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HBV病毒蛋白在C57-TgN(HBVadr2.0)SMMU小鼠中的表达

第二军医大学学报 2005年第3期26卷 275-278页

作者：訾晓渊巴月熊俊张树忠姚玉成张南李建秀王新民马凤云叶煦亭丛文铭胡以平第二军医大学基础医学部细胞生物学教研室上海200433 郑州大学公共卫生学院环境卫生学教研室郑州450052 第二军医大学东方肝胆外科医院病理科上海200438

目的:分析C57-TgN(HBVadr2.0)SMMU'3号'品系转基因小鼠血清和组织中病毒蛋白的表达及其特征.方法:以138只F6～F17代C57-TgN(HBVadr2.0)SMMU'3号'品系的转基因小鼠为研究对象,采用血清ELISA检测和免疫组织化学的方法分... 详细信息

目的:分析C57-TgN(HBVadr2.0)SMMU'3号'品系转基因小鼠血清和组织中病毒蛋白的表达及其特征.方法:以138只F6～F17代C57-TgN(HBVadr2.0)SMMU'3号'品系的转基因小鼠为研究对象,采用血清ELISA检测和免疫组织化学的方法分析病毒蛋白在转基因小鼠中的表达.结果:转基因小鼠血清中HBsAg和HBeAg的阳性率分别为55.18%和25.00%,血清中HBsAg的出现时间多在3个月龄之前(占93.33%),且持续时间在9个月以上(占95.56%),个体之间具有一定差异.转基因小鼠肝组织中至少可检测到一种病毒蛋白,HBsAg、HBcAg和X蛋白的检出率分别为85.82%、58.24%和49.61%.HBsAg分布于肝细胞质中,HBcAg和X蛋白既可分布于肝细胞核中,也可分布干肝细胞质中.HBsAg的表达具有细胞特异性(门管区周围的肝细胞)和组织特异性(肝和肾),X蛋白除在肝脏和肾脏中表达外,还可在脑组织中表达.结论:C57-TgN(HBVadr2.0)SMMU'3号'品系转基因小鼠血清和肝肾等组织中有病毒蛋白的表达,病毒蛋白的分布具有组织细胞特异性和个体差异.

关键词：肝炎病毒乙型小鼠转基因病毒蛋白质类

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克隆化的人骨髓间充质干细胞系的建立及其生物学特性的研究

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第二军医大学学报 2005年第3期26卷 257-262页

作者：陶欣荣李文林苏娟王新民李建秀 Joseph T Lau 胡以平第二军医大学基础医学部细胞生物学教研室 The Department of Molecular and Cellular Biology Roswell Park Cancer InstituteElm and Carlton StreetsBuffaloNY 14263USA

目的:分离人骨髓间充质干细胞(hMSCs),建立克隆化扩增的细胞系并初步鉴定其分化特性和细胞的分子标记.方法:利用间充质干细胞贴壁生长的特性,显微镜下挑取原代单个成纤维样生长单位中的细胞,逐步扩大培养,最终得到克隆化扩增的hMSCs.选... 详细信息

目的:分离人骨髓间充质干细胞(hMSCs),建立克隆化扩增的细胞系并初步鉴定其分化特性和细胞的分子标记.方法:利用间充质干细胞贴壁生长的特性,显微镜下挑取原代单个成纤维样生长单位中的细胞,逐步扩大培养,最终得到克隆化扩增的hMSCs.选择有利于其生长的血清,低密度培养,传70%～80%生长汇合时传代保种.RT-PCR检测其Oct-4、SDF1、CD49a、CK19、c-met基因的表达;流式细胞术检测细胞表面抗原CD34、CD45、CD14、CD44、CD29、CD90、HLA-1和HLADR;体外向骨、软骨、脂肪细胞方向诱导分化鉴定其分化潜能.结果:建立了人骨髓间充质干细胞系并在体外实现了克隆化扩增,该细胞系在体外连续培养达60个细胞倍增时间仍保持多向分化的潜能.细胞不表达CD34、CD45、CD14、HLA-DR,但表达Oct-4、SDF-1、CD49a、CK19、c-met、CD44、CD29、CD90、HLA-1.体外能诱导出骨、软骨、脂肪细胞.结论:得到了一个可稳定传代的克隆化扩增的人骨髓间充质干细胞系,该细胞系在体外可以分化为骨、软骨、脂肪细胞,并表达Oct-4、CK19和c-met.

