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2005全国第二届核酸疫苗研讨会

作者：孙树汉郭瀛军李德安张毅颜宏利高远舰何晓文王开宇张术第二军医大学基础医学部医学遗传学教研室第二军医大学基础医学部医学遗传学教研室第二军医大学基础医学部医学遗传学教研室第二军医大学基础医学部医学遗传学教研室第二军医大学基础医学部医学遗传学教研室第二军医大学基础医学部医学遗传学教研室第二军医大学基础医学部医学遗传学教研室第二军医大学基础医学部医学遗传学教研室第二军医大学基础医学部医学遗传学教研室

本课题组在国家“863”、自然科学基金及上海市的资助下,用了近十年的时间系统地研究了DNA疫苗的构建策略、接种方式、联合免疫的最佳组合、保护效果及安全性评价技术与指标。获得一批有价值的数据,其中一些技术与数据已被国家农业部转... 详细信息

本课题组在国家“863”、自然科学基金及上海市的资助下,用了近十年的时间系统地研究了DNA疫苗的构建策略、接种方式、联合免疫的最佳组合、保护效果及安全性评价技术与指标。获得一批有价值的数据,其中一些技术与数据已被国家农业部转基因安全评价委员会采用,发表了数十篇学术论文,其中SCI收录文章二十余篇。同时,我们也发现了许多不能解释的现象:在囊尾蚴DNA疫苗的保护性试验中,实验动物的保护效果经常与特异性的体液、细胞免疫应答的强度相背离;DNA疫苗接种后的攻击试验中除虫体数量减少外还观察到了明显的虫体细胞凋亡。这些现象无法用现有的免疫学理论作出明确的分析和解释,提示在这种现象的背后还隐含着目前不为人们所知晓的免疫应答通路和某些参与分子。鉴于DNA疫苗作用的机制目前还不清楚,因此我们以蛋白质组学为手段展开研究。初步的蛋白质组学分析表明,经接种DNA疫苗与亚单位疫苗实验组动物血清经2D电泳分析后显示大量的差异蛋白点,我们对其中的一小部分蛋白差异点进行了质谱分析,结果显示了多个与细胞免疫与诱导细胞凋亡强烈相关的分子。已获得的信息表明这些分子可初步分为2类:其中一类是在DNA疫苗接种组中特有的蛋白,如1)F-box protein 30,属于泛素修饰酶,能够启动泛素依赖的蛋白酶体的蛋白质降解过程,被泛素化的抗原蛋白被蛋白酶体识别并分解为多肽,其通过TAP介导进入内质网,与MSCI类分子结合,启动抗原特异性的CTL反应。2)钙蛋白酶(Calpain),一类特异性依靠钙激活的中性半肮氨酸蛋白酶。calpain激活后,可通过蛋白酶的水解作用而参与细胞周期的调整和细胞凋亡;同时能诱导IFN-γ的大量产生,进而激活主要的效应细胞产生极强的细胞免疫应答。3)Laspl,为一种actin结合蛋白,可介导蛋白与蛋白之间的相互联结,该蛋白在免疫应答中的作用可能类似于趋化因子,介导细胞因子的分泌及炎性细胞的浸润并进而间接与凋亡的诱导发生关联。另外一类是在亚单位疫苗接种组中特有的蛋白,如peroxircdoxin V,是一种硫氧还蛋白过氧化物酶,能阻止p53依赖的活性氧分子产生,因此能阻止p53诱导的调亡。此类蛋白分子所起的作用与前一类截然相反,可见DNA疫苗与亚单位疫苗可能在激发免疫应答的途径和参与分子方面存在着差异。这些发现是对现有免疫应答机制的补充。进一步对其他大量蛋白差异点的分析还将获取更多的免疫分子信息,有助于我们完善新的DNA疫苗免疫应答机制。

