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2007年中国目前重要人兽共患病学术研讨会

作者：戚中田第二军医大学微生物学教研室全军医学微生物学重点实验室上海 200433

近年,结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis,Mtb)感染所致结核病(tuberculosis,TB)的发病率和死亡率一直高居不下。在全球,Mtb感染者几占总人口的三分之一,每年TB新发和死亡患者分别在900万和200万人左右。在中国,TB(主要是肺结核)... 详细信息

近年,结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis,Mtb)感染所致结核病(tuberculosis,TB)的发病率和死亡率一直高居不下。在全球,Mtb感染者几占总人口的三分之一,每年TB新发和死亡患者分别在900万和200万人左右。在中国,TB(主要是肺结核)现有患者约500万人(80％在农村),数量居世界第二位,其发病数与死亡数一直高居法定报告甲乙类传染病的首位(卫生部每月公告)。目前,传统卡介苗的预防效果已不甚理想,并且耐药Mtb感染正逐渐增多。然而,Mtb的具体致病机制仍不十分清楚,这为研发新型疫苗和更加敏感有效的抗TB药物造成了很大障碍。本文论述了毒力基因mcela在Mtb潜伏生存与活性增殖状态下的表达特性以及McelA蛋白介导细菌侵袭的作用机制。

关键词：结核杆菌毒力基因介导侵袭机制

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siRNA抑制survivin的表达诱导人卵巢癌SKOV-3细胞凋亡的研究

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同济大学学报（医学版） 2007年第2期28卷 14-18页

作者：王建军刘彧王宏卫廖小玲朱诗应李怀芳同济大学附属同济医院妇产科上海200065 第二军医大学微生物学教研室上海200433

目的筛选能有效抑制survivin基因表达的小干扰RNA(siRNA),探讨survivin基因抑制对人卵巢癌SKOV-3细胞凋亡的影响。方法设计3段survivin siRNA靶位点,用PCR扩增siRNA表达框,与survivin-绿色荧光蛋白融合基因表达质粒共转染293T细胞,再构... 详细信息

目的筛选能有效抑制survivin基因表达的小干扰RNA(siRNA),探讨survivin基因抑制对人卵巢癌SKOV-3细胞凋亡的影响。方法设计3段survivin siRNA靶位点,用PCR扩增siRNA表达框,与survivin-绿色荧光蛋白融合基因表达质粒共转染293T细胞,再构建有效siRNA的表达载体,转染卵巢癌SKOV-3细胞,分析sur-vivin基因的表达及细胞凋亡情况。结果筛选出了1段能高效抑制survivin表达的siRNA,能显著下调SKOV-3细胞内的survivin表达,并导致SKOV-3细胞凋亡。结论利用RNA干扰能有效抑制survivin基因表达并诱导人卵巢癌SKOV-3细胞凋亡,为进一步的靶向survivin分子的体内抗肿瘤研究奠定了基础。

关键词： survivin RNA干扰卵巢肿癌细胞凋亡

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烟草环斑病毒的RT-PCR和IC-RT-PCR检测方法研究

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上海农业学报 2007年第1期23卷 83-87页

作者：杨翠云曹洁于翠高焕利沈禹飞代光辉上海出入境检验检疫局上海200135 第二军医大学微生物学教研室上海200433 上海交通大学农业与生物学院上海201101

根据TRSV CP基因的保守序列设计引物,RT-PCR和IC-RT-PCR能从TRSV的2个分离物中分别扩增到与预期大小相同的DNA条带,序列测定和分析表明所扩增序列为TRSV CP基因的部分序列,在系统关系树上与TRSV的其他分离物形成一簇,表明所建立的RT-PCR... 详细信息

根据TRSV CP基因的保守序列设计引物,RT-PCR和IC-RT-PCR能从TRSV的2个分离物中分别扩增到与预期大小相同的DNA条带,序列测定和分析表明所扩增序列为TRSV CP基因的部分序列,在系统关系树上与TRSV的其他分离物形成一簇,表明所建立的RT-PCR和IC-RT-PCR检测方法是可靠的。

关键词：烟草环斑病毒(TRSV) RT-PCR IC-RT-PCR 检测方法

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番茄环斑病毒单克隆抗体的制备

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微生物学杂志 2007年第3期27卷 35-37页

作者：曹洁杨翠云潘卫于翠戚中田代光辉第二军医大学微生物学教研室上海200433 上海出入境检验检疫局上海200135 上海交通大学农业与生物学院上海201101

以纯化的番茄环斑病毒(Tomato ringspot virus,ToRSV)为抗原,注射免疫BALB/c小鼠,将免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0进行融合,经多次细胞筛选及克隆化,获得3株(A8、B7和G9)可分泌抗ToRSV单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并以之分别制备... 详细信息

以纯化的番茄环斑病毒(Tomato ringspot virus,ToRSV)为抗原,注射免疫BALB/c小鼠,将免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0进行融合,经多次细胞筛选及克隆化,获得3株(A8、B7和G9)可分泌抗ToRSV单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并以之分别制备小鼠腹水单克隆抗体。经酶联免疫吸附试验检测表明,该3株杂交瘤细胞腹水抗体效价在10-5～10-6之间,且均具有与ToRSV反应的特异性。

