一、研究背景及目的肝细胞癌(HCC)是世界上最常见的恶性肿瘤之一。目前的治疗措施主要有手术切除、化疗和肝移植等。但是由于HCC较高的肝外转移和术后复发率,5年生存时间依然较低。尽管科学家们在肝癌的研究领域付出了艰辛的努力也取得了很多的成果,但HCC发生发展的分子机制目前仍不明确。JAK激酶是非受体酪氨酸激酶家族中的一员,包括JAK1,JAK2,JAK3和TYK2。能够在各种细胞因子和生长因素作用下激活STAT(signal transducer and activator of transcription)蛋白。JAK1/STAT信号通路在正常的细胞中被严格监控。但在癌细胞中它会被JAK家族激酶或其他的酪氨酸激酶持续激活。在所有的JAK1/STAT家族中,JAK1/STAT3起着很重要的生物学作用,如细胞的增长、凋亡、迁移和入侵。在不同类型的肿瘤,比如HCC、头颈部肿瘤、乳腺癌、肺癌等中STAT3都会被异常激活。最近的研究表明,持续激活JAK1/STAT3与肿瘤发生和癌症进展相关。所以JAK1/STAT3信号通路有望成为治疗癌症的新途径。Micro RNA(miRNA)是一种大小约21~25个碱基的非编码小RNA。近来研究表明,miRNA通过抑制特定的癌基因或抑癌基因,在肿瘤发生发展中起着重要的作用。miRNA通过靶向癌基因或抑癌基因发挥类似肿瘤抑制因子的作用,参与肿瘤的转化、生长、血管生成及EMT等多种过程。越来越多的证据表明miRNA表达失调与肿瘤的发生发展密切相关。miR-340在多种肿瘤中表达下调。然而,miR-340抑制肝细胞癌的作用机理尚不清楚。我们探讨miR-340在肝癌侵袭转移中的调节作用及其分子机制,为寻找新的肝癌治疗靶点提供理论依据。二、材料与方法1.细胞培养人类HCC细胞系(SK-Hep-1,Hep G2,HCCLM3和MHCC97-H)、人类肝细胞系L02购自中科院(上海)。用含有10%胎牛血清的DMEM高糖培养基在37℃,5%CO2孵箱中常规培养细胞。2.病人和组织标本从本院手术室获取32例手术切除的HCC肿瘤及癌旁组织标本。所有病人在手术前未进行过放疗或化疗等治疗。经过了所有病人或家属的知情同意并于术前签署了知情同意书。该研究经过了伦理委员会批准。3.质粒构建细胞转染miR-340 mimics,antagomir-340及其阴性对照购自广州市锐博生物科技有限公司。过表达miR-340的慢病毒和阴性对照购自上海吉玛制药技术有限公司。通过PCR扩增JAK1的野生型3'-UTR,其含有miR-340结合位点。在miR-340结合位点序列中产生突变。将PCR产物插入p GL3-对照荧光素酶载体(Promega)中。对于JAK1过表达,将JAK1的开放阅读框插入pc DNA3.1载体中。使用Lipofectamine2000 Reagent(Invitrogen)根据制造商的方案进行转染。***提取和q RT-PCR使用mir VANA RNA分离试剂盒根据制造商的方案从细胞系和冷冻的肿瘤样品提取总RNA。使用Prime Script RT试剂盒(Ta Ka Ra)进行互补DNA合成。在ABI 7900系统(Applied Biosystems,Carlsbad,CA)中用SYBR green Premix Ex Taq II(Ta Ka Ra)进行q RT-PCR。β-actin或U6用作内源对照。根据2-△△CT方法计算靶基因的相对表达水平。***和克隆形成实验通过MTT测定评估细胞活力。将细胞以4×103个细胞/孔的密度接种在96孔板中,并在转染后培养1,2,3和4天。将体积为100μl的MTT(0.5mg/ml,Invitrogen)加入96孔板的每个孔中,并将细胞在37℃下再温育4小时,随后除去上清液,并加入150μl的二甲基亚砜(Sigma,***,MO)。使用酶标仪(Thermo Fisher Scientific,Rockford,IL)测量490nm处的吸光度。对于克隆形成测定,将转染的细胞以每孔1000个细胞的密度在6孔板中培养并生长12天。用甲醇固定后,用0.1%结晶紫染色菌落15分钟并洗涤。在光学显微镜下计数菌落数。6.侵袭实验使用涂有Matrigel胶(BD Biosciences,San Jose,CA)的24孔Transwell室检测细胞的侵袭能力。将总共1×104个转染的细胞在无血清培养基中接种在上室中。下室充满含有10%FBS的DMEM作为化学引诱物。孵育48小时后,将粘附在膜下侧的细胞固定,染色并使用显微镜计数。7.划痕实验将转染的细胞在24孔板中培养。用200μL移液管尖端刮擦细胞层,观察愈合过程。在划伤后一定时间测量划痕宽度,以评估细胞的迁移能力。8
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