关键词： DNA疫苗蛋白组学细胞凋亡凋之诱导分子

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绦虫膜联蛋白家族分子结构特点、功能与进化的分析

绦虫膜联蛋白家族分子结构特点、功能与进化的分析

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2005全国第二届核酸疫苗研讨会

作者：王凯慧李卡郭瀛军孙树汉章亚男陆一鸣颜宏利第二军医大学基础医学部医学遗传学教研室第二军医大学基础医学部医学遗传学教研室第二军医大学基础医学部医学遗传学教研室第二军医大学基础医学部医学遗传学教研室第二军医大学基础医学部医学遗传学教研室第二军医大学基础医学部医学遗传学教研室第二军医大学基础医学部医学遗传学教研室

目的:研究绦虫Annexin B家族与其他膜联蛋白的相关性及生物学功能。从Swiss-Prot和NCBI-Structure数据库中已知的膜联蛋白氨基酸序列中,根据物种的分类挑选68个,用生物信息学方法分析绦虫AnnexinB家族的结构、功能与进化。绦虫Annexin ... 详细信息

目的:研究绦虫Annexin B家族与其他膜联蛋白的相关性及生物学功能。从Swiss-Prot和NCBI-Structure数据库中已知的膜联蛋白氨基酸序列中,根据物种的分类挑选68个,用生物信息学方法分析绦虫AnnexinB家族的结构、功能与进化。绦虫Annexin B家族中3个膜联蛋白分子均包含4个序列和结构高度相似的结构域,分别含有数量不等的Ca2+结合位点,二级结构显示蛋白主要由α螺旋结构组成,每种膜联蛋白含有不同的motif结构序列,其中Annexin B2所含的motif种类最多.具有人膜联蛋白家族所有的motif。Annexin B1和Annexin B2具有寄生生物所特有的氨基酸残基和功能域。已发现的绦虫膜联蛋白家族都具有抑制血小板凝集的作用,其中Annexin B2活性最强,Annexin B3的作用最弱。Annexin B2在物种进化上,绦虫Annexin B家族和节肢动物为1支,新杆线虫、植物、鸟类和脊椎动物为一支,原虫、腔肠动物、两栖类和脊索动物为一支。另外,Annexin B家族与Annexin A1、Annexin A2和Annexin A5在进化上有较强的亲缘关系,结构和功能与Annexin A1和Annexin A5相似。结论:绦虫Annexin B家族具有膜联蛋白家族的结构特征,从已发现的膜联蛋白分子功能结构域推断,绦虫Annexin B家族蛋白数少于人和鼠(13种)等高等动物,但具有同等的生物学功能,不同的蛋白分子可具有同样的生物学功能,但其强弱不同。随着生物的进化,膜联蛋白家族的基本功能没有变,但蛋白种类越来越多,分工越来越细。膜联蛋白家族的结构可以反应物种的生活习性。

关键词： Annexin B家族绦虫结构进化

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表达含乙肝X亚基多个CTL表位的病毒颗粒样蛋白的减毒伤寒沙门氏菌株的构建

表达含乙肝X亚基多个CTL表位的病毒颗粒样蛋白的减毒伤寒沙门氏菌...

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2005全国第二届核酸疫苗研讨会

作者：任丁何晓文姜磊王芳章亚楠何颖李凯孙树汉第二军医大学基础医学部医学遗传学教研室第二军医大学基础医学部医学遗传学教研室第二军医大学基础医学部医学遗传学教研室第二军医大学基础医学部医学遗传学教研室第二军医大学基础医学部医学遗传学教研室第二军医大学基础医学部医学遗传学教研室第二军医大学基础医学部医学遗传学教研室第二军医大学基础医学部医学遗传学教研室

利用生物信息学预测、体外与MHC分子亲和力分析、激活乙肝病人单核细胞等多个步骤选择HBV中国流行株HBx亚基的HLA-A2 0201限制性CTL表位;将多表位、侧翼序列及间隔序列串珠状的最优化聚合插入乙肝HBc第76位氨基酸(外源基因插入区),克隆... 详细信息

