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第二届中国生物产业大会

作者：杨桥张晓玲朱玉平韩文菊卢小玲张文俊高云缪辉南焦炳华第二军医大学基础医学部生物化学与分子生物学教研室上海200433 中国水产科学研究院东海水产研究所上海200090 第二军医大学基础医学部卫生毒理学教研室上海200433 上海海洋大学食品学院上海200090

当前,陆地微生物资源的日益枯竭,加上抗生素的滥用使得病原微生物获得耐药性的速度远快于人类从陆地微生物中获得新型抗生素的速度,因此,寻求和开发新的微生物药物资源,对于新型抗生素的发现和耐药性感染疾病的治疗,有着重要的现实意义... 详细信息

当前,陆地微生物资源的日益枯竭,加上抗生素的滥用使得病原微生物获得耐药性的速度远快于人类从陆地微生物中获得新型抗生素的速度,因此,寻求和开发新的微生物药物资源,对于新型抗生素的发现和耐药性感染疾病的治疗,有着重要的现实意义.特殊的生存环境,赋予了海洋微生物独特的基因资源和可产生陆地微生物不具有的特殊化学结构及活性化合物的能力,使得海洋微生物药物资源的研发已成为了海洋药物和生物技术领域的国际热点和前沿.本研究室自中国东海30米深海泥分离筛选到一株抗菌及抑癌作用显著的革兰氏阳性菌株.经形态学及培养特征观察，生理生化指标测定及16SrRNA序列分子鉴定,并就生物活性进行初步探讨.

关键词：芽孢杆菌海洋微生物大环内酯生物活性抗菌素

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生物技术发明的可专利性策略研究

生物技术发明的可专利性策略研究

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第二届中国生物产业大会

作者：杨桥张晓玲朱玉平韩文菊张文俊缪辉南冯伟华焦炳华第二军医大学基础医学部生物化学与分子生物学教研室上海200433 中国水产科学研究院东海水产研究所上海200090 第二军医大学基础医学部卫生毒理学教研室上海200433 上海海洋大学食品学院上海200090

当今,生物技术已广泛渗透到医药卫生,科学研究及工农业生产等领域的诸多方面.在改善人类赖以生存的物质要素的同时,不但催生了规模日渐扩大的生物技术产业,也使生物技术发明及其保护日益受到人们的关注.从中国专利法对生物技术领域不同... 详细信息

当今,生物技术已广泛渗透到医药卫生,科学研究及工农业生产等领域的诸多方面.在改善人类赖以生存的物质要素的同时,不但催生了规模日渐扩大的生物技术产业,也使生物技术发明及其保护日益受到人们的关注.从中国专利法对生物技术领域不同发明主题的保护策略分析来看，中国专利法目前在对新兴的生物技术领域的发明主题的专利保护方面，采取了相对保守的策略，对本领域的重要发明主题转基因动物和植物及基因诊断和治疗方法均不授予专利权.采取这种策略的一种潜在理由可能是目前中国在本领域的科研水平还相对低下，给予专利保护的结果实际上主要保护的是目前递交发明专利申请占多数比例的外国人.

关键词：生物技术可专利性专利保护

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3种磨损颗粒对体外原代培养人成骨细胞的作用

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第三军医大学学报 2003年第24期25卷 2237-2239页

作者：王文良吴岳嵩焦炳华杨柳许建中娄永华第三军医大学附属西南医院骨科重庆400038 第二军医大学附属长海医院骨科上海200433 第二军医大学基础医学部分子毒理学教研室上海200433

目的　比较 3种不同磨损颗粒对体外原代培养人成骨细胞的作用。方法　PE颗粒、TI 6Al 4V颗粒、Co Cr Mo颗粒加入体外原代培养的人成骨细胞 ,噻唑蓝 (MTT)比色试验检测细胞存活和生长。用酶联免疫检测仪在 490nm波长处测定其吸光度值 ,... 详细信息

