检索结果-内蒙古大学图书馆

生物工程学报 2004年第1期20卷 43-48页

作者：沈毅珺潘卫徐容潘欣王罗春王征曹峰谭靖伟吴劲松吴芳刘彦君第二军医大学基础医学部微生物学教研室上海200433 安徽医科大学病理生理学教研室合肥230032 上海复旦张江生物医药股份有限公司上海201203

构建重组人淋巴毒素 (rhLT)随机点突变组合文库以进行体外分子进化及结构和功能的研究。应用含随机核苷酸序列的引物 ,通过OverlapPCR的方法分别对rhLT的 4 6、10 6和 130位氨基酸进行定点随机突变 ,获得各单点随机突变体库。通过基因... 详细信息

构建重组人淋巴毒素 (rhLT)随机点突变组合文库以进行体外分子进化及结构和功能的研究。应用含随机核苷酸序列的引物 ,通过OverlapPCR的方法分别对rhLT的 4 6、10 6和 130位氨基酸进行定点随机突变 ,获得各单点随机突变体库。通过基因操作将这三个单点随机突变体库拼接并克隆于pMD_18T载体建立三点组合突变体文库 ,DNA测序鉴定突变位点的随机性和多样性 ,原核表达该变异体库 ,体外测定生物学活性。成功获得rhLT三点随机点突变组合文库 ,其转化克隆数达到 1 5× 10 5,是多样性理论值的 4 5倍。 5 0个样品的序列分析显示各个位点的核苷酸和氨基酸序列的突变都呈随机性分布。对原核表达的 30个样品进行生物学活性测定 ,结果 70 % (2 1个 )的样品无活性、2 3 3% (7个 )的样品活性低于rhLT、6 7% (2个 )的样品活性高于rhLT。成功构建了rhLT随机点突变组合文库 ,该库不仅在一级结构上具有良好的随机性和多样性 ,而且具有生物学活性的多样性 ,为应用噬菌体展示等高通量筛选策略对淋巴毒素进行体外分子进化和结构与功能的深入研究打下了基础。

关键词：淋巴毒素随机突变分子进化点突变组合文库

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修饰后日本血吸虫Sjc-97基因的真核表达及其免疫原性

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第二军医大学学报 2004年第1期25卷 29-33页

作者：钱磊张冬梅庄英萍邢金花周爱国潘卫庆第二军医大学基础医学部病原生物学教研室上海200433 华东理工大学生物工程学院上海200237

目的 :研究日本血吸虫大陆株副肌球蛋白基因第 3区域片段 (Sjc- 97f3)毕氏酵母表达产物的免疫原性。方法 :根据毕氏酵母密码子使用频率重新设计 Sjc- 97核苷酸序列 ,依据不对称 PCR原理人工合成 Sjc- 97f3,并在毕氏酵母中表达。表达产... 详细信息

目的 :研究日本血吸虫大陆株副肌球蛋白基因第 3区域片段 (Sjc- 97f3)毕氏酵母表达产物的免疫原性。方法 :根据毕氏酵母密码子使用频率重新设计 Sjc- 97核苷酸序列 ,依据不对称 PCR原理人工合成 Sjc- 97f3,并在毕氏酵母中表达。表达产物通过 Ni- NTA亲和层析和凝胶过滤层析方法纯化 ,再分别与 ISA72 0和 Al(OH) 3佐剂乳化后 ,免疫 C5 7BL/ 6和昆明小鼠 ,通过尾蚴膜反应和 EL ISA反应检测特异性抗体。结果 :Sjc- 97f3基因在毕氏酵母中获得了高水平分泌表达 ,其表达产物能与日本血吸虫免疫血清进行特异性免疫反应。经与佐剂乳化后 ,该蛋白具有良好的免疫原性。EL ISA结果显示重组蛋白在小鼠体内可激发明显的抗体反应 ,但 2种佐剂所诱导的抗体水平以 ISA72 0佐剂为高 ;该抗原在不同品系小鼠中的抗体水平存在显著差异 (P<0 .0 1 ) ,昆明鼠的抗血清滴度远高于 C5 7BL/ 6小鼠。小鼠免疫血清能识别日本血吸虫表面抗原 ,产生特异的尾蚴膜反应。结论 :密码子优化的 Sjc- 97f 3在毕氏酵母中获得高效表达。

