果 :采用分批培养和补料分批培养相结合的技术 ,控制碳源和氮源的补加 ,控制溶解氧的量 ,可使重组工程菌发酵光密度D6 0 0 值达 5 2 ,融合蛋白的表达量占菌体总蛋白量的 2 8% ,其含量达到 2 .1g/ L。用 ESI质谱鉴定 h GL P- 1相对分子质量与理论值一致。结论 :本研究为大规模生产重组 h GL P-

关键词：高密度培养人胰高血糖素样肽-1 基因表达融合蛋白质类大肠杆菌强降血糖肽

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外周血单核细胞LIGHT的诱导表达及基因克隆

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第二军医大学学报 2002年第2期23卷 129-131页

作者：娄永华焦炳华第二军医大学基础医学部生物化学与分子生物学教研室上海200433

目的 :分析细胞因子对外周血单核细胞 L IGHT基因的诱导表达 ,并克隆人 L IGHT基因。方法 :采用新鲜健康人外周血单核细胞 (PMBC) ,分别以 L PS、TNFα、IL - 2、IFN-γ及 PMA刺激以诱导 L IGHT基因表达 ,RT- PCR分析 PMBC内L IGHT基因... 详细信息

目的 :分析细胞因子对外周血单核细胞 L IGHT基因的诱导表达 ,并克隆人 L IGHT基因。方法 :采用新鲜健康人外周血单核细胞 (PMBC) ,分别以 L PS、TNFα、IL - 2、IFN-γ及 PMA刺激以诱导 L IGHT基因表达 ,RT- PCR分析 PMBC内L IGHT基因转录表达。采用 PCR产物直接克隆法克隆人全长 L IGHT基因及其胞外区编码基因 ,并对胞外区编码基因进行大肠杆菌表达。结果 :当用 IFN-γ和 PMA刺激 PMBC后 4 8h,可诱导 L IGHT基因的明显表达 ,而 L PS、IL - 2和 TNFα则不能诱导。克隆的人 L IGHT全长基因及 L IGHT胞外区编码基因 ,经过 DNA序列测定证实基因序列与文献报道一致。 L IGHT基因胞外区在大肠杆菌获得一定程度的表达。结论 :本研究对人 L IGHT基因及其胞外区编码基因进行了克隆和表达。

关键词： LIGHT TNF超家族外周血单核细胞 RT-PCR 基因克隆基因表达

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重组人可溶性VEGI在大肠杆菌中的高效表达

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第二军医大学学报 2002年第2期23卷 140-142页

作者：娄永华焦炳华肖扬朱玉平王梁华第二军医大学基础医学部生物化学与分子生物学教研室上海200433

目的 :在大肠杆菌中高效表达重组人可溶性 VEGI,纯化重组蛋白并分析其生物学活性。方法 :采用 PCR方法对编码人 VEGI全基因进行修饰 ,获得编码成熟蛋白第 2 9～ 174位氨基酸的 C端胞外区基因片段 ,将 PCR产物亚克隆到 p MD-18T中 ,经 DN... 详细信息

目的 :在大肠杆菌中高效表达重组人可溶性 VEGI,纯化重组蛋白并分析其生物学活性。方法 :采用 PCR方法对编码人 VEGI全基因进行修饰 ,获得编码成熟蛋白第 2 9～ 174位氨基酸的 C端胞外区基因片段 ,将 PCR产物亚克隆到 p MD-18T中 ,经 DNA测序证实后亚克隆入高表达载体 p L OU- 1,转化大肠杆菌 BL 2 1,获得高表达菌株。经 IPTG诱导获得高表达 ,纯化表达产物并检测其对内皮细胞 ECV30 4增殖的抑制活性。结果 :重组人可溶性 VEGI在大肠杆菌中获得高效表达 ,约占细菌总蛋白的 4 0 % ;纯化的重组蛋白经复性后具有直接抑制内皮细胞增殖的活性。结论 :重组人可溶性 VEGI在大肠杆菌中获得高效表达 ,且表达的重组蛋白具有抑制内皮细胞生长作用。