关键词：间充质干细胞骨髓细胞系克隆细胞分化

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人肝癌细胞系P2-HCC的建立及体外诱导分化特性的初步研究

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第二军医大学学报 2005年第3期26卷 247-250页

作者：朱海英张朵谢东甫王新民周旭宇 Joseph T Lau 胡以平第二军医大学基础医学部细胞生物学教研室第二军医大学长海医院普通外科 The Department of Molecular and Cellular Biology Roswell Park Cancer InstituteElm and Carlton StreetsBuffaloNY 14263USA

目的:从人肝细胞癌中分离肝癌细胞并对其体外诱导分化特性进行分析,试图得到有关导致肝癌发生的“癌干细胞”的相关资料。方法:首先将人原发性肝癌组织小块在裸鼠皮下过继接种,然后将生成的肿瘤进行原代培养并得到单层生长的肿瘤细胞系... 详细信息

目的:从人肝细胞癌中分离肝癌细胞并对其体外诱导分化特性进行分析,试图得到有关导致肝癌发生的“癌干细胞”的相关资料。方法:首先将人原发性肝癌组织小块在裸鼠皮下过继接种,然后将生成的肿瘤进行原代培养并得到单层生长的肿瘤细胞系,利用体外诱导实验对其形态及分子表型的变化情况进行观察和分析。结果:所分离获得的细胞系具有肝肿瘤细胞的特征,但也表达某些干细胞的分子标志如c met。体外诱导分化实验提示胰岛素/氢化可的松、二甲亚砜可能具有诱导该细胞向成熟肝细胞方向分化的作用,诱导后的细胞又重新表达葡萄糖6 磷酸酶,白蛋白表达明显升高。结论:人P2 HCC细胞具有强大的增殖能力,体外实验提示其具有一定的向成熟肝细胞分化的潜能。这些细胞的发生与肝癌干细胞及肝细胞的关系尚待进一步研究。

关键词：癌肝细胞肿瘤细胞,培养的细胞分化

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人胎肝干细胞在重症联合免疫缺陷小鼠损伤肝脏中的植入

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第二军医大学学报 2005年第3期26卷 243-246页

作者：苏娟李文林陶欣荣朱海英王新民李建秀田棣余宏宇 Joseph T Lau 胡以平第二军医大学基础医学部细胞生物学教研室第二军医大学长征医院病理科 The Department of Molecular and Cellular Biology Roswell Park Cancer InstituteElm and Carlton StreetsBuffaloNY 14263USA

目的:从孕4.5～6周的人胚胎肝脏中分离培养肝干细胞,并观察其在重症联合免疫缺陷(SCID)小鼠损伤肝脏中的植入.方法:从孕4.5～6周的人胚胎肝脏中分离干细胞并进行体外长期培养,用RT PCR方法检测肝干细胞相关分子标志以及八聚物结合蛋白4(... 详细信息

目的:从孕4.5～6周的人胚胎肝脏中分离培养肝干细胞,并观察其在重症联合免疫缺陷(SCID)小鼠损伤肝脏中的植入.方法:从孕4.5～6周的人胚胎肝脏中分离干细胞并进行体外长期培养,用RT PCR方法检测肝干细胞相关分子标志以及八聚物结合蛋白4(Oct-4)的表达,然后植入经四氯化碳(CCl4)造成急性肝损伤的SCID小鼠体内,在移植后2、l0、17d分别对受体鼠肝脏冰冻切片进行荧光观察和H-E染色.结果:所建立的胎肝细胞系不仅表达二肽水解酶Ⅳ(DPPⅣ)、白蛋白(Alb)、细胞角蛋白(CK)19、γ-谷氨酰转肽酶(γ-GT)、CK18、肝细胞生长因子受体(c-met)、干细胞因子受体(c-kit)等肝干细胞相关标志,还表达干细胞转录因子Oct-4.在细胞移植后2 d,肝脏冰冻切片未见绿色荧光;移植后10 d和17d肝脏冰冻切片见散在的绿色荧光.对同一切片做H-E染色,发现绿色荧光部位为肝板内的多个成熟肝细胞.结论:从人胚胎肝脏中分离的干细胞能够植入SCID小鼠的损伤肝脏.