关键词：基因修饰日本血吸虫 Sjc-97基因基因表达免疫原性毕氏酵母副肌球蛋白

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不同条件下人乳白蛋白YAC的高效定点打靶修饰

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第二军医大学学报 2004年第6期25卷 633-637页

作者：张绪峰吴国祥朱克军焦炳华成国祥第二军医大学基础医学部生物化学与分子生物学教研室上海转基因研究中心上海201203 上海转基因研究中心

目的?对人乳白蛋白酵母人工染色体(HLA-YAC)进行定点改造,以便进一步利用该载体作与基因表达调控相关的研究。方法:借助kar1突变使YPH925菌株与异交配型菌株交配时丧失核融合的能力,把HLA-YAC由酵母AB1380转移到 his3缺陷的YPH925菌株... 详细信息

目的?对人乳白蛋白酵母人工染色体(HLA-YAC)进行定点改造,以便进一步利用该载体作与基因表达调控相关的研究。方法:借助kar1突变使YPH925菌株与异交配型菌株交配时丧失核融合的能力,把HLA-YAC由酵母AB1380转移到 his3缺陷的YPH925菌株。分别以HIS3(对YPH925菌株)和G418R(对YPH925和AB1380两种菌株)为选择标记,用含 HLA-YAC的酵母基因组为模板,PCR克隆人乳白蛋白(HLA)基因的5′和3′端非翻译区各684bp和940bp为同源臂,构建打靶载体,线性化的打靶载体经电转化或醋酸锂转化转入酵母内,以菌落PCR为鉴定方法,辅以测序验证。结果:HLA-YA 在目的位置完成了定点打靶修饰,G418R的筛选效率高于HIS3,醋酸锂转化方法的打靶效率稍高于电转化。结论:对YA 的成功修饰为在动物体内的表达及调控研究打下了基础。

关键词：人乳白蛋白 YAC 高效定点打靶修饰酵母人工染色体酵母人工染色庠转移

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HBV基因疫苗诱导正常及HBV转基因小鼠产生体液免疫应答

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第二军医大学学报 2004年第1期25卷 47-50页

作者：余宏宇陈新龙宋维余永伟张乐之胡以平第二军医大学长征医院病理科上海200003 长海医院烧伤科长征医院贵宾诊疗科长海医院病理科长海医院实验诊断科基础医学部细胞生物学教研室

目的 :用乙型肝炎病毒 (HBV)蛋白基因真核表达载体诱导正常小鼠及 HBV转基因小鼠产生特异性体液免疫应答 ,以探讨其预防及治疗 HBV慢性感染的可行性。方法 :将 HBV S2 .S基因的真核表达载体 p CMV- S2 .S(PS)和相应的空载体 pc D-NA3.0... 详细信息

目的 :用乙型肝炎病毒 (HBV)蛋白基因真核表达载体诱导正常小鼠及 HBV转基因小鼠产生特异性体液免疫应答 ,以探讨其预防及治疗 HBV慢性感染的可行性。方法 :将 HBV S2 .S基因的真核表达载体 p CMV- S2 .S(PS)和相应的空载体 pc D-NA3.0分别免疫正常 C5 7BL/ 6小鼠及同一品系 HBV转基因小鼠 (n=5 )。每只小鼠肌内注射纯化质粒 1 0 0 μg。用 EL ISA方法检测小鼠血清抗 HBs和抗 pre S2效价及 HBV转基因小鼠血清 HBs Ag和 HBe Ag的水平。注射基因疫苗后第 8周 ,活检取转基因小鼠肝脏组织 ,制备石蜡切片并行 H- E染色 ,光镜下观察其病理改变。结果 :PS诱导正常及转基因小鼠产生了抗 HBs及抗pre S2 ,并且抗 pre S2的出现早于抗 HBs约 1～ 2周。PS免疫 8周后 ,转基因小鼠血清 HBs Ag和 HBe Ag为阴性。注射基因疫苗后第 8周病理检查转基因小鼠肝脏组织 ,肝细胞出现程度不同的广泛浊肿和水样变性 ,而相应的对照组无明显改变。免疫前后肝组织内单个核淋巴细胞数量无显著变化。结论 :研究表明 HBV中蛋白基因疫苗能够有效诱导 HBs Ag特异性的体液免疫应答 ,能够清除转基因小鼠血清中的 HBs Ag和 HBe Ag;初步的实验结果为研制治疗

