目的构建携带大鼠原癌基因Pim-1的重组腺相关病毒2载体(rAAV2-Pim-1),检测其体内感染大鼠视网膜的细胞类型及目的基因Pim-1在视网膜中的表达。方法 p AOV-CAGMINI-EGFP-2A-MCS-3FLAG载体及Pim-1基因PCR产物用Nhel酶切,琼脂糖凝胶电泳鉴...
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目的构建携带大鼠原癌基因Pim-1的重组腺相关病毒2载体(rAAV2-Pim-1),检测其体内感染大鼠视网膜的细胞类型及目的基因Pim-1在视网膜中的表达。方法 p AOV-CAGMINI-EGFP-2A-MCS-3FLAG载体及Pim-1基因PCR产物用Nhel酶切,琼脂糖凝胶电泳鉴定后回收载体及目的基因DNA并连接转化,鉴定质粒阳性克隆及测序。rAAV2-Pim-1表达质粒p AOV-CAGMINI-EGFP-2A-Pim-1-3FLAG及包装质粒p AAV-RC和辅助质粒p Helper,通过Lipofectamine 2000共转染293细胞,纯化获得高滴度的rAAV2-Pim-1。大鼠玻璃体注射rAAV2-Pim-1,用免疫荧光组织化学检测其感染视网膜的细胞类型;用Real-time PCR和Western blotting检测Pim-1在视网膜中的表达。结果rAAV2-Pim-1质粒构建成功并且核苷酸序列比对正确;质粒转染293细胞后出现绿色荧光;包装出的病毒浓缩滴度为5.7×1015vg/L。rAAV2-Pim-1组体内感染视网膜神经节细胞(RGCs)达71%,并感染少量无长突细胞,几乎不感染星形胶质细胞;Pim-1 mRNA和蛋白在视网膜中的表达约为rAAV2-EGFP组的6.61倍和2.29倍。结论成功构建rAAV2-Pim-1病毒载体,并在感染后的大鼠视网膜RGCs中过表达Pim-1。
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