关键词：血管内皮聚合酶链反应血管生长抑制因子基因表达重组人可溶性VEGI 大肠杆菌

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乙型肝炎病毒x基因转基因小鼠模型的建立及培育

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第二军医大学学报 2002年第11期23卷 1184-1187页

作者：熊俊訾晓渊姚玉成金艳花李建秀朱海英王新民胡以平余宏宇第二军医大学基础医学部细胞生物学教研室上海200433 长征医院病理科

目的:建立可表达乙型肝炎病毒X蛋白的HBx基因(adr亚型)转基因小鼠模型,以研究x基因的功能。方法:采用基因重组技术构建含有CMV启动子和HBx基因(adr亚型)开放阅读框(ORF)的真核表达载体pcDNA3-HBx。该载体经Sal I限制性内切酶线性化后,... 详细信息

目的:建立可表达乙型肝炎病毒X蛋白的HBx基因(adr亚型)转基因小鼠模型,以研究x基因的功能。方法:采用基因重组技术构建含有CMV启动子和HBx基因(adr亚型)开放阅读框(ORF)的真核表达载体pcDNA3-HBx。该载体经Sal I限制性内切酶线性化后,琼脂糖电泳回收目的片段,用原核显微注射法将其注射入雄原核,制备转基因小鼠。复合PCR法在基因组水平筛选HBx基因转基因小鼠founder;免疫组织化学法在蛋白水平检测X蛋白在这些小鼠中的表达情况。结果:成功构建了HBx基因真核表达载体pcDNA3-HBx。经原核显微注射法将目的片段注射入受精卵雄原核后,出生并存活了11只新生鼠,经PCR检测后获得5只founder转基因小鼠,命名为C57-TgN(HBx)SMMU。免疫组织化学检测发现5只PCR阳性小鼠的肝细胞质中均有X蛋白的表达。将这5只转基因小鼠与正常同系异性小鼠交配,进行传代培育,复合PCR法筛选阳性转基因小鼠,目前已传至F4代。结论:本研究成功地产生了稳定遗传HBx基因并表达X蛋白的转基因小鼠C57-TgN(HBx)SMMU,它将有利于体内研究HBx基因在肝细胞癌发生中的作用。

关键词：乙型肝炎病毒 X蛋白转基因小鼠 HBx基因

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成体小鼠肝干细胞的长期体外培养和体内分化研究

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第二军医大学学报 2002年第11期23卷 1166-1168页

作者：苏娟朱海英李文林姚玉成刘红王新民胡以平余宏宇第二军医大学基础医学部细胞生物学教研室上海200433 长征医院病理科

目的:从成体小鼠肝脏中分离培养肝干细胞,并分析其分化潜能。方法:利用门静脉灌流消化法从成体小鼠肝脏中分离细胞并进行体外长期培养,通过脾结节形成实验对其增殖和分化潜能作进一步分析。结果:从成体小鼠肝脏中分离的细胞呈集落样生长... 详细信息

目的:从成体小鼠肝脏中分离培养肝干细胞,并分析其分化潜能。方法:利用门静脉灌流消化法从成体小鼠肝脏中分离细胞并进行体外长期培养,通过脾结节形成实验对其增殖和分化潜能作进一步分析。结果:从成体小鼠肝脏中分离的细胞呈集落样生长,不仅可稳定传代,而且移植至经致死剂量照射的小鼠体内能够形成脾结节,结节中含有肝细胞和胆管上皮细胞特异性标志的细胞。结论:成体小鼠肝脏中存在具有多潜能性的肝干细胞,该细胞的体外成功培养为肝干细胞生物学特性的研究及肝干细胞的应用奠定了基础。

关键词：肝干细胞体外培养体内分化

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