关键词： HBV 基因疫苗转基因小鼠体液免疫免疫应答乙型肝炎病毒

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小鼠肝脏部分耐热蛋白的初步研究

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第二军医大学学报 2004年第8期25卷 896-898页

作者：张振峰高红亮蔡在龙毛积芳焦炳华华东师范大学生命科学学院上海200062 第二军医大学基础医学部生物化学与分子生物学教研室上海200433

目的:研究小鼠肝脏中具有耐热特性的蛋白质,尤其是与肝功能、肝脏再生有密切关系的耐热蛋白。方法:将小鼠肝脏蛋白在65℃处理30 min,去除热变性蛋白,剩余耐热蛋白进行二维电泳,经过考马斯亮蓝染色,得到小鼠肝脏耐热蛋白二维电泳图谱,共... 详细信息

目的:研究小鼠肝脏中具有耐热特性的蛋白质,尤其是与肝功能、肝脏再生有密切关系的耐热蛋白。方法:将小鼠肝脏蛋白在65℃处理30 min,去除热变性蛋白,剩余耐热蛋白进行二维电泳,经过考马斯亮蓝染色,得到小鼠肝脏耐热蛋白二维电泳图谱,共约50个蛋白斑点。其中选取5个相对分子质量在10 000-50 000、分离效果较好的斑点进行MALDI-TOF-MS肽质量指纹谱分析及生物信息学处理。结果:这5个蛋白分别为:谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase)、蛋白酶体亚单位(AF060087)、尼克酰胺乙酰乙酸水解酶(nicotinate-nucleotide pyrophosphorylase)、延胡索酰乙酰乙酸水解酶(fumary-lacetoacetate hydrolase)和regucalcin。结论:初步证明肝脏中谷胱甘肽过氧化物酶、尼克酰胺乙酰乙酸水解酶、延胡索酰乙酰乙酸水解酶和regucalcin具有较强的耐热特性。

关键词：耐热性蛋白肝二维电泳肽质量指纹谱

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人破骨细胞形成抑制因子成熟肽基因在大肠杆菌中的融合表达

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第二军医大学学报 2004年第10期25卷 1086-1089页

作者：张兴群王梁华袁勤生2 缪辉南焦炳华第二军医大学基础医学部生物化学与分子生物学教研室上海200433 华东理工大学国家生物反应器中心上海200237

目的 :在大肠杆菌中高效融合表达人破骨细胞形成抑制因子 (osteoclastogenesis inhibitory factor,OCIF)成熟肽基因。方法 :利用 PCR从人肝细胞文库中扩增得到 OCIF成熟肽编码基因序列 ,将其与 p MD18- T连接 ,转化大肠杆菌 K80 2 ,筛... 详细信息

目的 :在大肠杆菌中高效融合表达人破骨细胞形成抑制因子 (osteoclastogenesis inhibitory factor,OCIF)成熟肽基因。方法 :利用 PCR从人肝细胞文库中扩增得到 OCIF成熟肽编码基因序列 ,将其与 p MD18- T连接 ,转化大肠杆菌 K80 2 ,筛选得到阳性重组克隆载体 p MD18- OCIFm,双酶切重组克隆质粒 p MD18- OCIFm得到 OCIF成熟肽基因 ,将其定向插入p MAL- c2载体中 ,转化大肠杆菌 TB1。筛选得到阳性重组表达子后进行诱导表达。结果 :所获得的 OCIF成熟肽基因编码序列经测序与 Gen Bank报道的完全一致。所表达的产物经 SDS- PAGE分析可见在相对分子质量 80 0 0 0处出现一条特殊条带 ,与预期的相对分子质量一致。Western印迹证实了表达产物的正确。表达产物在高剂量 (>12 0 ng/L)时可诱导体外培养小鼠成熟破骨细胞的凋亡。结论 :成功获得了人 OCIF成熟肽基因的克隆并实现了其在大肠杆菌中的融合表达。

关键词：破骨细胞形成抑制因子基因克隆融合蛋白

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按蚊分子群体遗传结构

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国外医学（寄生虫病分册） 2004年第5期31卷 226-228页

作者：王冬马雅军第二军医大学基础医学部病原生物学教研室上海200433

介绍基于分子的标记和方法研究按蚊群体遗传结构的进展。通常应用的标记为染色体倒位的多态性和DNA分子 ,影响群体间遗传差异的因素包括群体大小、基因流水平、地理模型和历史事件等。目前亟待解决的问题是各个环节的标准化。