关键词：番茄环斑病毒小鼠免疫单克隆抗体

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丙型肝炎病毒F蛋白磷酸化位点突变与细胞内分布

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微生物与感染 2007年第2期2卷 78-82页

作者：邵圣文于建国武文斌赵平丁惠戚中田第二军医大学微生物学教研室军队医学微生物学重点实验室上海200433 解放军第八十八医院济南军区肝病研究所

目的探讨丙型肝炎病毒(HCV)F蛋白磷酸化位点突变对其在细胞内分布位置及功能的影响。方法应用NetPhos2.0Server软件预测F蛋白的磷酸化位点,据此设计重叠引物,利用引物之间相互延伸获得突变型HCVf基因,该基因第13、14、114、121和124位... 详细信息

目的探讨丙型肝炎病毒(HCV)F蛋白磷酸化位点突变对其在细胞内分布位置及功能的影响。方法应用NetPhos2.0Server软件预测F蛋白的磷酸化位点,据此设计重叠引物,利用引物之间相互延伸获得突变型HCVf基因,该基因第13、14、114、121和124位密码子由野生型f基因的TCT突变为GAT,对应氨基酸由丝氨酸(S)突变为天冬氨酸(D)。将突变型f基因及野生型f基因定向克隆至pEGFP-N1,得到pEGFP-mf和pEGFP-f重组子。采用脂质体法将重组子转染HepG2细胞,再用激光共聚焦显微镜观察突变型F蛋白以及野生型F蛋白在细胞内的分布情况,拍照并进行半定量分析。结果在HepG2细胞中,突变型F蛋白主要分布在细胞核内(90%),细胞质内有少量分布(10%),平均荧光强度分别为63.70±3.20和7.06±0.34,两者差异有统计学意义(P<0.001,t=99.2);野生型F蛋白主要分布在细胞质内(94.9%),细胞核内有少量分布(5.1%),平均荧光强度分别为83.34±4.07和4.48±0.22,两者差异有统计学意义(P<0.001,t=106.5)。结论HCVF蛋白在细胞内存在磷酸化和非磷酸化2种形式,其功能也不同。细胞质内以磷酸化F蛋白为主,非磷酸化F蛋白主要位于细胞核内。磷酸化F蛋白可能参与HCV复制调节,非磷酸化F蛋白可能影响细胞核内基因转录。

关键词：丙型肝炎病毒 F蛋白磷酸化

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16S rDNA用作荧光定量PCR靶基因快速检测铜绿假单胞菌

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生物工程学报 2006年第5期22卷 789-794页

作者：薛利军王永智任浩童一民赵平朱诗应戚中田第二军医大学微生物学教研室全军医学微生物学重点实验室上海200433

对20余种细菌16SrDNAs进行多序列比对与进化树分析,设计铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa,PA)荧光定量PCR(fluorescencequantitativePCR,FQ-PCR)特异性引物。提取PA基因组DNA,以特异性引物扩增16SrDNA靶片段,并构建重组质粒pMDT-Pfr。将梯度稀释的pMDT-Pfr质粒作为模板,用于建立定量标准曲线。以SYBRGreenI荧光染料建立20μL反应体系,对不同浓度的PADNA样品进行FQ-PCR检测。同时,以金黄色葡萄球菌、伤寒杆菌、福氏志贺菌、变形杆菌、表皮葡萄球菌、大肠杆菌和结核杆菌的基因组DNA作阴性对照,验证FQ-PCR方法检测PA的特异性。结果显示,设计的FQ-PCR引物的靶向序列,仅对PA16SrDNA有高度同源性;FQ-PCR方法检测PA,其灵敏度达3.6pg/μL的基因组DNA或(2.1×103±3.1×102)拷贝/μL的16SrDNA基因,并且具有很强的特异性;从细菌DNA提取到FQ-PCR检测,可在2h左右完成PA鉴定。较传统的培养鉴定法而言,以16SrDNA作为FQ-PCR靶基因快速检测PA,具有很好的研究价值与应用前景。

关键词：铜绿假单胞菌 16S rDNA 荧光定量PCR 检测

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铜绿假单胞杆菌QS相关基因差异表达的研究

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微生物学通报 2006年第6期33卷 27-33页

作者：童一民潘欣荣光华戚中田第二军医大学微生物学教研室全军微生物学重点实验室上海200433

选取100个与铜绿假单胞杆菌(Pseudomonasaeruginosa)群感效应(quorum-sens-ing,QS)相关的基因,克隆这些基因片段于pMD-18T载体,测序鉴定,点样制备cDNA基因芯片。制备cy3-dCTP/cy5-dCTP标记的探针,与芯片杂交。初步研究了处于不同生长期... 详细信息