关键词：肝干细胞胚胎重症联合免疫缺陷细胞移植

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表达红色荧光蛋白DsRed报告基因的逆转录病毒载体的构建和在肝干细胞体内示踪中的应用

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第二军医大学学报 2005年第3期26卷 240-242页

作者：李文林苏娟陶欣荣 Joseph T Lau 胡以平第二军医大学基础医学部细胞生物学教研室 The Department of Molecular and Cellular Biology Roswell Park Cancer InstituteElm and Carlton StreetsBuffaloNY 14263USA

目的:建立表达红色荧光蛋白DsRed的逆转录病毒载体,并对肝原始细胞进行体外标记和体内示踪研究。方法:将pDsRed1 1载体中的DsRed片段克隆到逆转录病毒载体pLNCG C1中构建了pLNCG DsRed载体。将该载体导入Phoenix包装细胞,进而采用乒乓... 详细信息

目的:建立表达红色荧光蛋白DsRed的逆转录病毒载体,并对肝原始细胞进行体外标记和体内示踪研究。方法:将pDsRed1 1载体中的DsRed片段克隆到逆转录病毒载体pLNCG C1中构建了pLNCG DsRed载体。将该载体导入Phoenix包装细胞,进而采用乒乓转染的方法感染包装细胞PT67,获得高滴度稳定产毒的PT67 细胞系。结果:利用PT67 细胞系产生的病毒上清可以高效的感染体外培养的肝原始细胞系。将这些DsRed标记的肝原始细胞移植到小鼠损伤肝脏中,4周后可以在再生肝脏中清晰地观察到具有红色荧光的外源细胞。结论:由于肝脏组织没有红色自发荧光,用DsRed标记肝原始细胞进行肝内示踪时背景干扰小。

关键词：红色荧光蛋白基因.报告逆转录病毒载体肝干细胞

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白蛋白/细胞角蛋白19启动子调控的红绿双色荧光蛋白报告载体的构建及其在肝干细胞分化研究中的应用

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第二军医大学学报 2005年第3期26卷 237-239页

目的:利用报告基因监测肝干细胞的分化走向。方法:通过PCR从小鼠基因组中克隆了细胞角蛋白19 启动子片段,构建了细胞角蛋白19启动子调控的绿色荧光蛋白(pCK19 EGFP)和白蛋白启动子调控的红色荧光蛋白报告载体(pAlbD sRed),并利用报告载... 详细信息

目的:利用报告基因监测肝干细胞的分化走向。方法:通过PCR从小鼠基因组中克隆了细胞角蛋白19 启动子片段,构建了细胞角蛋白19启动子调控的绿色荧光蛋白(pCK19 EGFP)和白蛋白启动子调控的红色荧光蛋白报告载体(pAlbD sRed),并利用报告载体标记的肝干细胞(liver epithelial progenitor cells,LEPCs)观察了悬浮培养时LEPCs的分化去向。结果:白蛋白/细胞角蛋白19启动子调控的红绿双色荧光蛋白报告载体可以实时地显示肝原始细胞在不同的诱导环境下的分化走向。结论:双色荧光蛋白报告载体的成功构建为研究LEPCs的分化、筛选可诱导LEPCs定向分化的分子提供了便捷的工具。

关键词：肝干细胞细胞分化白蛋白细胞角蛋白19 启动子红色荧光蛋白绿色荧光蛋白基因.报告

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小鼠单纯肝切除后再生肝组织内大小核分裂相和卵圆细胞的观察

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第二军医大学学报 2005年第3期26卷 251-256页

作者：余宏宇李文林谢东甫张朵肖承志孙志勇何金孙静苏娟李建秀朱明华 Joseph T Lau 胡以平第二军医大学长征医院病理科第二军医大学基础医学部细胞生物学教研室西藏军区总医院神经烧伤科第二军医大学长海医院病理科 The Department of Molecular and Cellular Biology Roswell Park Cancer InstituteElm and Carlton StreetsBuffaloNY 14263USA

目的:探究C57小鼠单纯2/3肝切除后肝组织内与再生和肝干细胞有关的病理形态学变化及其意义。方法:在4个对照组(正常组、假手术组、倒千里光碱组和倒千里光碱2/3肝切除组)的参照下,观察实验组C57小鼠单纯2/3肝切除后不同时间肝脏病理形... 详细信息