关键词：按蚊染色体倒位分子标记多态性方法研究影响遗传结构遗传差异子群体

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高密度发酵制备重组人OCIF活性域多肽融合蛋白

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微生物学通报 2004年第6期31卷 53-56页

作者：张兴群王梁华焦炳华袁勤生华东理工大学生物反应器国家重点实验室第二军医大学基础医学部生物化学和分子生物学教研室上海200433

以补料分批发酵方式在 3 7L发酵罐上实现了人破骨细胞形成抑制因子活性域多肽(OCIFAD)的高密度发酵融合表达。通过参数控制。发酵液最终OD6 0 0 达 1 2 5 (相当于 35g湿菌体 L) ,表达量占菌体总蛋白 40 %左右 ,含量超过 0 6g L ,并且... 详细信息

以补料分批发酵方式在 3 7L发酵罐上实现了人破骨细胞形成抑制因子活性域多肽(OCIFAD)的高密度发酵融合表达。通过参数控制。发酵液最终OD6 0 0 达 1 2 5 (相当于 35g湿菌体 L) ,表达量占菌体总蛋白 40 %左右 ,含量超过 0 6g L ,并且 90 %呈可溶性而直接具有生物学活性。直链淀粉树脂亲和层析法一步纯化 ,纯度达 90

关键词：破骨细胞形成抑制因子融合蛋白发酵补料-分批培养

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基因芯片技术在脑创伤研究中的应用

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医学综述 2004年第12期10卷 736-739页

作者：蒋平吕军焦炳华第二军医大学基础医学部生物化学与分子生物学教研室上海200433

基因芯片(gene chip)是将大量的靶基因片段用点样仪有序地、高密度地(点与点之间的距离一般<500μm)固定在玻璃、硅等固相载体上的一项技术。它将待测样品用荧光染料标记成探针与芯片杂交，杂交后的信号用激光扫描仪检测，计算机分... 详细信息

基因芯片(gene chip)是将大量的靶基因片段用点样仪有序地、高密度地(点与点之间的距离一般<500μm)固定在玻璃、硅等固相载体上的一项技术。它将待测样品用荧光染料标记成探针与芯片杂交，杂交后的信号用激光扫描仪检测，计算机分析检测结果，可获得类似于传统的点杂交的分子杂交数据，比较各组织间靶基因表达谱的差异，以达到快速、高效、高通量及平行性地分析生物信息的目的。

关键词：脑创伤和损伤基因芯片表达谱芯片 mRNA 法医学

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可溶性TRAIL蛋白的高密度培养及补料策略研究

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生物工程学报 2004年第3期20卷 408-413页

作者：章越沈亚领夏小霞孙爱友魏东芝周劲松张国钧王梁华焦炳华华东理工大学生物化学研究所生物反应器工程国家重点实验室上海200237 上海恰尔生物技术有限公司上海200336 第二军医大学基础医学部生物化学与分子生物学教研室上海200433

采用分批补料的方法高密度培养重组大肠杆菌C6 0 0 pBV TRAIL制备人可溶性TRAIL蛋白 ,优化发酵工艺 ,探索简单高效的分离纯化方法并测定蛋白生物活性。通过比较几种不同的补料策略 :间歇流加、DO stat、pH stat,摸索了一种流加策略 ,即... 详细信息

采用分批补料的方法高密度培养重组大肠杆菌C6 0 0 pBV TRAIL制备人可溶性TRAIL蛋白 ,优化发酵工艺 ,探索简单高效的分离纯化方法并测定蛋白生物活性。通过比较几种不同的补料策略 :间歇流加、DO stat、pH stat,摸索了一种流加策略 ,即DO stat pH stat组合流加 ,有效的避免了发酵过程中 ,尤其是诱导表达阶段乙酸积累的增加 ,使TRAIL蛋白在高密度培养条件下 ,得到高效表达。菌体密度最终达到 30 0g L(WCW )以上 ,可溶性TRAIL蛋白占菌体总蛋白的 4 2 % ,含量为 1 1g L。在整个发酵过程中 ,乙酸浓度接近于 0 ,且未使用任何特殊手段 ,如纯氧、加压等 ,简化了发酵工艺 ,降低了发酵成本 ,为TRAIL的工业化生产创造了条件。

关键词：重组大肠杆菌分批补料发酵 TRAIL 分离纯化

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