利用生物信息学预测、体外与MHC分子亲和力分析、激活乙肝病人单核细胞等多个步骤选择HBV中国流行株HBx亚基的HLA-A2 0201限制性CTL表位;将多表位、侧翼序列及间隔序列串珠状的最优化聚合插入乙肝HBc第76位氨基酸(外源基因插入区),克隆至pCDNA3真核表达载体,转染至COS-7细胞系中获得表达。乙肝X亚基多个CTL表位与HBc亚基融合表达的目的蛋白具有病毒颗粒样结构,可被抗-Hbc单克隆抗体所特异识别。将重组质粒转化至减毒伤寒沙门氏菌,口服免疫HLA-A0201转基因小鼠,评价表达X亚基多个CTL表位的病毒颗粒样蛋白的减毒伤寒沙门氏菌株免疫效果及安全性,考察疫苗诱导的体液、细胞免疫对HBV复制、对HBV引起的肝细胞肝癌生长的抑制作用,为慢性乙肝、肝癌的免疫治疗探索新型高效的治疗性疫苗。

关键词：乙型肝炎病毒 HBx亚基 HBc亚基减毒伤寒沙门氏菌株 HLA-A0201 转基因小鼠慢性乙肝肝癌

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猪伪狂犬病毒B细胞表位DNA疫苗的构建及免疫效果评价

猪伪狂犬病毒B细胞表位DNA疫苗的构建及免疫效果评价

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2005全国第二届核酸疫苗研讨会

作者：张术郭瀛军王开宇朱维佳孙树汉第二军医大学基础医学部医学遗传学教研室第二军医大学基础医学部医学遗传学教研室第二军医大学基础医学部医学遗传学教研室第二军医大学基础医学部医学遗传学教研室第二军医大学基础医学部医学遗传学教研室

提取猪伪狂犬病毒闽A株基因组DNA为PCR扩增模板,克隆出能诱导动物体产生依赖于补体和不依赖于补体的两种中和抗体的g8糖蛋白基因,同时根据GenBank已发表的PRV Ea株基因序列选取三个连续的B细胞表位区:靠近N端的第59-126、214-279、540-... 详细信息

提取猪伪狂犬病毒闽A株基因组DNA为PCR扩增模板,克隆出能诱导动物体产生依赖于补体和不依赖于补体的两种中和抗体的g8糖蛋白基因,同时根据GenBank已发表的PRV Ea株基因序列选取三个连续的B细胞表位区:靠近N端的第59-126、214-279、540-734位氨基酸,PCR的方法克隆出三个基因。将这四个基因片段分别克隆于pVAX载体,构建DNA疫苗。经纯化免疫Balb/c小鼠,分段采集初免后十周内的血液样品。通过间接ELISA检测PRV特异性抗体,结果显示产生抗体的量表位串联DNA疫苗好于g8基因DNA疫苗,单独的表位DNA疫苗抗体最少。实验结果提示通过将猪伪狂犬病毒gB基因表位区串联构建DNA疫苗比全基因DNA疫苗免疫效果增强。

关键词：猪伪狂犬病毒 DNA疫苗 B细胞表位

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绦虫膜联蛋白家族分子结构特点、功能与进化的分析

绦虫膜联蛋白家族分子结构特点、功能与进化的分析

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中国遗传学会七届一次青年研讨会暨上海高校模式生物E——研究院第一届模式生物学术研讨会

作者：王凯慧李卡郭瀛军孙树汉第二军医大学基础医学部医学遗传学教研室第二军医大学基础医学部医学遗传学教研室第二军医大学基础医学部医学遗传学教研室第二军医大学基础医学部医学遗传学教研室

目的研究绦虫Annexin B家族与其他膜联蛋白的相关性及生物学功能。方法从Swiss-Prot和NCBI-Structure数据库中已知的膜联蛋白氨基酸序列中,根据物种的分类挑选68个,用生物信息学方法分析绦虫Annexin B家族的结构、功能与进化。结果绦虫A... 详细信息