目的:探究C57小鼠单纯2/3肝切除后肝组织内与再生和肝干细胞有关的病理形态学变化及其意义。方法:在4个对照组(正常组、假手术组、倒千里光碱组和倒千里光碱2/3肝切除组)的参照下,观察实验组C57小鼠单纯2/3肝切除后不同时间肝脏病理形态变化(核分裂相和卵圆细胞等)和CK19、AFP免疫组化检测情况。结果:单纯2/3肝切除后小鼠均出现不同程度的成熟肝细胞通过大核分裂相分裂增生、轻重不等的小胆管/终末胆管增生反应和个别例中有类似于倒千里光碱肝切除模型组的卵圆细胞增生;尤其还有大小核分裂相分布等一些文献未提及的形态学改变。结论:本研究提出肝流域假说的初步设想:肝内成体干细胞存在于小胆管/终末胆管附近,是肝主质细胞的重要源头;在其向中央静脉方向的流向上产生各级分化程度不同的子代(自卵圆细胞到小肝细胞、成熟肝细胞),沿肝板形成该流域干流;而经由血流到达肝脏的过客性干细胞可不同程度地在不同区段作为该流域的支流汇入干流并转分化为肝系细胞。

关键词：肝切除术肝再生干细胞肝大小核分裂相卵圆细胞

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克隆化的人骨髓间充质干细胞在SCID小鼠肝脏中的植入、增殖和分化

克隆化的人骨髓间充质干细胞在SCID小鼠肝脏中的植入、增殖和分化

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中国细胞生物学学会2005年学术大会、青年学术研讨会

作者：陶欣荣李文林苏娟王新民李建秀胡以平第二军医大学基础医学部细胞生物学教研室第二军医大学基础医学部细胞生物学教研室第二军医大学基础医学部细胞生物学教研室第二军医大学基础医学部细胞生物学教研室第二军医大学基础医学部细胞生物学教研室第二军医大学基础医学部细胞生物学教研室

目的:研究体外长期培养的克隆化的人骨髓间充质干细胞(hMSCs)在SCID小鼠肝中的植入、增殖和分化。方法:将标记上绿色荧光蛋白的克隆化的人骨髓间充质干细胞经脾脏注射到CCl4损伤的SCID小鼠肝脏中,荧光显微镜和激光共聚焦显微镜下观察植... 详细信息

目的:研究体外长期培养的克隆化的人骨髓间充质干细胞(hMSCs)在SCID小鼠肝中的植入、增殖和分化。方法:将标记上绿色荧光蛋白的克隆化的人骨髓间充质干细胞经脾脏注射到CCl4损伤的SCID小鼠肝脏中,荧光显微镜和激光共聚焦显微镜下观察植入细胞后2周、5周、8周的小鼠肝脏冰冻切片,按观察到的每个绿色细胞簇含有的细胞个数,来显示增殖细胞所占有的比例。利用绿色荧光蛋白与间接免疫荧光双重标记的方法来追踪肝脏组织中植入的hMSCs分化命运,激光共聚焦显微镜下共定位双重标记的植入细胞。结果:植入的人骨髓间充质干细胞在SCID小鼠脑中可以长期存活达8周(冰冻切片检测到8周),形态上有明显的改变,为肝细胞样的细胞。在中央静脉四周和门管区都发现有绿色荧光标记的细胞簇,统计结果表明,植入2w时大部分存活的植入细胞在SCID小鼠肝脏中已经增殖。间接免疫荧光组织化学检测结果显示外源移植的hMSCs细胞,在 CCl4损伤SCID小鼠肝内,还表达自蛋白和α1-抗胰蛋白酶。结论:hMSCs在损伤的肝脏中不仅可以长期存活、增殖,而且能分化为成熟的肝细胞。由于hMSCs在体外长期培养、扩增后仍具有多向分化的潜能,因此显示了hMSCs成为肝功能衰竭、肝脏代谢性疾病细胞治疗的种子细胞的可能性。本研究结果还为hMSCs参与损伤肝重建与修复治疗的研究奠定了基础。

关键词：人骨髓间充质干细胞小鼠肝脏克隆化增殖和分化

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克隆化的人骨髓间充质干细胞在新生小鼠脑中的植入、迁移和分化

克隆化的人骨髓间充质干细胞在新生小鼠脑中的植入、迁移和分化

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中国细胞生物学学会2005年学术大会、青年学术研讨会

目的:研究体外长期培养的克隆化的人骨髓间充质干细胞(hMSCs)在新生小鼠脑中的植入、迁移和分化。方法:将标记上绿色荧光蛋白的克隆化的人骨髓间充质干细胞直接注射到新生3天小鼠的单侧脑室中,荧光显微镜和激光共聚焦显微镜下观察植入... 详细信息