目的　比较 3种不同磨损颗粒对体外原代培养人成骨细胞的作用。方法　PE颗粒、TI 6Al 4V颗粒、Co Cr Mo颗粒加入体外原代培养的人成骨细胞 ,噻唑蓝 (MTT)比色试验检测细胞存活和生长。用酶联免疫检测仪在 490nm波长处测定其吸光度值 ,可间接反映活细胞数量。结果　不同浓度、不同磨损颗粒对原代培养成骨细胞成活无明显影响。结论　不同浓度、不同磨损颗粒对原代培养成骨细胞成活无明显影响。

关键词：磨损颗粒成骨细胞人工关节无菌性松动细胞培养

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人THANK cDNA的克隆及其在大肠杆菌中表达

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中华微生物学和免疫学杂志 2001年第4期21卷 460-464页

作者：吴东沈锋娄永华彭敏焦炳华吴孟超第二军医大学东方肝胆外科医院上海200438 第二军医大学基础部分子毒理学教研室

目的　克隆THANKcDNA ,并在大肠杆菌中进行表达。方法　采用RT PCR技术 ,从人外周血单个核细胞的总RNA中扩增人THANK全长编码区基因及THANK胞外区编码基因 ,PCR产物直接克隆于pMD 18T载体中 ,重组克隆进行DNA测序。将测序证实的THANK胞... 详细信息

目的　克隆THANKcDNA ,并在大肠杆菌中进行表达。方法　采用RT PCR技术 ,从人外周血单个核细胞的总RNA中扩增人THANK全长编码区基因及THANK胞外区编码基因 ,PCR产物直接克隆于pMD 18T载体中 ,重组克隆进行DNA测序。将测序证实的THANK胞外区基因亚克隆到原核表达载体pET 11a中。阳性重组子 ,以 1mmol/LIPTG进行诱导表达 ,以SDS PAGE分析THANK胞外区的表达。对表达的蛋白作初步纯化处理后 ,进行生物学活性检测。结果　RT PCR扩增出一个85 8bp的DNA片段 ,限制性内切酶图谱分析和测序结果显示 ,该片段为编码人THANK的cDNA ,与公布的人THANK基因序列一致。将胞外区片段克隆入表达载体 ,转化大肠杆菌表达后发现 ,与阴性对照相比 ,在相对分子质量 (Mr) 2 6× 10 4 处多显示出一条条带。对该蛋白进行初步活性测定显示其可显著地抑制U937细胞的生长。结论　本实验成功地克隆了人THANK基因 ,并将其可溶性胞外区片段在大肠杆菌中进行了表达 ,表达的重组蛋白可抑制U937细胞的生长。

关键词： THANK RT-PCR 基因克隆基因表达大肠杆菌

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人THANK基因的克隆和表达

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第二军医大学学报 2001年第7期22卷 645-647页

作者：吴东沈锋娄永华朱玉萍焦炳华吴孟超第二军医大学东方肝胆外科医院上海200438 第二军医大学础医学部分子毒理学教研室第二军医大学基础医学部分子毒理学教研室

目的 :克隆人 THANK基因全长及胞外区片段 ,将其胞外区在大肠杆菌中表达。方法 :采用 RT- PCR技术 ,从人白血病细胞系 HL - 6 0细胞总 RNA中扩增人 THANK c DNA ,并定向克隆于 p MD18- T载体 ,经测序证实 ,再亚克隆 THANK的胞外区片段... 详细信息

目的 :克隆人 THANK基因全长及胞外区片段 ,将其胞外区在大肠杆菌中表达。方法 :采用 RT- PCR技术 ,从人白血病细胞系 HL - 6 0细胞总 RNA中扩增人 THANK c DNA ,并定向克隆于 p MD18- T载体 ,经测序证实 ,再亚克隆 THANK的胞外区片段至 p ET表达载体 ,在大肠杆菌中进行表达。结果 :RT- PCR扩增出一个 85 8bp的 DNA片段 ,该片段与公布的人THANK基因序列一致。诱导后 THANK胞外区在大肠杆菌中可表达出相对分子质量为 2 .6万的蛋白质。结论 :成功地克隆了人 THANK基因 ,并在大肠杆菌中获得表达 ,为其功能的研究打下基础。