目的研究绦虫Annexin B家族与其他膜联蛋白的相关性及生物学功能。方法从Swiss-Prot和NCBI-Structure数据库中已知的膜联蛋白氨基酸序列中,根据物种的分类挑选68个,用生物信息学方法分析绦虫Annexin B家族的结构、功能与进化。结果绦虫AnnexinB家族中3个膜联蛋白分子均包含4个序列和结构高度相似的结构域,分别含有数量不等的Ca2+结合位点,二级结构显示蛋白主要由α螺旋结构组成,每种膜联蛋白含有不同的motif结构序列,其中Annexin B2所含的motif种类最多,具有人膜联蛋白家族所有的motif。AnnexinB1和Annexin B2具有寄生生物所特有的氨基酸残基和功能域。已发现的绦虫膜联蛋白家族都具有抑制血小板凝集的作用,其中Annexin B2活性最强,Annexin B3的作用最弱。Annexin B2在物种进化上,绦虫Annexin B家族和节肢动物为1支,新杆线虫、植物、鸟类和脊椎动物为一支,原虫、腔肠动物、两栖类和脊索动物为一支。另外,Annexin B家族与Annexin A1、Annexin A2和Annexin A5在进化上有较强的亲缘关系,结构和功能与Annexin A1和AnnexinA5相似。结论绦虫.Annexin B家族具有膜联蛋白家族的结构特征,从已发现的膜联蛋白分子功能结构域推断,绦虫Annexin B家族蛋白数少于人和鼠(13种)等高等动物,但具有同等的生物学功能,不同的蛋白分子可具有同样的生物学功能,但其强弱不同。随着生物的进化,膜联蛋白家族的基本功能没有变,但蛋白种类越来越多,分工越来越细。膜联蛋白家族的结构可以反应物种的生活习性。

关键词：联蛋白分子结构

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卡介菌基因组DNA制备工艺研究

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中国生物制品学杂志 2005年第1期18卷 36-38页

作者：王静胡振林周凤娟凌亦凌孙树汉河北医科大学病理生理教研室石家庄050017 第二军医大学基础医学部医学遗传学教研室上海200433

目的　摸索制备高纯度卡介菌 (MycobacteriumbovisBacillusCalmette Gu啨ｒｉｎ ,BCG)基因组DNA(BCG -DNA)的制备工艺。方法　采用超声破碎结核杆菌 ,加热使蛋白变性初步去除菌体蛋白 ,进一步经蛋白酶消化 ,乙醇沉淀DNA组分 ,再经离子... 详细信息

目的　摸索制备高纯度卡介菌 (MycobacteriumbovisBacillusCalmette Gu啨ｒｉｎ ,BCG)基因组DNA(BCG -DNA)的制备工艺。方法　采用超声破碎结核杆菌 ,加热使蛋白变性初步去除菌体蛋白 ,进一步经蛋白酶消化 ,乙醇沉淀DNA组分 ,再经离子交换和凝胶过滤层析 ,去除残余菌体蛋白和多糖 ,精制DNA ,并进行质量检测。结果　所制备的BCG -DNA片段大小介于 2 0 0～ 2 5 0bp之间 ,纯度大于 95 % ,蛋白含量占 0 . 1% ,多糖残留占 3 .5 %。结论此方法制备的BCG- DNA纯度较高 ,且无有机溶剂残留 ,适用于BCG DNA制备。

关键词： BCG 卡介菌多糖结核杆菌超声 DNA 酶消化制备工艺高纯度去除

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乙型肝炎病毒preS2蛋白在Hela细胞中的表达

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延边大学医学学报 2005年第4期28卷 245-248页

作者：金艳花杨康鹃张子波金雄吉胡以平延边大学基础医学院细胞生物学与医学遗传学教研室第二军医大学细胞生物学教研室

[目的]构建乙型肝炎病毒含3′末端缺失的preS/S基因表达载体并转染细胞,观察所构建载体在体外培养的真核细胞中的表达.[方法]采用基因重组技术构建含有CMV启动子及preS/S基因(adr亚型)开放阅读框的preS/S基因表达载体pcDNA 3.1-preS/St... 详细信息