目的:研究体外长期培养的克隆化的人骨髓间充质干细胞(hMSCs)在新生小鼠脑中的植入、迁移和分化。方法:将标记上绿色荧光蛋白的克隆化的人骨髓间充质干细胞直接注射到新生3天小鼠的单侧脑室中,荧光显微镜和激光共聚焦显微镜下观察植入细胞后0天、9天、14天的小鼠脑冠状切片,利用绿色荧光蛋白与间接免疫荧光双重标记的方法来追踪脑组织中植入的hMSCs分化命运, 激光共聚焦显微镜下共定位双重标记的植入细胞。结果:植入的人骨髓间充质干细胞在新生小鼠的脑中可以存活,形态上有明显的改变,为神经元样的细胞。有些植入的细胞从注射部位还向脑组织的其它部位(纹状体、海马、皮层,甚至注射部位的对侧)发生了迁移。间接免疫荧光组织化学检测结果显示,植入的细胞大部分表达神经元特异性的β-TublinⅢ、MAP2、Tau标记蛋白,少部分细胞表达神经胶质细胞特异的GFAP。结论:hMSCs植入后受到脑组织特定的微环境影响,在体内可以分化为神经元细胞和神经胶质细胞。以上结果还提示骨髓间充质干细胞有可能成为中枢神经系统疾病治疗的种子细胞。

关键词：人骨髓间充质干细胞新生小鼠克隆化

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乙型肝炎病毒全基因组转基因小鼠的生物学特性

乙型肝炎病毒全基因组转基因小鼠的生物学特性

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中国细胞生物学学会2005年学术大会、青年学术研讨会

本研究利用我们实验室建立并优选的乙肝全基因组转基因小鼠C57-TgN(HBVadr2．0)SMMU“3 号”品系为实验对象,从DNA、RNA、蛋白质、病毒学、病理学角度,综合研究了该品系转基因小鼠的生物学特性。基因组DNA PCR、Southern blotting和DNA... 详细信息

本研究利用我们实验室建立并优选的乙肝全基因组转基因小鼠C57-TgN(HBVadr2．0)SMMU“3 号”品系为实验对象,从DNA、RNA、蛋白质、病毒学、病理学角度,综合研究了该品系转基因小鼠的生物学特性。基因组DNA PCR、Southern blotting和DNA测序分析表明,adr亚型的乙型肝炎病毒全基因组转基因已稳定的整合在转基因小鼠的基因组中,并能通过生殖系以孟德尔遗传方式在世代间稳定遗传。RT-PCR和real-time RT-PCR分析表明转基因小鼠中整合的HBV基因能够转录出病毒的所有mRNAs。肝组织免疫组织化学分析显示,转基因小鼠肝细胞中表达HBsAg、HBcAg和 X蛋白三种病毒蛋白,三种病毒蛋白的检出率分别为: 85．82％(HBsAg)、58．25％(HBcAg)和 49．61％(X蛋白)。血清ELISA和Western blotting分析发现,转基因小鼠肝细胞中表达的病毒蛋白可分泌入血,小鼠血清中HBsAg和HBeAg的检出率分别为:55．20％和25．00％。对小鼠血清DNA进行PCR和real-time PCR分析发现,转基因小鼠血清中存在HBV DNA,其含量达到临床患者阳性标准,表明转基因小鼠中整合的HBV基因组DNA可复制包装成病毒颗粒并分泌入血。肝组织H-E染色分析发现,部分转基因小鼠肝组织中出现了不同程度的肝细胞变性(45．52％)、肝细胞坏死区和汇管区数量不等的单个核细胞浸润(47．01％)。浸银染色分析发现,29．10％(39／134)的转基因小鼠肝组织出现了纤维组织增生,特别是单个核细胞浸润处。透射电镜分析发现,转基因小鼠肝脏组织发生了超微病理损伤,主要有:线粒体肿胀、线粒体嵴消失、内质网扩张、髓样体结构形成、胶原纤维增生。这些结果表明,转基因小鼠发生了与人类慢性HBV无症状携带者相似的肝组织病理性损伤, 总体为轻度慢性肝炎。

关键词： HBV 肝组织乙型肝炎病毒全基因组生物学特性

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