关键词：基因 THANK 聚合酶链反应克隆分子肿瘤坏死因子 TNF

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重组THANK诱导表达和变性、复性及纯化

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第二军医大学学报 2001年第9期22卷 823-826页

作者：吴东沈锋娄永华彭敏焦炳华吴孟超第二军医大学东方肝胆外科医院上海200438 第二军医大学基础医学部分子毒理学教研室

目的 :获得较纯的具有生物学活性的 THANK蛋白。方法 :THANK基因在大肠杆菌中高效表达 ,菌体超声破碎后 ,以洗涤剂反复洗涤包涵体。包涵体经 8mol/L尿素变性溶解后 ,再用 Sephacryl S- 2 0 0凝胶过滤层析初步纯化 ,对重组蛋白浓度、氧... 详细信息

目的 :获得较纯的具有生物学活性的 THANK蛋白。方法 :THANK基因在大肠杆菌中高效表达 ,菌体超声破碎后 ,以洗涤剂反复洗涤包涵体。包涵体经 8mol/L尿素变性溶解后 ,再用 Sephacryl S- 2 0 0凝胶过滤层析初步纯化 ,对重组蛋白浓度、氧化还原剂等复性参数进行优化和选择 ,将蛋白稀释复性。复性后组分经 Q Sapharose Fast Flow离子交换层析再次纯化 ,最后以 Sep hadex G- 2 5脱盐。结果 :得到了纯度 >97%、具有一定生物学活性的 THANK蛋白。结论 :THANK蛋白变性、复性及纯化方法的建立 ,为

关键词： THANK 重组蛋白质类基因表达基因调控免疫调节肿瘤细胞

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重组人可溶性血管内皮细胞生长抑制因子的抗新生血管形成活性研究

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药物生物技术 2001年第1期8卷 17-21页

作者：肖扬焦炳华娄永华刘梁英朱玉平第二军医大学基础部分子毒理学教研室上海200433 福建医科大学微生物教研室福州350025

血管内皮细胞生长抑制因子 (VascularEndothelialGrowthInhibitor ,VEGI)是从人脐静脉内皮细胞(HUVEC)cDNA文库筛选到的一个TNF超家族新成员。为研究重组可溶性人VEGI对新生血管形成抑制活性 ,检测了重组可溶性人VEGI对建株人脐静脉内... 详细信息

血管内皮细胞生长抑制因子 (VascularEndothelialGrowthInhibitor ,VEGI)是从人脐静脉内皮细胞(HUVEC)cDNA文库筛选到的一个TNF超家族新成员。为研究重组可溶性人VEGI对新生血管形成抑制活性 ,检测了重组可溶性人VEGI对建株人脐静脉内皮细胞 (ECV30 4)增殖抑制活性以及对兔角膜诱生血管、鸡胚尿囊膜 (CAM )血管的抑制活性。表明可溶性人VEGI可以直接抑制ECV30 4内皮细胞的增殖 ,抑制兔角膜诱生血管、CAM血管形成。VEGI是一种新的血管内皮细胞生长抑制因子 ,强烈抑制新生血管形成 ,有望应用于肿瘤的治疗。

关键词：血管内皮细胞生长抑制因子 VEGI 内皮细胞新生血管抑制因子

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THANK基因的克隆和序列分析

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免疫学杂志 2000年第6期16卷 432-435页

作者：吴东沈锋娄永华焦炳华吴孟超第二军医大学东方肝胆外科医院上海200438 第二军医大学基础部分子毒理学教研究室上海200433

目的克隆THANK基因全长及胞外区片段并测序。方法采用RT-PCR技术,从人白血病细胞系HL-60细胞总RNA中扩增人THANK cDNA,并定向克隆于pMD-18 T载体,转染大肠杆菌、抽提质粒后,用ABI PRISM^TM 377XL DNA自动测序仪测序。结果RT-PCR扩增... 详细信息