[目的]构建乙型肝炎病毒含3′末端缺失的preS/S基因表达载体并转染细胞,观察所构建载体在体外培养的真核细胞中的表达.[方法]采用基因重组技术构建含有CMV启动子及preS/S基因(adr亚型)开放阅读框的preS/S基因表达载体pcDNA 3.1-preS/St,并将其转染至Hela细胞,利用免疫细胞化学方法检测其表达情况.[结果]免疫细胞化学检测发现preS 2蛋白可在Hela细胞中表达.

关键词：乙型肝炎病毒蛋白,preS2 癌,肝细胞

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人层黏连蛋白α4链LG2组件单克隆抗体的制备

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第二军医大学学报 2005年第8期26卷 958-959页

作者：张艳宇张玉静朱世成金华许金波陆一鸣军事医学科学院输血研究所北京100850 吉林大学生物化学教研室长春130062 军事医学科学院放射医学研究所北京100850 第二军医大学基础医学部医学遗传学教研室上海200433

层黏连蛋白（laminin，LN）为基底膜结构成分之一，它参与细胞分化和细胞内信号转导，对细胞的生长、分化和组织的发育和修复有很重要的作用。本研究探讨采用基因免疫技术制备LG2组件的单克隆抗体．为后续实验对LNα4链LG组件进行体外... 详细信息

层黏连蛋白（laminin，LN）为基底膜结构成分之一，它参与细胞分化和细胞内信号转导，对细胞的生长、分化和组织的发育和修复有很重要的作用。本研究探讨采用基因免疫技术制备LG2组件的单克隆抗体．为后续实验对LNα4链LG组件进行体外重组奠定实验基础。

关键词：层黏连蛋白α4链 LG2组件抗体,单克隆

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中国人HNPCC家系中hMSH2基因新突变及其功能分析

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第二军医大学学报 2005年第8期26卷 888-891页

作者：金黑鹰颜宏利宋立华崔龙丁义江孙树汉南京中医药大学附属南京市中医院全国肛肠医疗中心南京210001 第二军医大学基础医学部医学遗传学教研室上海200433 上海交通大学食品科学与工程系上海201101 第二军医大学长海医院肛肠外科上海200433

目的:报道1个在中国人遗传性非息肉病性结直肠癌(HNPCC)家系中发现的基因突变,并对其功能进行分析。方法:抽提1组符合Amsterdam标准的HNPCC家系先证者和其他家系成员的基因组DNA,PCR扩增先证者hMLH119个外显子和hMSH216个外显子,利用变... 详细信息

目的:报道1个在中国人遗传性非息肉病性结直肠癌(HNPCC)家系中发现的基因突变,并对其功能进行分析。方法:抽提1组符合Amsterdam标准的HNPCC家系先证者和其他家系成员的基因组DNA,PCR扩增先证者hMLH119个外显子和hMSH216个外显子,利用变性高效液相技术(dHPLC)筛查,对异常峰型利用DNA测序方法检测基因突变。发现先证者hMSH2基因存在错义突变后,对家系中其他成员和50名散发性大肠癌患者和100名正常成年人进行相同位点的检测,以判定是单核苷酸多态性位点(SNP)还是突变。利用5对微卫星标记对该家系中的2例肿瘤进行微卫星不稳定分析,免疫组化检测蛋白表达,利用同源建模方法对发现的突变位点进行功能分析,以研究突变的病理意义。结果:在该家系的2例结肠癌患者中均发现hMSH2基因第13外显子2108位出现CA的错义突变,导致703位Ser变异为Tyr,即C.2108C>A(***703Tyr),微卫星结果显示2例肿瘤均为微卫星高度不稳定(MSIH),肿瘤免疫组化结果显示hMSH1基因表达正常而hMSH2基因不表达。同源建模发现该位点与目前报道的hMSH2基因突变不同,突变位于第Ⅳ结构域,Ser突变为Tyr后空间位阻增大,影响了蛋白的正常折叠和功能。结论:Ser703Tyr是中国人HNPCC的一个新的病理性突变。