选取100个与铜绿假单胞杆菌(Pseudomonasaeruginosa)群感效应(quorum-sens-ing,QS)相关的基因,克隆这些基因片段于pMD-18T载体,测序鉴定,点样制备cDNA基因芯片。制备cy3-dCTP/cy5-dCTP标记的探针,与芯片杂交。初步研究了处于不同生长期的铜绿假单胞杆菌基因的表达差异。指数中期和平台初期相比,有9个QS基因表达量显著增加,有6个基因表达量显著下降。利用芯片做针对铜绿菌假单胞杆菌药物的筛选妥布霉素(Tobramycin)给药后细菌基因发生差异表达。证明了该cDNA芯片用于药物筛选的可行性。在国内首次研制开发了QS相关基因的cDNA芯片。应用基因芯片技术建立的铜绿假单胞杆菌QS相关基因研究平台,为找到能较好抑制铜绿假单胞杆菌正常生长的药物研究提出新的解决方法。

关键词：铜绿假单胞菌群感效益基因 cDNA芯片差异表达

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丙型肝炎病毒复合高变区1模拟表位蛋白的免疫原性分析

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中国病毒学 2006年第1期21卷 24-28页

作者：龚育平高军赵平秦照玲杨苗戚中田第二军医大学微生物学教研室全军医学微生物学重点实验室上海200433

将丙型肝炎病毒高变区1(HVR1)模拟表位融合基因插入原核表达载体pGEX-4T-1,在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达,经亲和层析和凝胶过滤层析获得HCVHVR1模拟表位融合蛋白。用Westernblot和ELISA检测融合蛋白与HCV抗体阳性血清的结合情况。皮... 详细信息

将丙型肝炎病毒高变区1(HVR1)模拟表位融合基因插入原核表达载体pGEX-4T-1,在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达,经亲和层析和凝胶过滤层析获得HCVHVR1模拟表位融合蛋白。用Westernblot和ELISA检测融合蛋白与HCV抗体阳性血清的结合情况。皮下注射免疫BALB/c小鼠,用ELISA检测小鼠血清中的抗HCV抗体水平及其与天然HCV高变区1合成肽的交叉反应。结果表明融合蛋白能与HCV抗体阳性血清特异结合,融合蛋白与HCV抗体阳性血清的结合频率为71.6%(25/35)。融合蛋白免疫小鼠后能有效诱导免疫应答,其诱生的特异性抗体最高滴度达104(免疫后第8周),且该抗体能同2条天然HCVHVR1合成肽发生交叉反应。本研究提示,HCV复合HVR1模拟表位融合蛋白在丙型肝炎疫苗的研发中可能具有潜在应用价值。

关键词：丙型肝炎病毒高变区1 模拟表位免疫原性

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炭疽芽胞杆菌染色体特异序列的筛选及实时定量检测

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微生物学报 2006年第6期46卷 900-905页

作者：荣光华夏懿朱诗应童一民戚中田第二军医大学微生物学教研室全军医学微生物学重点实验室上海200433 复星医学科技发展有限公司上海200233

筛选117条炭疽芽胞杆菌（Bacillus anthracis）特异序列，经双重特异性验证后得到19条理想的特异序列（genomic signatures），其中6条符合设计TaqMan探针建立实时定量PCR的要求，根据常规PCR检测结果选择其中CO4片段与炭疽芽胞杆菌毒... 详细信息

筛选117条炭疽芽胞杆菌（Bacillus anthracis）特异序列，经双重特异性验证后得到19条理想的特异序列（genomic signatures），其中6条符合设计TaqMan探针建立实时定量PCR的要求，根据常规PCR检测结果选择其中CO4片段与炭疽芽胞杆菌毒性质粒pX01、pX02上的pagA、capB基因建立实时定量PCR检测体系。经试验证实这一体系检测灵敏度达到每PCR反应10～100个拷贝。利用12种相关菌株评价后获得100％特异性，对10份模拟污染标本和20份对照标本检测，所有污染标本均被检出，所有对照标本均为阴性。此方法特异、灵敏、高效，在炭疽芽胞杆菌感染的诊断和环境污染的检测等领域有潜在的应用前景。

关键词：炭疽芽胞杆菌染色体特异序列实时定量检测 PCR

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“拉链(zipper)”与“触发(trigger)”——细菌侵袭的分子机制

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生命的化学 2006年第2期26卷 123-126页

作者：薛利军戚中田第二军医大学微生物学教研室全军医学微生物学重点实验室上海200433

对宿主细胞的侵袭是细胞内菌致病的关键步骤。细菌侵袭过程与Rho、Rac和Cdc42等Rho家族成员介导的肌动蛋白细胞骨架重排有关,涉及“拉链(zipper)”与“触发(trigger)”两种主要机制以及“拉链-触发(zipper-trigger)”双重机制。研究细... 详细信息

对宿主细胞的侵袭是细胞内菌致病的关键步骤。细菌侵袭过程与Rho、Rac和Cdc42等Rho家族成员介导的肌动蛋白细胞骨架重排有关,涉及“拉链(zipper)”与“触发(trigger)”两种主要机制以及“拉链-触发(zipper-trigger)”双重机制。研究细菌侵袭过程中Rho家族的作用及相应细胞骨架事件,有助于揭示细菌侵袭的分子机制。

关键词：细胞骨架拉链(zipper)机制触发(trigger)机制 Rho家族

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