目的克隆THANK基因全长及胞外区片段并测序。方法采用RT-PCR技术,从人白血病细胞系HL-60细胞总RNA中扩增人THANK cDNA,并定向克隆于pMD-18 T载体,转染大肠杆菌、抽提质粒后,用ABI PRISM^TM 377XL DNA自动测序仪测序。结果RT-PCR扩增出一个858bp的DNA片段,限制性内切酶图谱分析和测序结果显示:该858bp片段为编码人THANK的cDNA,与公布的人THANK 基因序列一致。结论本实验成功地克隆了人THANK基因,为进一步表达人THANK基因并研究其功能,开发与临床应用奠定了基础。

关键词：人THANK基因 PT-PCR cDNA 克隆免疫治疗肿瘤

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LPS、rh-TNFα刺激PBL诱导TRAIL表达的初步研究

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免疫学杂志 1999年第3期15卷 170-172页

作者：王梁华朱玉平潘卫娄永华陈建鹤冯煜焦炳华第二军医大学基础部分子毒理学教研室第二军医大学基础部微生物学教研室

选择人ＰＢＬ作为人ＴＲＡＩＬ基因的来源，抽提细胞在ＬＰＳ和ｒｈ－ＴＮＦα刺激２、１０、１８ｈ的总ＲＮＡ，通过ＲＴ－ＰＣＲ观察ＴＲＡＩＬ基因转录ｍＲＮＡ的水平，然后用ＰＣＲ扩增ＴＲＡＩＬ基因，并用免疫印迹法分析ＴＲＡＩ... 详细信息

选择人ＰＢＬ作为人ＴＲＡＩＬ基因的来源，抽提细胞在ＬＰＳ和ｒｈ－ＴＮＦα刺激２、１０、１８ｈ的总ＲＮＡ，通过ＲＴ－ＰＣＲ观察ＴＲＡＩＬ基因转录ｍＲＮＡ的水平，然后用ＰＣＲ扩增ＴＲＡＩＬ基因，并用免疫印迹法分析ＴＲＡＩＬｍＲＮＡ翻译蛋白的水平。结果发现：在ＬＰＳ和ｒｈ－ＴＮＦα刺激细胞并进一步诱导细胞凋亡可能与诱导表达ＴＲＡＩＬ有关。本实验得到了ＴＲＡＩＬ基因，为重组表达ＴＲＡＩＬ打下了基础。

关键词：肿瘤坏死因子 TRAIL LPS rh-TNFα 基因表达

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肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TRAIL)cDNA的克隆与表达

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中国生物化学与分子生物学报 1999年第4期15卷 667-670页

作者：王梁华朱玉平潘卫娄永华冯煜焦炳华第二军医大学基础部分子毒理学教研室上海200433

Recent experiments showed that the apoptosis of tumor cells was highly related to the expression of tumor necrosis factor related apoptosis inducing factor (TRAIL) which was first cloned from expressed sequence tag database (EST). At the same time, it played a role in the lymphocytes differentiation and proliferation, but many of its characteristics and mechanism remain unknown up to now. To investigate its biological functions and related mechanisms, the coding region of human soluble TRAIL gene from LPS activated healthy human peripheral lymphocytes (PBL) was cloned using RT PCR and constructed a 6 His tag vector pProEX HTb hTRAIL. By DNA sequencing, the cloned hTRAIL was identical to that *** IPTG inducing, the soluble hTRAIL was highly expressed in E. coli K802 up to 30% of bacterial protein. The expressed 6 His hTRAIL protein could induce death of L929 cells as the same as TNF α. The recombinant TRAIL was obtained which paved the way for further studies on its biological characteristics and related mechanisms.

关键词：肿瘤坏死因子细胞凋亡配体 cDNA 克隆表达

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