关键词：结直肠肿瘤,遗传性非息内性 hMSH2 突变

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肿瘤坏死因子α基因多态性对强直性脊柱炎发病易感性和临床病变程度的影响(英文)

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中国临床康复 2005年第22期9卷 252-254页

作者：韩星海陈蕊雯段世伟杨波蔡青林懿孙树汉解放军第二军医大学长海医院风湿免疫科上海市200433 解放军第二军医大学基础医学部医学遗传学教研室上海市200433 上海交通大学生命科学研究中心中国科学院营养研究所上海市200031

背景:肿瘤坏死因子α基因多态性与强直性脊柱炎发生与发展的关系是近年强直性脊柱炎遗传学研究的热点。目的:探讨肿瘤坏死因子α基因启动子-238和-308位点多态性对强直性脊柱炎发病易感性和病变程度的影响。设计:病例-对照观察。单位:... 详细信息

背景:肿瘤坏死因子α基因多态性与强直性脊柱炎发生与发展的关系是近年强直性脊柱炎遗传学研究的热点。目的:探讨肿瘤坏死因子α基因启动子-238和-308位点多态性对强直性脊柱炎发病易感性和病变程度的影响。设计:病例-对照观察。单位:第二军医大学长海医院风湿免疫科。对象:随机选择1999-01/2003-12在第二军医大学长海医院风湿免疫科就诊的强直性脊柱炎患者108例,各对象间均无血缘关系。男女比为5.3∶1;年龄13～71(30±12)岁,根据骶髂关节破坏程度X射线片评估为Ⅰ～Ⅳ级。另从解放军上海血站(长海医院)随机选取100名健康献血者作为对照,年龄19～56(33±9)岁,男女比为4.9∶1,参与者均知情同意。方法:每例参与者取外周血,加乙二胺四乙酸A抗凝后进行肿瘤坏死因子-α基因启动子的聚合酶链反应扩增和纯化;对聚合酶链反应产物测序,并用Chromas1.62软件展示分析DNA测序结果。②以X射线骶髂关节片分级和肿瘤坏死因子α-308位点(G/C)和(G/A)的对应值评估其对疾病程度的影响。主要观察指标:以DNA直接测序法对-238和-308位点进行基因分型,并分析基因类型与疾病临床表现之间的关系。结果:①肿瘤坏死因子α-238G/G基因型和-238G/A基因型:强直性脊柱炎组有106例(98.1%)和2例(1.9%),正常对照组有95例(95.0%)和5例(5.0%),两组间比较无显著性差异。②肿瘤坏死因子α-308.1.1(G/G)基因型和-308.1.2(G/A)基因型:强直性脊柱炎组有89例(82.4%)和19例(17.6%),正常对照组中有85例(85.0%)和14例(14.0%)。两组比较亦无显著性差异。③根据骶髂关节X射线分级判定疾病严重程度与肿瘤坏死因子α-308位点G/G和G/A基因型之间的关系:强直性脊柱炎患者X射线片Ⅰ级、Ⅱ级、Ⅲ级和Ⅳ级时,(G/G)型为3/35/40/11例,(G/A)型为1/12/6/0例。两组差异比较意义显著(χ2GMH=4.77,P<0.05)。结论:在观察对象中未发现肿瘤坏死因子α基因启动子-238和-308位点多态性与强直性脊柱炎发病易感性相关,但根据骶髂关节损害程度X射线分级说明肿瘤坏死因子α基因启动子-308位点的多态性对强直性脊柱炎的严重程度有影响。

关键词：脊柱炎,强直性肿瘤坏死因子多态现象(遗传学) 基因疾病易感性

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