目的氮芥与芥子气同属糜烂性毒剂,是一种难防难治的化学毒剂。氮芥最先作为化学战剂被开发出来,后陆续应用于淋巴瘤、白癜风、肾病综合征等疾病的治疗。氮芥的毒理机制尚不完全清楚,深入且清晰的呈现氮芥在组织和细胞中的分布,明确其直接作用靶点,对于氮芥的毒性机制和抗毒药物研究有极大的推动作用。材料和方法基于活性的蛋白质分析技术(Activity-based protein profiling,ABPP)是一种以化合物为中心的靶点鉴定方法。ABPP主要基于2022年诺贝尔化学奖"生物正交化学和点击化学"。结果1)通过化学法合成三个带有炔基的氮芥衍生物HNP-1、HNP-2、HNP-3,筛选出毒性变化最小的HNP-1。将HNP-1与细胞共孵育或涂抹于小鼠皮肤表面后,通过Click反应可发现:氮芥可以广泛结合到胞浆和细胞核中,且细胞核中荧光强度显著强于细胞核外,但在小鼠皮肤染毒的情况下,小鼠表皮细胞核中几乎无荧光信号。2)进一步开展实验鉴定芥类毒剂在人皮肤组织中高活性蛋白。通过与华山医院皮肤科合作,收集了12例人皮肤样本,将人皮肤组织匀浆后与不同浓度氮芥活性探针HNP-1共孵育。根据荧光胶实验结果可知,标记强度随着毒剂浓度增大而增大,根据荧光条带与考马斯亮蓝条带对比,有一定的选择性,说明毒剂可以特异性地标记蛋白质,其中在40～50、70kDa附近标记效果明显。以Abundance Ratio:medium/low、Abundance Ratio:high/low小于2和P-value小于0.05作为筛选标准进行筛选,鉴定出与芥类毒剂结合活性高的蛋白质69个(图8),包括线粒体相关蛋白ABAT、CARS2、CYC1、SLC25A13等10个,免疫调节相关蛋白CD39、CD45、CD248、DPP7、HLA-E等8个蛋白。结论通过本研究明确了氮芥在小鼠和人皮肤组织中的分布情况,较为全面的阐明了与氮芥结合活性较高的皮肤蛋白,对后续皮肤毒理机制研究有较大的推动作用。
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